鹿流行性出血病病毒實時熒光RT?PCR檢測試劑盒的制作方法

本實用新型屬于生物檢測
技術領域：
，具體涉及一種病毒實時檢測試劑盒。
背景技術：
：鹿流行性出血病(Epizootichemorrhagicdiseaseofdeer，EHD)是一種季節性非接觸性的病毒性傳染病，由鹿流行性出血病病毒(Epizootichemorrhagicdiseasevirusofdeer，EHDV)引起的，以引起鹿體溫升高、黏膜和漿膜面廣泛出血并常處于昏迷狀態下死亡為特征的嚴重致死性傳染病。在自然條件下，EHDV可引起牛、綿羊等家畜及白尾鹿、糜、大角羚羊等多種馴養和野生反芻動物感染，嚴重影響著許多國家的畜牧業和國際貿易的發展。EHD是重要的蟲媒病之一，庫蠓是主要的傳播媒介。世界動物衛生組織將EHD列為法定報告傳染病。PCR(聚合酶鏈式反應)技術已廣泛應用于動物疫病檢測，該技術主要是基于病原微生物核酸的特異性，針對靶標設計特異性引物對DNA或RNA片段進行指數擴增。實時熒光PCR技術由傳統PCR技術發展而來，實時熒光PCR在反應體系中加入標記熒光基團的探針，在PCR指數擴增期間通過連續監測熒光信號出現的先后順序來即時分析DNA或RNA樣本的拷貝數。實時熒光PCR與傳統PCR法相比，一方面加入的TaqMan探針在反應中只與模板的特異序列結合，不進行延伸，減少錯配，提高檢測準確性和特異性；另一方面實時熒光PCR在封閉的體系中進行擴增和實時檢測，無需電泳就可以對結果進行分析，避免了傳統PCR產物的污染，自動化程度高，重復性好，檢測周期短，廣泛應用于科研和臨床檢測。因此，應用熒光PCR技術建立鹿流行性出血病病毒檢測方法對于快速、準確的檢測鹿流行性出血病具有重要的意義。技術實現要素：本實用新型目的在于提供一種鹿流行性出血病病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，該檢測試劑盒能夠快速、準確、有效地檢測鹿流行性出血病病毒。本實用新型所提供的鹿流行性出血病病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，包括盒體1、海綿墊2，所述海綿墊2上設有5×RT-PCR反應液容器孔3，內設有5×RT-PCR反應液；酶混合液容器孔4，內設酶混合液；正反向引物容器孔5，內設正反向引物；探針容器孔6，內設探針；陽性對照品孔7，內設陽性對照品；陰性對照品孔8，內設陰性對照品；無核酸酶水容器孔9，內設無核酸酶水。所述實時熒光RT-PCR正反向引物和探針分別為：正向引物：5’-CCTTTGTGGCATGGACTACGA-3’；反向引物：5’-AATGGGCGGTATATTGTTTGG-3’；探針：5’-FAM-CTGCGATTCTTAACA-TAMRA-3’。所述探針的5’端熒光報告基團是FAM，3’端標記的是熒光淬滅基團TAMRA，擴增目的片段長度為69bp。本檢測試劑盒于-18℃以下保存。本實用新型試劑盒使用方法：每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照。實時熒光RT-PCR25μL反應體系：5×RT-PCR反應液5μL，正反向引物2μL，熒光探針1μL，模板5μL，用無核酸酶水補足25μL。陽性對照和陰性對照用量同模板為5μL。實時熒光PCR反應條件：50℃30分鐘，1個循環；95℃15分鐘，1個循環；95℃3分鐘，1個循環；95℃15秒→60℃1分鐘，40個循環。本實用新型試劑盒質量控制：陰性對照無熒光對數增長，未檢測到Ct值或相應的Ct值＞38.0；陽性對照有熒光對數增長，且熒光通道出現典型的擴增曲線，相應的Ct值＜35.0。上述條件有一條不滿足時，實驗視為無效。本實用新型試劑盒結果判斷：Ct值＞38.00判定為陰性，Ct值≤35.00判定為陽性，Ct值在35.00～38.00則判為可疑，需重新檢測，若仍為可疑，則可判為陽性。本實用新型鹿流行性出血病病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒根據EHDV群特異性結構蛋白VP7基因cDNA為靶序列設計引物和探針，為鹿流行性出血病病毒檢測提供一種特異性強，敏感性高，快速、準確的檢測試劑盒。附圖說明圖1：本實用新型鹿流行性出血病病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒結構示意圖。圖2：鹿流行性出血病病毒實時熒光RT-PCR敏感性測定擴增曲線。具體實施方式下面結合實施例和附圖對本實用新型做進一步詳細、完整地說明，所舉實例只用于解釋本實用新型，并非用于限定本實用新型的范圍。實施例1本實用新型試劑盒的結構如圖1所示，包括盒體1、海綿墊2，所述海綿墊2上設有5×RT-PCR反應液容器孔3，內設有5×RT-PCR反應液；酶混合液容器孔4，內設酶混合液；正反向引物容器孔5，內設正反向引物；探針容器孔6，內設探針；陽性對照品孔7，內設陽性對照品；陰性對照品孔8，內設陰性對照品；無核酸酶水容器孔9，內設無核酸酶水。實時熒光RT-PCR正反向引物和探針分別為：正向引物：5’-CCTTTGTGGCATGGACTACGA-3’；反向引物：5’-AATGGGCGGTATATTGTTTGG-3’；探針：5’-FAM-CTGCGATTCTTAACA-TAMRA-3’。所述探針的5’端熒光報告基團是FAM，3’端標記的是熒光淬滅基團TAMRA，擴增目的片段長度為69bp。本檢測試劑盒于-18℃以下保存。本實用新型試劑盒使用方法：每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照。實時熒光RT-PCR25μL反應體系：5×RT-PCR反應液5μL，正反向引物2μL，熒光探針1μL，模板5μL，用無核酸酶水補足25μL。陽性對照和陰性對照用量同模板為5μL。實時熒光PCR反應條件：50℃30分鐘，1個循環；95℃15分鐘，1個循環；95℃3分鐘，1個循環；95℃15秒→60℃1分鐘，40個循環。質量控制要求：陰性對照無熒光對數增長，未檢測到Ct值或相應的Ct值＞38.0；陽性對照有熒光對數增長，且熒光通道出現典型的擴增曲線，相應的Ct值＜35.0。上述條件有一條不滿足時，實驗視為無效。本實用新型試劑盒結果判斷：Ct值＞38.00判定為陰性，Ct值≤35.00判定為陽性，Ct值在35.00～38.00則判為可疑，需重新檢測，若仍為可疑，則可判為陽性。實施例2.：鹿流行性出血病病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒靈敏度測定。用質粒純化試劑盒從宿主菌中提取攜帶EHDV-VP7基因的重組質粒pBAD-EHDV-VP7，用蛋白核酸測定儀測定提取的pBAD-EHDV-VP7的濃度，制備10×系列稀釋(100～106)的模板，按照實施例1的方法進行實時熒光RT-PCR檢測，從圖2可知，8個稀釋度均出現典型的擴增曲線，指數區明顯，都檢測到了Ct值，說明本實用新型試劑盒能檢測到少至1個拷貝的模板，具有很高的靈敏度。實施例3：鹿流行性出血病病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒特異性測定。采用鹿流行性出血病病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒對EHDV-1、2、4、7型和藍舌病病毒(BTV1-24型)、赤羽病病毒(AKV)、水泡性口炎病毒(VSV)細胞培養病毒進行檢測，結果EHDV各血清型標準毒株均呈陽性擴增曲線，而BTV1-24型、AKV、VSV為陰性，結果見表1。說明本實用新型試劑盒可有效檢出不同血清型EHDV，與親緣關系最近的BTV無交叉反應，特異性好。表1實時熒光RT-PCR特異性測定病毒種類檢測結果BTV1-24型陰性AKV陰性EHDV-1陽性EHDV-2陽性EHDV-4陽性EHDV-7陽性VSV陰性當前第1頁1 2 3