一種支原體污染的處理方法與流程

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種支原體污染的處理方法。

背景技術：

在細胞培養技術是一種體外增殖細胞的常規實驗技術，目前被廣泛用于教學、科研和臨床實驗。污染控制是細胞培養能否成功的關鍵所在。引起培養細胞污染的微生物有細菌、霉菌、黑膠蟲、支原體等，其中支原體是常見的污染物。

支原體在體型上比細菌和真菌小，一般的光學顯微鏡并不能觀察到其存在，且受到支原體污染的細胞有相當一部分仍然可以生長增殖，因此支原體污染相較于細菌和真菌的污染并不容易發現。被支原體污染的細胞，不可避免的會在細胞代謝和功能發生改變，從而影響利用污染細胞進行實驗的結果，同時也是生物制品的一個安全隱患。

目前，培養的細胞一旦發生支原體污染，大多的解決方式是滅活后丟棄，但是如果細胞是非常珍貴無法替代的，這種方法就不能使用了。

技術實現要素：

鑒于上述問題，本發明提出了一種支原體污染的處理方法實現在不滅活后丟棄的前提下清除支原體污染的目的，本發明采用如下技術方案：

提供一種支原體污染的處理方法，包括以下步驟：

(1)獲取待處理的細胞；

(2)用含10ug/mL環丙沙星的培養基培養所述待處理的細胞；

(3)定時更新所述培養基，并且使所述待處理的細胞的生長密度保持在50％-80％；

(4)檢測不到支原體污染的情況之后停止使用所述培養基。

優選地，所述定時更新所述培養基的方法采用如下任意一種：

每隔固定天數更新所述培養基；

每當所述細胞的生長密度達到所述第一預設密度時，更新所述培養基。

優選地，所述第一預設密度為75％-85％。

優選地，所述使所述細胞生長密度保持在50％-80％通過如下步驟：

檢測所述待處理的細胞的生長密度；

使用胰酶消化并棄去多余的細胞；

用新的所述培養基繼續培養。

優選地，所述檢測不到支原體污染的情況之后停止使用所述培養基為通過PCR檢測不到支原體的DNA的存在時停止使用所述培養基。

優選地，所述檢測不到支原體污染的情況之后停止使用所述培養基為當所述待處理的細胞處理時長超過兩周之后停止使用所述培養基。

優選地，所述培養基為含20％胎牛血清的DMEM培養基。

優選地，所述待處理的細胞的獲取方法包括如下步驟：

在培養瓶中培養支原體污染的細胞至第二預設密度，舍棄上清液，使用磷酸緩沖溶液洗滌兩次；

使用胰蛋白酶溶液進行消化；

用新鮮的基礎培養基終止消化，并重懸細胞，得到所述待處理的細胞。

優選地，所述第二預設密度為75％-85％。

優選地，所述消化過程在預設條件下進行，所述預設條件為：溫度37℃、CO₂濃度5％。

優選地，所述新鮮的基礎培養基為含20％胎牛血清的DMEM培養基。

與現有技術相比，該發明一種支原體污染的處理方法具有如下有益效果：

本發明一種支原體污染的處理方法采用在培養基中添加環丙沙星的方法去除支原體，達到了在對細胞的影響小情況下，即并不是采用先滅活后丟棄方式，徹底清除支原體污染的目的，同時還具有停止使用環丙沙星后不復發的優勢，在一定程度上提高了非常珍貴的無法替代的細胞生存能力，便于人們的研究。

本發明一種支原體污染的處理方法采用環丙沙星材料具有簡單易取，成本低廉的優勢，降低了本發明的應用門檻，同時便于本發明的推廣應用。

本發明一種支原體污染的處理方法具有操作簡單，步驟少、時間短的特點，在一定程度上提高了人們的生產效率。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1示出了本發明一個實施例一種支原體污染的處理方法流程圖；

圖2示出了本發明一個實施例一種支原體污染的處理方法的PCR檢測支原體的DNA電泳示意圖；

圖3示出了本發明一個實施例一種支原體污染的處理方法的環丙沙星處理一周的HepGL細胞光鏡圖；

圖4示出了本發明一個實施例一種支原體污染的處理方法的停止使用含10ug/mL環丙沙星的培養基的兩周后的HepGL細胞光鏡圖。

具體實施方式

下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能解釋為對本發明的限制。

請參閱圖1-圖2，對本發明一種支原體污染的處理方法做詳細敘述：

(1)獲取待處理的細胞。

具體地，待處理的細胞的獲取方法包括如下步驟：

在培養瓶中培養支原體污染的細胞至第二預設密度，舍棄上清液，使用磷酸緩沖溶液洗滌兩次；

使用胰蛋白酶溶液進行消化；

用新鮮的基礎培養基終止消化，并重懸細胞，得到待處理的細胞。

其中，第二預設密度為75％-85％；消化過程在預設條件下進行，預設條件為溫度37℃、CO2濃度5％；新鮮的基礎培養基為含20％胎牛血清的DMEM培養基。

示例地，假設待處理的細胞為HepGL細胞，HepGL細胞的獲取方法包括如下步驟：

首先，將受支原體污染的HepGL細胞在25cm2培養瓶中長滿至約80％，棄去培養上清，加入3mL磷酸緩沖溶液洗滌2次；

其次，棄去磷酸緩沖溶液，加入0.25％胰蛋白酶液1ml，輕輕搖勻培養瓶，使酶液完全浸潤所有細胞表面約1-2分鐘；

然后，去掉胰蛋白酶液，接著置37℃、5％CO2培養箱內繼續消化1-2分鐘，期間取出培養瓶置顯微鏡下進行觀察，發現胞質回縮、細胞間隙增大后，細胞變圓后立即終止消化；

最后，加入5ml含20％胎牛血清的DMEM高糖培養基終止消化，并重懸細胞，用吸管吹打盡可能使之成為單細胞懸液，以減少細胞團塊中的腔隙影響藥物作用。

在一些實施方式，為了提高待處理的細胞的質量，還可以通過臺盼藍確認待處理的細胞的活性，一般大于95％即可。

(2)用含10ug/mL環丙沙星的培養基培養待處理的細胞；其中培養基為含20％胎牛血清的DMEM培養基。

考慮到現有市場上已經具有醫用環丙沙星注射液，因此，實施發明時可以直接采用，從而降低本發明的原材料獲取成本，便于本發明的推廣應用。

示例地，假設上述的單細胞懸液為待處理的細胞，步驟二在實施時可以參照如下：將單細胞懸液按照1:3加入25cm2培養瓶中，加入含20％胎牛血清的高糖DMEM至液體總量為10mL；然后按照每1mL液體加5uL環丙沙星注射液(濃度為2mg/mL)，用移液器加入50uL環丙沙星注射液，使得環丙沙星的濃度為10ug/mL。

(3)定時更新培養基，并且使待處理的細胞的生長密度保持在50％-80％。

優選地，定時更新培養基可采用如下任意一種：

每隔固定天數更新培養基；

每當細胞的生長密度達到第一預設密度時，更新培養基。

在具體實施中，考慮到一般情況下，待處理的細胞增殖至80％需要兩天時間，因此固定天數優選為兩天；同時，考慮到一些特殊情形，也為了便于保持待處理的細胞的生長密度保持在50％-80％，第一預設密度優選為75％-85％。

在一些實施方式中，使細胞生長密度保持在50％-80％通過如下步驟：

檢測待處理的細胞的生長密度；

使用胰酶消化并棄去多余的細胞；

用新的培養基繼續培養。

示例地，檢測HepGL細胞的細胞生長密度，當細胞生長密度為75％-85％時，用胰酶消化并棄去多余的細胞，使細胞生長密度保持在50％-80％。

值得一提的是，在實際檢測過程中可以采用觀察法，通過觀察估算細胞生長密度。

(4)檢測不到支原體污染的情況之后停止使用培養基。

具體地，檢測支原體污染可以通過PCR檢測支原體的DNA，當通過PCR檢測不到支原體的DNA的存在時停止使用培養基。當然為了獲得更好的檢測結果，還可以在停止使用含10ug/mL環丙沙星的培養基之后使用新鮮的基礎培養基培養一段時間，期間留取處理后的細胞上清測PCR檢測處理效果。

如圖2所示，圖2示出了PCR檢測支原體的DNA電泳圖，其中，1-7為環丙沙星處理時每兩天取樣結果；8-20為停止使用含10ug/mL環丙沙星的培養基后三周期間取樣所測結果。從圖中可以看出，用10ug/ml環丙沙星處理后以及停止使用含10ug/mL環丙沙星的培養基繼續培養的過程中，測得的支原體DNA都是陰性，說明支原體通過環丙沙星處理后被清除，且在撤藥后無復發，表明支原體已經在細胞中被完全清除。

當然，在一些實施方式中，為了提高清除的效果還可以，同時避免反復檢測還可以根據處理時長確定停止使用含10ug/mL環丙沙星的培養基，具體時長，譬如上述的兩周等，具體處理時長可以根據細胞的污染情況以及細胞本身的特性去確定，本發明實施例對此不作限制。

請參閱圖3-圖4，圖3示出了環丙沙星處理一周的細胞光鏡圖，圖4示出了停止使用含10ug/mL環丙沙星的培養基的兩周后的HepGL細胞光鏡圖，由圖3和圖4的對比可見，環丙沙星對HepGL細胞生長活性狀態與無污染支原體的正常HepGL細胞相仿，也即是環丙沙星處理對HepGL細胞生長活性狀態無明顯影響，因此，可以認定環丙沙星處理是一種比較簡單有效的清除細胞污染支原體的方法，其對支原體殺滅徹底，撤藥后不再復發，且對細胞的影響小。

與現有技術相比，本發明一種支原體污染的處理方法具有如下技術效果：

本發明一種支原體污染的處理方法采用在培養基中添加環丙沙星的方法去除支原體，達到了在對細胞的影響小情況下，即并不是采用先滅活后丟棄方式，徹底清除支原體污染的目的，同時還具有停止使用環丙沙星后不復發的優勢，在一定程度上提高了非常珍貴的無法替代的細胞生存能力，便于人們的研究。

本發明一種支原體污染的處理方法采用環丙沙星材料具有簡單易取，成本低廉的優勢，降低了本發明的應用門檻，同時便于本發明的推廣應用。

本發明一種支原體污染的處理方法具有操作簡單，步驟少、時間短的特點，在一定程度上提高了人們的生產效率。

以上所述僅是本發明的部分實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。