1,3,7,9?四甲基尿酸的制備方法與流程

本發明涉及中藥有效成分提取分離工藝領域，特別是涉及一種1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法。

背景技術：

1,3,7,9-四甲基尿酸(TC)，其結構式如式(I)所示，是天然存在的嘌呤類生物堿，主要存在于苦茶中，具有抗抑郁、鎮靜催眠和抗炎鎮痛等藥理作用。由于1,3,7,9-四甲基尿酸在苦茶中的含量少，因此，如何對其進行高得率的制備受到廣泛關注。

目前，用于分離1,3,7,9-四甲基尿酸的方法大多為大孔樹脂柱層析、正相柱層析及反相柱層析聯用。由于大孔樹脂柱層析、正相柱層析及反相柱層析方法制備樣品得率低、制備量小，無法進行規模化的制備，且污染大、耗時長、成本高。另外在制備過程中需使用到大量的吸附填料，由此容易導致樣品原有的生物活性大打折扣，使制備得到的1,3,7,9-四甲基尿酸活性降低，生產效益低下，不適合推廣使用。

技術實現要素：

基于此，本發明在于克服現有技術的缺陷，提供一種1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，利用該制備方法制備出的1,3,7,9-四甲基尿酸純度高，單次制備量大，得率高，并對樣品活性無影響，也無外加污染。制備得到的1,3,7,9-四甲基尿酸可用于藥品，化妝品，保健品等。

其技術方案如下：

一種1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，包括如下步驟：

S1、取苦茶提取物作為待分離樣品；配制體積比為(0.5～1.5)：(0.5～2)：(1～6)的乙酸乙酯、正丁醇和水的溶劑體系，所述溶劑體系包括上層和下層，在所述上層中添加8～12mmol/L的三乙胺作為固定相，在所述下層中添加8～15mmol/L的鹽酸作為流動相，取適量所述流動相溶解所述待分離樣品，得待分離溶液；

S2、將所述溶劑體系泵入高速逆流色譜的色譜柱中，將所述待分離溶液泵入高速逆流色譜進行洗脫分離，并根據記錄儀得到的逆流色譜圖譜判定流份中是否含有1,3,7,9-四甲基尿酸，并收集含有1,3,7,9-四甲基尿酸的流份，干燥得到1,3,7,9-四甲基尿酸。

本發明1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，通過高速逆流色譜對苦茶提取物進行分離提純，并合理對高速逆流色譜采用的固定相和流動相溶劑體系進行控制，使待分離樣品中的1,3,7,9-四甲基尿酸和其余物質可以在固定相和流動相之間獲得較佳的分配比例，由此有效提高制得的1,3,7,9-四甲基尿酸的純度，且得率高。

同時，由于高速逆流色譜不需要固體支撐體，1,3,7,9-四甲基尿酸的分離僅依據其在固定相、流動相中分配系數的不同就可實現，無需大量使用吸附填料，因而避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，不僅使1,3,7,9-四甲基尿酸能夠充分回收，回收的1,3,7,9-四甲基尿酸更能保持其本來的特性，且由于待分離樣品與液態固定相之間能夠充分接觸，使得樣品的制備量大大提高。

在其中一個實施例中，步驟S1中，所述溶劑體系為體積比為1:1.5:3的乙酸乙酯、正丁醇和水。

在其中一個實施例中，步驟S1中，所述固定相中三乙胺的加入量為9～11mmol/L；所述流動相中鹽酸的加入量為9～11mmol/L。

在其中一個實施例中，所述固定相的保留值為70～80％。

在其中一個實施例中，步驟S2中，所述高速逆流色譜的參數設置如下：

轉速為300～500rpm，分離溫度為15～30℃，檢測波長為240～260nm，流動相的流速為5～20mL/min。

在其中一個實施例中，所述流動相的流速為6～10mL/min。

在其中一個實施例中，所述分離溫度為17～23℃。

在其中一個實施例中，所述轉速為400～500rpm。

在其中一個實施例中，所述檢測波長為254nm。

在其中一個實施例中，所述色譜柱的體積為1000mL。

在其中一個實施例中，步驟S2中所述固定相和流動相泵入色譜柱的過程為：所述固定相于儀器靜態泵入高速逆流色譜柱中，所述流動相于儀器靜態泵入色譜柱中。

在其中一個實施例中，步驟S2中所述待分離溶液在固定相、流動相平衡后被泵入色譜柱中。

在其中一個實施例中，單次通過單根色譜柱的待分離樣品為10～15g。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

本發明的1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，經高速逆流色譜儀分離提純制備1,3,7,9-四甲基尿酸，該制備方法耗時短，制得的1,3,7,9-四甲基尿酸純度高、得率高，單次制備量大，可進行規模化的制備且成本低；該采用高速逆流色譜分離的方法因未大量使用吸附填料，對樣品活性影響較小，保留了原有的生物活性；制備出的產品也無外加污染，可用于藥品，化妝品，保健品等。

附圖說明

圖1為本發明一實施例的1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法流程圖；

圖2為實施例1中記錄儀記錄的高速逆流色譜分離1,3,7,9-四甲基尿酸的逆流色譜圖譜。

具體實施方式

為使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及具體實施方式，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用以解釋本發明，并不限定本發明的保護范圍。

如圖1為1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法流程圖。以下各實施例所用原料均為普通市售產品，其中，苦茶提取物的規格優選為1,3,7,9-四甲基尿酸的質量占比不低于5％。

實施例1

本實施例一種1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，包括如下步驟：

S1、取苦茶提取物11.9g作為待分離樣品；配制體積比為1:1.5:3的乙酸乙酯、正丁醇和水的溶劑體系，所述溶劑體系包括上層和下層，在所述上層中添加10mmol/L的三乙胺作為固定相，在所述下層中添加10mmol/L的鹽酸作為流動相，取120mL所述流動相溶解所述待分離樣品，得待分離溶液；

S2、將所述固定相和流動相泵入高速逆流色譜的色譜柱中，首端進，尾端出；待平衡后，將所述待分離溶液泵入高速逆流色譜進行洗脫分離，并根據記錄儀得到的逆流色譜圖譜判定流份中是否含有1,3,7,9-四甲基尿酸(出現圖2所示圖譜說明流份中含有1,3,7,9-四甲基尿酸)，收集含有1,3,7,9-四甲基尿酸的流份，減壓回收得到1,3,7,9-四甲基尿酸(經與1,3,7,9-四甲基尿酸的核磁數據對比，證明結構一致)；其中，所述高速逆流色譜的參數設置如下：主機順時針轉動，轉速為450rpm，分離溫度為17～23℃，檢測波長為254nm，流動相的流速為8mL/min，色譜柱體積為1000mL。

實施例2

本實施例本實施例一種1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，步驟類似實施例1，區別在于：步驟S2中的溶劑體系為積比為1.5：0.5：1的乙酸乙酯、正丁醇和水。

實施例3

本實施例本實施例一種1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，步驟類似實施例1，區別在于：步驟S2中的溶劑體系為積比為0.5：2：6的乙酸乙酯、正丁醇和水。

實施例4

本實施例本實施例一種1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，步驟類似實施例1，區別在于：步驟S2中的轉速為500rpm。

實施例5

本實施例本實施例一種1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，步驟類似實施例1，區別在于：步驟S2中的轉速為300rpm。

實施例6

本實施例本實施例一種1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，步驟類似實施例1，區別在于：步驟S2中的流速為5mL/min。

實施例7

本實施例本實施例一種1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，步驟類似實施例1，區別在于：步驟S2中的流速為20mL/min。

對比例1

本對比例一種1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，步驟類似實施例1，區別在于：步驟S1中的溶劑體系為體積比為1:1.5:3的乙酸乙酯、甲醇和水。

對比例2

本對比例一種1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法，步驟類似實施例1，區別在于：步驟S1中的溶劑體系為體積比為1:5:3的乙酸乙酯、正丁醇和水。

以上各實施例和對比例制備得到的待分離樣品質量、1,3,7,9-四甲基尿酸質量、固定相保留值及1,3,7,9-四甲基尿酸的純度見表1。

表1

以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。