一株高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構建方法與應用與流程

本發明涉及一株高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構建方法與應用，特別涉及一株利用glms核糖開關構建高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的方法及應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

氨基葡萄糖(GlcN)是一種天然存在于結締組織和胃腸道粘膜中的氨基單糖，內源性GlcN在動物和人體細胞內由葡萄糖轉化生成，可以合成黏多糖、糖蛋白和蛋白聚糖，特別是合成關節軟骨以及滑液分子的中間物，臨床試驗表明，外源性氨糖對于人體和動物體內的骨關節炎具有很好的療效，此外還具有抗腫瘤活性等生理功能。目前商品化的GlcN幾乎全部是來自蝦、蟹等甲殼原料的高溫水解，生產過程需要高溫和強酸處理，排放的廢液嚴重污染環境，因此尋找一株安全生產GlcN的微生物，利用生物法合成GlcN具有重要意義。利用微生物發酵直接合成GlcN的優勢主要有：1)生產原料來源簡單，獲取不受地域限制；2)轉化條件溫和，不需高溫、高壓過程，能耗低；3)生產過程中無需加入強酸、強堿，不產生高鹽廢水，對環境污染小；4)產品無魚腥味及微量致敏性物質，不會對體質過敏者造成過敏反應，更適合于在醫藥和保健領域的應用。

中國專利文獻CN104195094A(申請號201410376584.2)公開了一種生產N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌及其構建方法和應用。該基因工程菌通過在枯草芽孢桿菌中表達編碼6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因、6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因，形成完整的從葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的代謝通路；敲除或失活枯草芽孢桿菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代謝途徑中的6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶基因nagB和gamA、6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖轉運蛋白基因gamP和N-乙酰氨基葡萄糖轉運蛋白基因nagP構建而成，它解決了現有技術中所生產的N-乙酰氨基葡萄糖安全性差、產量低、成本高的問題。但其無法解決在發酵過程種實時檢測氨基葡萄糖變化的問題。

glms核糖開關是至今發現的唯一能夠調控糖代謝的核糖開關，只存在于革蘭氏陽性菌中，位于編碼glmS的mRNA的5'UTR內，它需要小分子物質GlcN-6P才能激活，這在已經發現的核酶中是非常少見的，目前對glms核糖開關的相關研究較少。

技術實現要素：

本發明針對先游戲技術的不足，提供一株高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構建方法與應用。該方法利用glms核糖開關基因并以此構建了一株高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌株，該菌株可應用于GlcN的合成。

本發明技術方案如下：

一株高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構建方法，其特征在于，將來自釀酒酵母的GFA1基因、glms核糖開關基因和EGFP增強型熒光蛋白編碼基因轉化至枯草芽孢桿菌中，構建獲得高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌；

所述glms核糖開關基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EGFP增強型熒光蛋白編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，GFA1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

根據本發明優選的，所述構建方法，具體步驟如下：

(1)提取大腸桿菌中的質粒pEGFP-N1，以質粒pEGFP-N1為模板，使用引物EGFP-F和EGFP-R進行PCR擴增，制得EGFP增強型熒光蛋白編碼基因；所述引物核苷酸序列如下：

EGFP-F:CTTCTTTTTAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA；

EGFP-R:TCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA；

(2)提取枯草芽孢桿菌168的基因組DNA，以基因組DNA為模板，使用引物glms-F和glms-R進行PCR擴增，制得glms核糖開關基因；所述引物核苷酸序列如下：

glms-F:TCCCAATTCGAAGTCTATTATCAGAGAGTG；

glms-R:GGATCCATTTTTCTTCCTCCTAAGATTGTAA；

(3)提取釀酒酵母s288c菌體基因組DNA，以基因組DNA為模板，使用引物Gfa1-F和Gfa1-R進行PCR擴增，制得GFA1基因；所述引物核苷酸序列如下：

Gfa1-F:GGATCCATGTGTGGTATCTTTGGTT；

Gfa1-R:AATAGACTTCGTTATTCGACGGTAA；

(4)將步驟(1)制得的EGFP增強型熒光蛋白編碼基因與步驟(2)制得的glms核糖開關基因經重疊PCR，制得glms-EGFP片段；

(5)將步驟(3)制得的GFA1基因與步驟(4)制得的glms-EGFP片段經重疊PCR，制得GFA1-glms-EGFP片段；

(6)將步驟(6)制得的GFA1-glms-EGFP片段連接到表達載體PHT01上，制得重組表達載體；然后轉化枯草芽孢桿菌WB800N感受態細胞，篩選陽性重組菌，制得高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌。

根據本發明優選的，所述步驟(1)中的PCR擴增體系如下，總體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，濃度10μmol/L的引物EGFP-F 2μl，濃度10μmol/L的引物EGFP-R 2μl，模板2μl，ddH₂O補足50μl；

所述的PCR擴增程序如下：

95℃預變性5min；95℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30個循環；72℃延伸10min；-20℃保存。

根據本發明優選的，所述步驟(2)中的PCR擴增體系如下，總體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，濃度10μmol/L的引物glms-F 2μl，濃度10μmol/L的引物glms-R2μl，模板2μl，ddH₂O補足50μl；

所述的PCR擴增程序如下：

95℃預變性5min；95℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸10min；-20℃保存。

根據本發明優選的，所述步驟(3)中的PCR擴增體系如下，總體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，濃度10μmol/L的引物Gfa1-F 2μl，濃度10μmol/L的引物Gfa1-R2μl，模板2μl，ddH₂O補足50μl；

所述的PCR擴增程序如下：

95℃預變性5min；95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，30個循環；72℃延伸10min；-20℃保存。

根據本發明優選的，所述步驟(4)中，所述重疊PCR的初次擴增體系如下，總體系為25μl：

glms核糖開關基因4μl；EGFP增強型熒光蛋白編碼基因4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述重疊PCR的初次擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5個循環；72℃延伸2min；

所述重疊PCR的補充擴增體系如下，總體系為25μl：

濃度10μmol/L的上游引物glms-F 2μl；濃度10μmol/L的下游引物EGFP-R 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述重疊PCR的補充擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸5min，30個循環；72℃延伸10min；-20℃保存。

根據本發明優選的，所述步驟(5)中，所述重疊PCR的初次擴增體系如下，總體系為25μl：

GFA1基因4μl；glms-EGFP片段4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述的重疊PCR的初次擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5個循環；72℃延伸2min；

所述的重疊PCR的補充擴增體系為25μl：

濃度10μmol/L的上游引物GFA1-F 2μl；濃度10μmol/L的下游引物EGFP-R 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重疊PCR的補充擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸7min，30個循環；72℃延伸10min；-20℃保存。

根據本發明優選的，所述步驟(6)中，連接步驟如下：

將GFA1-glms-EGFP片段經BamH I和Xba I雙酶切后，與同樣經BamH I和Xba I雙酶切后的表達載體PHT01通過T4連接酶在16℃條件下連接12h，連接體系如下：

GFA1-glms-EGFP片段3μL，PHT01質粒1μL，T4連接酶1μL，T4buffer 1μL，加ddH₂O至10μL。

根據本發明優選的，所述步驟(6)中，轉化條件為：2mm電轉杯、2500v脈沖條件下電擊轉化，時間常數＝5.0ms。

根據本發明優選的，所述步驟(6)中，篩選陽性重組菌的步驟如下：

將轉化后的枯草芽孢桿菌WB800N涂布在含25μg/ml氯霉素的LB平板上，在37℃培養14～18h，篩選具有氯霉素抗性的轉化子并轉接至LB液體培養基中37℃培養過夜，利用引物GFA1-F和EGFP-R對菌體中的DNA進行PCR擴增進行驗證。

上述構建方法制備的高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌。

上述高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌在制備氨基葡萄糖中的應用，步驟如下：

將高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌種子液按2％的比例接種于發酵培養基中，在35～38℃、150～300rpm的條件下培養至OD₆₀₀為0.8～0.9，然后加入IPTG至濃度為0.5mM，24～26℃誘導培養6h；然后經菌體破碎，純化，制得氨基葡萄糖。

根據本發明優選的，所述高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌種子的制備步驟如下：

將高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌接種于種子培養基中，在35～38℃的條件下培養5～8h。

進一步優選的，所述種子培養基組分如下：

蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L。

根據本發明優選的，所述發酵培養基組分如下：

葡萄糖50g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L。

有益效果

1、本發明首次將glms核糖開關和EGFP基因連接在PHT01中，構建成GLMS-EGFP傳感器，響應枯草芽孢桿菌細胞內6-磷酸氨基葡萄糖量的變化而表現出熒光強度的變化，通過流式細胞儀，可以實時掌握氨基葡萄糖的合成情況；

2、本發明構建的高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌可以使氨基葡萄糖實現高效表達，并且可以通過流式細胞儀檢測菌體熒光強度，來指示氨基葡萄糖的胞內產生量；可通過觀察熒光強度確定最佳發酵條件，誘導時間等。有利于高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的使用，為進一步提高氨基葡萄糖產量奠定了基礎，具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1是PHT01-GFA1-glms-EGFP構建示意圖；

圖2是流式細胞儀觀測的WB800N菌體熒光情況結果圖；

圖3是最優誘導條件下流式細胞儀觀測的工程菌菌體的熒光情況結果圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步闡述，但本發明所保護范圍不限于此。

生物材料來源：

質粒PHT01購自杭州寶賽生物有限公司

大腸桿菌pEGFP-N1購自杭州寶賽生物有限公司

枯草芽孢桿菌168購自杭州寶賽生物有限公司

枯草芽孢桿菌WB800N購自杭州寶賽生物有限公司

實施例1

一株高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構建方法，步驟如下：

(1)提取大腸桿菌中的質粒pEGFP-N1，以質粒pEGFP-N1為模板，使用引物EGFP-F和EGFP-R進行PCR擴增，制得EGFP增強型熒光蛋白編碼基因；EGFP增強型熒光蛋白編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物核苷酸序列如下：

EGFP-F:CTTCTTTTTAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA；

EGFP-R:TCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA；

所述的PCR擴增體系如下，總體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，濃度10μmol/L的引物EGFP-F 2μl，濃度10μmol/L的引物EGFP-R 2μl，模板2μl，ddH₂O補足50μl；

所述的PCR擴增程序如下：

95℃預變性5min；95℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30個循環；72℃延伸10min；-20℃保存。

(2)提取枯草芽孢桿菌168的基因組DNA，以基因組DNA為模板，使用引物glms-F和glms-R進行PCR擴增，制得glms核糖開關基因；所述glms核糖開關基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物核苷酸序列如下：

glms-F:TCCCAATTCGAAGTCTATTATCAGAGAGTG

glms-R:GGATCCATTTTTCTTCCTCCTAAGATTGTAA

所述的PCR擴增體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，引物glms-F(10μmol/L)2μl，引物glms-R(10μmol/L)2μl，模板2μl，用ddH₂O補足50μl；

所述的PCR擴增程序如下：

95℃預變性5min；95℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸10min，-20℃保存；

(3)提取釀酒酵母s288c菌體基因組DNA，以基因組DNA為模板，使用引物Gfa1-F和Gfa1-R進行PCR擴增，制得GFA1基因；GFA1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物核苷酸序列如下：

Gfa1-F:GGATCCATGTGTGGTATCTTTGGTT；

Gfa1-R:AATAGACTTCGTTATTCGACGGTAA；

所述的PCR擴增體系如下，總體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，濃度10μmol/L的引物Gfa1-F 2μl，濃度10μmol/L的引物Gfa1-R2μl，模板2μl，用ddH₂O補足50μl；

所述的PCR擴增程序如下：

95℃預變性5min；95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，30個循環；72℃延伸10min；-20℃保存。

(4)將步驟(1)制得的EGFP增強型熒光蛋白編碼基因與步驟(2)制得的glms核糖開關基因經重疊PCR，制得glms-EGFP片段；

所述的重疊PCR的初次擴增體系如下，總體系為25μl：

glms核糖開關基因4μl；EGFP增強型熒光蛋白編碼基因4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述的重疊PCR的初次擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5個循環；72℃延伸2min；

所述的重疊PCR的補充擴增體系如下，總體系為25μl：

濃度10μmol/L的上游引物glms-F 2μl；濃度10μmol/L的下游引物EGFP-R 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重疊PCR的補充擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸5min，30個循環；72℃延伸10min；-20℃保存。

(5)將步驟(3)制得的GFA1基因與步驟(4)制得的glms-EGFP片段經重疊PCR，制得GFA1-glms-EGFP片段；

所述的重疊PCR的初次擴增體系如下，總體系為25μl：

GFA1片段4μl；glms-EGFP片段4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述的重疊PCR的初次擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5個循環；72℃延伸2min；

所述的重疊PCR的補充擴增體系如下，總體系為25μl：

上游引物GFA1-F 2μl；下游引物EGFP-R 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重疊PCR的補充擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸7min，30個循環；72℃延伸10min，-20℃保存；

(6)將步驟(6)制得的GFA1-glms-EGFP片段連接到表達載體PHT01上，制得重組表達載體；然后轉化枯草芽孢桿菌WB800N感受態細胞，篩選陽性重組菌，制得高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌；

所述步驟(6)中，連接步驟如下：

將GFA1-glms-EGFP片段經BamH I和Xba I雙酶切后，與同樣經BamH I和Xba I雙酶切后的表達載體PHT01通過T4連接酶在16℃條件下連接12h，連接體系如下：

GFA1-glms-EGFP片段3μL，PHT01質粒1μL，T4連接酶1μL，T4buffer 1μL，加ddH₂O至10μL。

所述步驟(6)中，轉化條件為：將感受態細胞以100μl每管分裝，采用2mm電轉杯，2500v脈沖條件下電擊轉化，時間常數＝5.0ms。

所述步驟(6)中，篩選陽性重組菌的步驟如下：

將轉化后的枯草芽孢桿菌WB800N涂布在含25μg/ml氯霉素的LB平板上，在37℃培養14～18h，篩選具有氯霉素抗性的轉化子并轉接至LB液體培養基中37℃培養過夜，利用引物GFA1-F和EGFP-R對菌體中的DNA進行PCR擴增；瓊脂糖凝膠電泳證明重組質粒PHT01轉化到枯草芽孢桿菌WB800N中。

實施例2

高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌在發酵生產氨基葡萄糖中的應用，步驟如下：

1)從含氯霉素25μg/mL的LB平板挑取高產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌單菌落轉接于3mL LB液體培養基中，在37℃、200rpm條件下過夜培養，制得種子液；

LB平板每升組分如下：

胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂粉15g，水定容至1L，pH值7.0。

LB液體培養基每升組分如下：

胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水定容至1L，pH值7.0。

2)將種子液接種于含氯霉素25μg/mL的100mL LB液體培養基中，于37℃、200rpm培養，分別按表1中的條件誘導表達。

表1枯草芽孢桿菌氨基葡萄糖合酶表達條件優化正交實驗表

3)將誘導表達結束后的發酵液離心收集菌體，用PBS緩沖液重懸菌體，洗滌菌體三次，最后用適量PBS緩沖液懸浮菌體，用流式細胞儀觀察菌體熒光強度，設置激發光波長為480nm，發射光波長為610nm，速度為300個粒子/sec，通過比較檢測不同批次發酵結束時菌體熒光強度和氨基葡萄糖的含量，可以用熒光強度表示氨基葡萄糖的產生量。可通過觀察熒光強度確定最佳發酵條件結果如表2中所示。

通過對影響氨基葡萄糖產量的誘導溫度、培養時間、IPTG濃度和誘導時間4個因素進行優化的結果表明，以胞內氨基葡萄糖含量為評價指標的最佳誘導條件為：誘導溫度25℃、培養時間6h、IPTG濃度0.5mM、誘導時間6h。熒光強度為65％，氨基葡萄糖產量為0.745g/L，如表2所示。

表2枯草芽孢桿菌氨基葡萄糖合酶表達條件優化結果

對比例1

中國專利文獻CN104195094A(申請號201410376584.2)公開了一種生產N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌及其構建方法和應用。該基因工程菌通過在枯草芽孢桿菌中表達編碼6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因、6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因，形成完整的從葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的代謝通路；敲除或失活枯草芽孢桿菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代謝途徑中的6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶基因nagB和gamA、6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖轉運蛋白基因gamP和N-乙酰氨基葡萄糖轉運蛋白基因nagP構建而成。

本申請與對比例1的不同之處在于對比例1中發酵液氨基葡萄糖的含量是通過高效液相色譜法測定，此方法獲得的數據相對滯后，不能及時監測到細胞內氨基葡萄糖的變化。本申請利用核糖開關構建的生物傳感器可以通過綠色熒光蛋白的亮度反映氨基葡萄糖的產生量，當細胞內GlcN-6P濃度較高時將反饋抑制glmS的表達，就會檢測到GFP熒光降低；而當細胞內的GlcN-6P濃度降低時，glmS的抑制解除，GFP熒光又會升高，達到實時監測細胞內GlcN-6P濃度變化的目的，為更加及時進行過程代謝的調控提高GlcN的生物合成提供幫助。