用于治療表達密蛋白6之癌癥的抗體的制作方法

本申請是申請號為201280022739.1的中國專利申請的分案申請，原申請是2012年4月20日提交的pct國際申請pct/ep2012/001721于2013年11月11日進入中國國家階段的申請。

本發明涉及用于治療表達密蛋白6之癌癥的抗體。

背景技術：

在過去的十年間，抗體已被成功地引入臨床用于癌癥治療，并且已成為腫瘤學中最有希望的療法。與常規藥物相比，基于抗體的癌癥治療具有較高特異性和較低副作用譜的潛力。原因是抗體在正常和腫瘤細胞之間的精確區分，及其作用方式依賴毒性較小的免疫抗腫瘤機制(例如，補體激活和募集細胞毒性免疫細胞)的事實。

密蛋白(claudin)是位于上皮與內皮的緊密連接內的整合膜蛋白(integralmembraneprotein)。預測密蛋白具有四個跨膜區段，有兩個細胞外環，并且n和c末端位于胞質中。跨膜蛋白質的密蛋白(cldn)家族在上皮與內皮緊密連接的維持中發揮關鍵作用，并且還可能在細胞骨架的維持中以及在細胞信號傳導中發揮作用。除了它們的膜定位之外，這些蛋白質在腫瘤和正常細胞之間的差異表達使它們成為有吸引力的癌癥免疫治療靶標，并且在癌癥治療中使用靶向cldn的基于抗體的治療劑(therapeutics)使高水平的治療特異性成為可能。

然而，靶向cldn之治療劑的臨床應用面臨多種障礙。身體中普遍存在的cldn表達以及cldn在維持緊密連接中的關鍵作用要求靶向cldn之治療劑的靶標特異性，以使治療特異性最大化以及全身毒性最小化。

wo2009/087978涉及抗cldn6抗體，并且涉及其作為抗癌劑的應用。特別是描述了所設計的單克隆抗體ab3-1、ae1-16、ae49-11和ae3-20。然而，通過實施例5中的facs分析表明，這些抗體都不是cldn6特異性的。抗體ae3-20與cldn9反應，而抗體ae1-16和ae49-11表現出與cldn9相當大的反應性，并且還與cldn4反應。抗體ab3-1與cldn6的結合與其與cldn9的結合一樣強。實施例7中描述了當向小鼠腫瘤模型施用時，抗體ae49-11傾向于抑制腫瘤生長，并且具有延長生命的作用。然而，鑒于所使用抗體的非特異性，還不清楚所描述的作用是否是由抗體與cldn6結合所引起的。

因此，到目前為止，尚未描述與表達cldn6之細胞的表面選擇性結合的cldn6特異性的抗體。然而，需要這樣的特異性抗體用于使用cldn6作為靶標的基于抗體的治療方法。

圖1中所示的cldn3、cldn4、cldn6和cldn9的序列比對說明cldn6與其他密蛋白有高度的保守性。cldn6與其他密蛋白(特別是cldn9和cldn4)的這種高同源性以及wo2009/087978無法提供cldn6特異性抗體的事實表明也許不能產生與cldn6特異性結合的抗體。

技術實現要素：

本文中公開的實驗結果確證cldn6在不同的人癌細胞中表達，而在正常組織中的表達限于胎盤。

此外，本發明第一次描述成功地產生能夠與表達cldn6之完整細胞的表面相結合的cldn6特異性抗體。表達cldn6之完整細胞的facs分析顯示抗cldn6抗體的特異性結合，而對于表達其他密蛋白(特別是cldn3、cldn4和cldn9)的細胞或者不表達任何這些cldn蛋白的細胞未觀察到結合。因此，本發明出人意料地證明，可產生這樣的抗體，其與表達cldn6之細胞表面上的cldn6特異性地進行抗原-抗體反應，但基本不與其他高度同源性的密蛋白進行抗原-抗體反應。

本發明一般地提供可用作治療劑的抗體，其用于治療和/或預防與表達cldn6并以cldn6與細胞表面相締合(association)為特征之細胞相關的疾病，包括腫瘤相關的疾病，特別是癌癥，例如卵巢癌(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺癌(包括小細胞肺癌(smallcelllungcancer，sclc)和非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)，特別是鱗狀細胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(特別是基底細胞癌和鱗狀細胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、膀胱癌(特別是移行細胞癌和乳頭狀癌)、腎癌(特別是腎細胞癌，包括明細胞腎細胞癌和乳頭狀腎細胞癌)、結腸癌、小腸癌(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎性癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌(特別是睪丸精原細胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌)、子宮癌、生殖細胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細胞腫瘤)、及其轉移形式。

在一個方面中，本發明涉及能夠與表達cldn6之細胞表面所締合的cldn6相結合的抗體。優選地，所述抗體基本不能與表達cldn9之細胞表面相締合的cldn9相結合。優選地，所述抗體基本不能與表達cldn4之細胞表面所締合的cldn4相結合和/或基本不能與表達cldn3之細胞表面所締合的cldn3相結合。最優選地，所述抗體基本不能與cldn6以外的其他cldn蛋白(所述其他cldn蛋白與表達所述cldn蛋白之細胞表面相締合)相結合，并且是cldn6特異性的。優選地，表達所述cldn蛋白的所述細胞是完整細胞，特別是非透化的細胞，并且與細胞表面相締合的所述cldn蛋白具有天然的(即非變性的)構象。優選地，所述抗體能夠與一個或更多個天然構象的cldn6表位相結合。

在一個實施方案中，所述抗體能夠與位于cldn6的胞外部分中的表位相結合，其中cldn6的所述胞外部分優選地包含seqidno：6、seqidno：7、seqidno：14和seqidno：15的任一氨基酸序列，優選seqidno：6或seqidno：7的氨基酸序列，更優選seqidno：6的氨基酸序列。優選地，所述抗體能夠與位于seqidno：6、seqidno：7、seqidno：14和seqidno：15的任一氨基酸序列(優選seqidno：6或seqidno：7的氨基酸序列)中的表位相結合。

在一個實施方案中，所述抗體能夠通過如下與cldn6結合：通過至少與選自thr33、phe35、gly37、ser39、ile40和leu151的一個、優選超過一個(例如，2、3、4或5個)、優選全部氨基酸相互作用，優選通過至少與選自thr33、phe35、gly37、ser39和ile40的一個、優選超過一個、優選全部氨基酸相互作用，更優選通過至少與選自phe35、gly37、ser39和ile40或者thr33、phe35、gly37和ser39的一個、優選超過一個、優選全部氨基酸相互作用，并且特別是通過至少與選自phe35、gly37和ser39的一個、優選超過一個、優選全部氨基酸相互作用。優選地，所述抗體不與選自glu154、ala155、arg158和gly161的一個或更多個、優選全部氨基酸相互作用，并且優選不與選自arg158和gly161的一個或更多個、優選全部氨基酸相互作用。

可通過丙氨酸掃描氨基酸的突變來分析抗體與cldn6(特別是天然構象cldn6)之間的相互作用。可評價cldn6突變體被特異性單克隆抗體所結合的能力。特異性單克隆抗體與cldn6突變體之結合受損表明被突變的氨基酸是重要的接觸殘基。可例如通過流式細胞術分析結合。

在一個實施方案中，通過包括以下步驟的方法可獲得所述抗體：用具有seqidno：6、seqidno：7、seqidno：14和seqidno：15的任一氨基酸序列(優選seqidno：6或seqidno：7的氨基酸序列)的肽或免疫等效肽或者表達所述肽的核酸或宿主細胞免疫接種動物。

在不同的一些實施方案中，所述抗體能夠結合的cldn6具有seqidno：2的氨基酸序列或seqidno：8的氨基酸序列。特別優選地是，所述抗體能夠與具有seqidno：2之氨基酸序列的cldn6相結合，并且能夠與具有seqidno：8之氨基酸序列的cldn6相結合。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含選自seqidno：34、36、38和40之抗體重鏈序列或其變體的cdr序列的至少一個、優選兩個、更優選所有三個。在圖25中所給出的上文中所提及的抗體重鏈序列中，以方框標記所述cdr序列。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含cdr3序列xaa1glyxaa2valxaa3，其中xaa1是任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr，xaa2是任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr，并且xaa3是任何氨基酸，優選leu或phe，更優選leu。在一個實施方案中，本發明的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含cdr3序列aspxaa1glyxaa2valxaa3或xaa1glyxaa2valxaa3asp，其中xaa1、xaa2和xaa3的定義見上文。在一個實施方案中，本發明的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含cdr3序列aspxaa1glyxaa2valxaa3asp，其中xaa1、xaa2和xaa3的定義見上文。在一個實施方案中，本發明的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含cdr3序列alaargaspxaa1glyxaa2valxaa3asptyr，其中xaa1、xaa2和xaa3的定義見上文。在一個實施方案中，根據前述實施方案的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含根據seqidno：47的cdr1序列或其變體和/或根據seqidno：48的cdr2序列或其變體。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含選自seqidno：34、36、38和40的抗體重鏈序列或其變體。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含選自seqidno：35、37、39和41之抗體輕鏈序列或其變體的cdr序列的至少一個、優選兩個、更優選所有三個。在圖26中所給出的上文中提及的抗體輕鏈序列中，以方框標記cdr序列。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含cdr3序列argxaa1xaa2xaa3pro，其中xaa1是任何氨基酸，優選ser或ash，最優選ser，xaa2是任何氨基酸，優選tyr、ser、ile、asn或thr，更優選tyr、ser或asn，最優選asn，并且xaa3是任何氨基酸，優選ser或tyr，更優選tyr。在一個實施方案中，本發明的抗體包含抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含cdr3序列glnargxaa1xaa2xaa3propro，其中xaa1、xaa2和xaa3的定義見上文。在一個實施方案中，本發明的抗體包含抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含cdr3序列glnglnargxaa1xaa2xaa3proprotrpthr，其中xaa1、xaa2和xaa3的定義見上文。在一個實施方案中，根據前述實施方案的抗體包含抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含根據seqidno：52的cdr1序列或其變體和/或根據seqidno：53的cdr2序列或其變體。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含選自seqidno：35、37、39、41、54和55的抗體輕鏈序列或其變體。

在多種實施方案中，本發明的抗體包含上文中所討論的抗體重鏈和上文中所討論的抗體輕鏈。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含：

(i)抗體重鏈，其包含seqidno：x的抗體重鏈序列或其變體的cdr序列的至少一個、優選兩個、更優選所有三個，以及

(ii)抗體輕鏈，其包含seqidno：x+1的抗體輕鏈序列或其變體的cdr序列的至少一個、優選兩個、更優選所有三個；

其中x選自34、36、38和40。

在上文中所提及的抗體重鏈序列和抗體輕鏈序列中分別用方框標出cdr序列，分別在圖25和圖26中給出。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含：

(i)抗體重鏈，其包含選自xaa1glyxaa2valxaa3、aspxaa1glyxaa2valxaa3、xaa1glyxaa2valxaa3asp、aspxaa1glyxaa2valxaa3asp和alaargaspxaa1glyxaa2valxaa3asptyr的cdr3序列，其中xaa1是任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr，xaa2是任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr，并且xaa3是任何氨基酸，優選leu或phe，最優選leu，以及

(ii)抗體輕鏈，其包含選自argxaa1xaa2xaa3pro、glnargxaa1xaa2xaa3propro、glnglnargxaa1xaa2xaa3proprotrpthr的cdr3序列，其中xaa1是任何氨基酸，優選ser或ash，最優選ser，xaa2是任何氨基酸，優選tyr、ser、ile、asn或thr，更優選tyr、ser或asn，最優選asn，并且xaa3是任何氨基酸，優選ser或tyr，更優選tyr。

在一個實施方案中，根據前述實施方案的抗體包含(i)抗體重鏈，其包含根據seqidno：47的cdr1序列或其變體和/或根據seqidno：48的cdr2序列或其變體，和/或(ii)抗體輕鏈，其包含根據seqidno：52的cdr1序列或其變體和/或根據seqidno：53的cdr2序列或其變體。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含：

(i)抗體重鏈，其包含選自seqidno：34、36、38和40的抗體重鏈序列或其變體，優選seqidno：36的抗體重鏈序列或其變體；以及

(ii)抗體輕鏈，其包含選自seqidno：35、37、39、41、54和55的抗體輕鏈序列或其變體，優選seqidno：35的抗體輕鏈序列或其變體。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含：

(i)抗體重鏈，其包含seqidno：36的抗體重鏈序列或其變體；以及(ii)抗體輕鏈，其包含選自seqidno：35、54和55的抗體輕鏈序列或其變體。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含：

(i)抗體重鏈，其包含seqidno：36的抗體重鏈序列或其變體；以及(ii)抗體輕鏈，其包含選自seqidno：54和55的抗體輕鏈序列或其變體。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含：

(i)抗體重鏈，其包含seqidno：36的抗體重鏈序列或其變體；以及

(ii)抗體輕鏈，其包含seqidno：35的抗體輕鏈序列或其變體。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含：

(i)抗體重鏈，其包含seqidno：x的抗體重鏈序列或其變體，以及

(ii)抗體輕鏈，其包含seqidno：x+1的抗體輕鏈或其變體；

其中x選自34、36、38和40。

在優選的一些實施方案中，本發明的抗體包含抗體重鏈和/或抗體輕鏈，所述抗體重鏈包含γ-1重鏈恒定區，優選人γ-1重鏈恒定區，例如如seqidno：25所示的序列；所述抗體輕鏈包含κ輕鏈恒定區，優選人κ輕鏈恒定區，例如如seqidno：27所示的序列。

在優選的一些實施方案中，所述抗體具有一種或更多種以下活性：(i)殺傷表達cldn6的細胞，(ii)抑制表達cldn6之細胞的增殖，(iii)抑制表達cldn6之細胞的集落形成，(iv)介導已建立之腫瘤的緩解(即，大小減小)，優選完全緩解(即，完全消失)，(v)預防腫瘤的形成或再形成，以及(vi)抑制表達cldn6之細胞的轉移。因此，所述抗體可以用于前述一種或更多種(特別是當向患者施用時)。如本文中所描述的那樣，可治療性地應用所述殺傷細胞和/或抑制細胞的一種或更多種活性。特別是可將殺傷細胞、抑制細胞的增殖和/或抑制細胞的集落形成用于治療或預防癌癥(包括癌癥轉移)。可應用抑制細胞的增殖、集落形成和/或轉移，特別是用于治療或預防癌癥轉移和癌細胞的轉移性擴散。優選地，本發明的抗體通過誘導補體依賴的細胞毒作用(complementdependentcytotoxicity，cdc)介導的裂解、抗體依賴性細胞的細胞毒作用(antibodydependentcellularcytotoxicity，adcc)介導的裂解、凋亡、同型黏著(homotypicadhesion)和/或吞噬作用(優選通過誘導cdc介導的裂解和/或adcc介導的裂解)介導對細胞的殺傷。然而，本發明還包括這樣的一些實施方案，其中所述抗體發揮本文中所描述的活性(例如，殺傷細胞和/或抑制一種或更多種細胞活性(例如，細胞增殖和域集落形成))而不誘導補體依賴的細胞毒作用(cdc)介導的裂解、抗體依賴性細胞的細胞毒作用(adcc)介導的裂解、凋亡、同型黏著和/或吞噬作用。例如，本發明的抗體還可簡單地通過與細胞表面上的cldn6結合而發揮作用，因而例如阻斷細胞的增殖。在一個實施方案中，本發明的抗體不誘導cdc介導的細胞裂解。

優選地，在效應細胞存在下，發生adcc介導的細胞裂解，在一些具體的實施方案中，所述效應細胞選自單核細胞(monocyte)、單個核細胞(mononuclearcell)、nk細胞和pmn，并且吞噬作用是通過巨噬細胞進行的。

可通過在使用溴脫氧尿苷(5-溴-2-脫氧尿苷，brdu)的測定中測定表達cldn6之癌細胞的增殖來體外測量抑制或降低表達cldn6之細胞(優選癌細胞)的增殖的活性。brdu是合成的核苷，其是胸苷的類似物，并且可被并入復制中的細胞(在細胞周期的s期的過程中)的新合成的dna，在dna復制的過程中替代胸苷。使用例如brdu特異性的抗體檢出所并入的化學品表明細胞正在活躍地復制其dna。

在產克隆試驗(clonogenicassay)中，可體外測量抑制或降低表達cldn6之細胞(優選癌細胞)集落形成的活性。產克隆試驗是用于研究特定藥劑(agent)對細胞存活和增殖之有效性的微生物技術。其在癌癥研究的實驗室中經常使用，用于測定藥物或輻射對增殖的腫瘤細胞的作用。該實驗涉及三個主要的步驟：(i)向細胞(特別是癌細胞)的樣品應用處理，(ii)將細胞平板接種進入組織培養容器中，以及(iii)使細胞生長。固定所產生的集落，染色，計數。如果單個腫瘤細胞定植(colonize)器官，對于轉移灶的形成，集落形成是重要的。抗體的抑制作用表明其在抑制轉移灶之形成中的潛力。在產克隆試驗中，具有抑制或降低集落形成之活性的抗體特別可用于治療或預防癌細胞(特別是本文中提及的癌癥類型)的轉移和轉移性擴散。

在一些優選的實施方案中，所述抗體表現出針對帶有天然構象cldn6之細胞的一種或更多種免疫效應功能，其中所述一種或更多種免疫效應功能優選地選自補體依賴的細胞毒作用(cdc)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，adcc)、誘導凋亡、以及抑制增殖，優選的效應功能是adcc和/或cdc。

優選地，所述抗體表現出的一種或更多種活性或者一種或更多種免疫效應功能是通過所述抗體與cldn6相結合(優選與位于cldn6的胞外部分中的表位相結合)而誘導的，其中cldn6的所述胞外部分優選地包含seqidno：6、seqidno：7、seqidno：14和seqidno：15的任何一種氨基酸序列，優選seqidno：6或seqidno：7的氨基酸序列，更優選seqidno：6的氨基酸序列。

根據本發明，表達cldn6的細胞優選地以cldn6與其細胞表面相締合為特征。表達cldn6之細胞或者帶有天然構象cldn6之細胞優選地是腫瘤細胞(例如，癌細胞)，優選來自選自以下癌的癌細胞：卵巢癌(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤)、肺癌(包括小細胞肺癌(sclc)和非小細胞肺癌(nsclc)，特別是鱗狀細胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(特別是基底細胞癌和鱗狀細胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、膀胱癌(特別是移行細胞癌和乳頭狀癌)、腎癌(特別是腎細胞癌，包括明細胞腎細胞癌和乳頭狀腎細胞癌)、結腸癌、小腸癌(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎性癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌(特別是睪丸精原細胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌)、子宮癌、生殖細胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細胞腫瘤)、及其轉移形式。

本發明的抗體可以連接一個或更多個治療效應部分(例如，放射性標記物、細胞毒素、治療酶(therapeuticenzyme)、誘導凋亡的藥劑等)以提供靶向的細胞毒性(即，殺傷腫瘤細胞)。

在一個實施方案中，本發明的抗體(i)與表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞相結合，并且(ii)不與不表達cldn6以及不以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞相結合。本發明的抗體優選(i)介導殺傷表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞和/或抑制其增殖，并且(ii)不介導殺傷不表達cldn6以及不以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞和/或不抑制其增殖。

在一些具體的優選實施方案中，本發明的抗體與存在于活細胞表面上的cldn6天然表位(例如，seqidnos：6或7的表位)相結合。在另一些優選的實施方案中，本發明的抗體對于表達cldn6之癌細胞是特異性的，并且不與不表達cldn6的癌細胞相結合。

本發明的抗體可源自不同的物種，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。本發明的抗體還包括嵌合分子，其中源自一個物種(優選人)的抗體恒定區與源自另一個物種的抗原結合位點組合。此外，本發明的抗體包括人源化分子，其中源自非人物種之抗體的抗原結合位點與人來源的恒定和框架區相組合。

本發明的抗體包括多克隆和單克隆抗體，并且包括igg2a(例如，igg2a、κ、λ)、igg2b(例如，igg2b、κ、λ)、igg3(例如，igg3、κ、λ)和igm抗體。然而，本發明還包括其他抗體同種型，包括igg1、iga1、iga2、分泌型iga、igd和ige抗體。所述抗體可以是完整的抗體或者其抗原結合片段，包括例如fab、f(ab′)2、fv、單鏈fv片段或雙特異性抗體。此外，所述抗原結合片段包括結合結構域免疫球蛋白融合蛋白質，其包含(i)與免疫球蛋白鉸鏈區多肽融合的結合結構域多肽(例如，重鏈可變區或輕鏈可變區)，(ii)與鉸鏈區融合的免疫球蛋白重鏈ch2恒定區，以及(iii)與ch2恒定區融合的免疫球蛋白重鏈ch3恒定區。這樣的結合結構域免疫球蛋白融合蛋白質還在us2003/0118592和us2003/0133939中公開。

本發明的抗體優選地是單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體或人源化抗體，或者抗體的片段。本發明的抗體包括完全人抗體。可在非人轉基因動物(例如，轉基因小鼠)中產生這樣的抗體，所述轉基因動物能夠通過進行v-d-j重組和同種型轉換產生抗cldn6人單克隆抗體的多個同種型。這樣的轉基因動物還可以是用于產生多克隆抗體的轉基因兔(例如，公開于us2003/0017534中)。

本發明的抗體優選地以約1～100nm或更低的解離平衡常數(kd)與cldn6解離。優選地，本發明的抗體不與相關的細胞表面抗原交叉反應，并因而不抑制其功能。

在一些優選的實施方案中，本發明的抗體可以具有一個或更多個以下特性：

a)對cldn6的特異性；

b)與cldn6的結合親和力，約100nm或更低，優選約5～10nm或更低，以及更優選約1～3nm或更低，

c)誘導細胞cdc的能力，所述細胞表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征；

d)抑制細胞生長的能力，所述細胞表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征；

e)誘導細胞凋亡的能力，所述細胞表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征；

f)誘導細胞同型黏著的能力，所述細胞表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征；

g)誘導細胞adcc的能力，所述細胞表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征；

h)延遲具有腫瘤細胞之對象存活的能力，所述腫瘤細胞表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征；

i)耗竭細胞的能力，所述細胞表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征；

j)使cldn6在活細胞表面聚集的能力。

本文中所描述的優選的抗體是由雜交瘤細胞產生的或可從其獲得的抗體，所述雜交瘤細胞保藏在dsmz(inhoffenstr.7b，38124不倫瑞克(braunschweig)，德國)，并且具有以下命名和登記號之一：

1.gt512mumab59a，登記號dsmacc3067，保藏于2010年6月21日；

2.gt512mumab60a，登記號dsmacc3068，保藏于2010年6月21日；

3.gt512mumab61d，登記號dsmacc3069，保藏于2010年6月21日；

4.gt512mumab64a，登記號dsmacc3070，保藏于2010年6月21日；

5.gt512mumab65a，登記號dsmacc3071，保藏于2010年6月21日；

6.gt512mumab66b，登記號dsmacc3072，保藏于2010年6月21日；

7.gt512mumab67a，登記號dsmacc3073.保藏于2010年6月21日；

8.gt512mumab55a，登記號dsmacc3089，保藏于2010年8月31日；或者

9.gt512mumab89a，登記號dsmacc3090，保藏于2010年8月31日。

本文中通過參照抗體的命名和/或通過參照產生抗體的克隆來命名本發明的抗體，例如mumab59a。

另一些優選的抗體具有由上述雜交瘤產生或可從其獲得之抗體特異性的抗體，并且特別是包含與由上述雜交瘤產生的或可從其獲得的抗體的抗原結合部分或抗原結合位點(特別是可變區)相同或高度同源的抗體。優選的抗體包括具有與由上述雜交瘤產生的或可從其獲得的抗體的cdr區相同或高度同源的抗體。對于“高度同源”，考慮在每個cdr區中進行1至5(優選1至4，例如1至3或者1或2)個替換。特別優選的抗體是由上述雜交瘤產生的或可從其獲得的抗體的嵌合化和人源化形式。

因此，本發明的抗體可選自：(i)由以如下登記號保藏的克隆產生的或可從其獲得的抗體：dsmacc3067(gt512mumab59a)、dsmacc3068(gt512mumab60a)、dsmacc3069(gt512mumab61d)、dsmacc3070(gt512mumab64a)、dsmacc3071(gt512mumab65a)、dsmacc3072(gt512mumab66b)、dsmacc3073(gt512mumab67a)、dsmacc3089(gt512mumab55a)或dsmacc3090(gt512mumab89a)，(ii)抗體，其為(i)抗體的嵌合化或人源化形式，(iii)抗體，其具有(i)抗體的特異性，以及(iv)抗體，其包含(i)抗體的抗原結合部分或抗原結合位點。所述(i)抗體的抗原結合部分或抗原結合位點可包含(i)抗體的可變區。

本發明還涉及例如產生本文中所描述抗體的雜交瘤細胞。

優選的雜交瘤細胞是保藏于dsmz(inhoffenstr.7b，38124不倫瑞克，德國)的雜交瘤細胞，并且其具有以下命名和登記號之一：

1.gt512mumab59a，登記號dsmacc3067，保藏于2010年6月21日；

2.gt512mumab60a，登記號dsmacc3068，保藏于2010年6月21日；

3.gt512mumab61d，登記號dsmacc3069，保藏于2010年6月21日；

4.gt512mumab64a，登記號dsmacc3070，保藏于2010年6月21日；

5.gt512mumab65a，登記號dsmacc3071，保藏于2010年6月21日；

6.gt512mumab66b，登記號dsmacc3072，保藏于2010年6月21日；

7.gt512mumab67a，登記號dsmacc3073.保藏于2010年6月21日；

8.gt512mumab55a，登記號dsmacc3089，保藏于2010年8月31日；或者

9.gt512mumab89a，登記號dsmacc3090，保藏于2010年8月31日。

本發明的抗cldn6抗體可以被衍生化，與其他結合特異性相連接或共表達。在一個具體的實施方案中，本發明提供至少包含一個對cldn6的第一結合特異性(例如，抗cldn6抗體或其擬似物)和對效應細胞的第二結合特異性(例如，對fc受體(例如，fc-γ受體(例如，fc-γri)或任何其他fc受體)或者對t細胞受體(例如cd3)的結合特異性)的雙特異性或多特異性分子。

因此，本發明包括與cldn6以及與fc受體或t細胞受體(例如cd3)結合的雙特異性和多特異性分子。fc受體的實例是igg受體、fc-γ受體(fcγr)(例如，fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)和fcγriii(cd16))。還可靶向其他fc受體(例如，iga受體(例如，fcαri))。fc受體優選位于效應細胞(例如，單核細胞、巨噬細胞或活化的單個核細胞)的表面上。在一個優選的實施方案中，所述雙特異性和多特異性分子在不同于免疫球蛋白fc(例如，igg或iga)之受體結合位點的位點與fc受體結合。因此，所述雙特異性和多特異性分子的結合不被生理水平的免疫球蛋白所阻斷。

在另一個方面中，本發明的抗cldn6抗體被衍生化，與其他功能性分子(例如，其他肽或蛋白質(例如，fab′片段))相連接或共表達。例如，本發明的抗體可以與一個或更多個其他分子實體(例如，其他抗體(例如，以產生雙特異性或多特異性的抗體)、細胞毒素、細胞配體或抗原(例如，以產生免疫綴合物(例如，免疫毒素)))功能性地連接(例如，通過化學偶聯、基因融合、非共價締合等)。本發明的抗體可以與其他治療部分(例如，放射性同位素、小分子抗癌藥物、重組細胞因子或趨化因子)相連接。因此，本發明包括很多種抗體綴合物、雙特異性和多特異性分子以及融合蛋白質，它們都與表達cldn6的細胞和/或與以cldn6與其細胞表面締合為特征的細胞相結合，并且它們可用于將其他分子靶向這樣的細胞。

一般來說，對于本發明的目的而言，術語“抗體”包括本文中所描述的所有抗體衍生物，例如抗體綴合物、雙特異性和多特異性分子、以及融合蛋白質。

在另一個方面中，本發明還考慮源自非免疫球蛋白結構域的結合cldn6的蛋白質，特別是單鏈蛋白質。例如binz等(2005)naturebiotechnology23(10)：1257-1268(通過引用并入本文)中描述了這樣的結合蛋白以及用于對其進行生產的方法。要理解的是，本文中給出的關于免疫球蛋白或源自免疫球蛋白之結合分子的教導還相應地適用于源自非免疫球蛋白結構域的結合分子。特別是使用這樣的源自非免疫球蛋白結構域的結合分子可以阻斷表達所述靶標并以所述靶標與其細胞表面相締合為特征之細胞的cldn6，并因而引起本文中公開的本發明抗體的治療作用，特別是本文中公開的抑制腫瘤細胞的一種或更多種活性，例如增殖。盡管不是強制性的，可以通過例如與抗體的fc區融合而將抗體的效應功能賦予這樣的非免疫球蛋白結合分子。

通過靶向細胞所表達的以及與細胞表面締合的cldn6，本發明一般地包括疾病(特別是腫瘤疾病)的治療和/或診斷。這些方法提供對這樣的細胞的選擇性檢測和/或根除，因而使對不表達cldn6以及不以cldn6與其細胞表面締合為特征之正常細胞的不良作用最小化。用于治療或診斷的優選疾病是其中涉及表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞的疾病(例如，腫瘤疾病)，特別是癌癥疾病，例如本文中描述的那些癌癥疾病。

在一個方面中，本發明提供包含本發明抗體或抗體組合的組合物(例如，藥物和診斷組合物/試劑盒)。本發明的藥物組合物可包含可藥用載劑(carrier)，并且可任選地包含一種或更多種輔料、穩定劑等。在一個具體的實施方案中，所述組合物包含抗體的組合，所述抗體與獨特的表位結合或者具有獨特的功能特征(例如，誘導cdc和/或adcc以及誘導凋亡)。在本發明的這一實施方案中，可組合使用抗體，例如作為包含兩種或更多種抗cldn6單克隆抗體的藥物組合物而使用。例如，具有不同但互補活性的抗cldn6抗體可以在單個治療中組合以達到期望的治療效果。在一個優選的實施方案中，所述組合物包含與誘導凋亡的另一抗cldn6抗體組合的介導cdc的抗cldn6抗體。在另一個實施方案中，所述組合物包含在效應細胞存在下介導高度有效殺傷靶細胞的抗cldn6抗體，其與抑制表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞生長的另一抗cldn6抗體相組合。

本發明還包括同時或順序施用兩種或更多種本發明的抗cldn6抗體，其中優選至少一種所述抗體是嵌合的抗cldn6抗體，并且至少一種其他抗體是人抗cldn6抗體，所述抗體與相同或不同的cldn6表位相結合。優選地，首先施用本發明的嵌合cldn6抗體，隨后施用本發明的人抗cldn6抗體，其中優選長時間(即，作為維持治療)施用所述人抗cldn6抗體。

本發明的抗體、綴合物、雙特異性/多特異性分子和組合物可用于通過使細胞與有效量的抗體、綴合物、雙特異性/多特異性分子或組合物相接觸來抑制表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞的生長和/或選擇性殺傷表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞的多種方法，以抑制細胞的生長和/或殺傷細胞。在一個實施方案中，所述方法包括殺傷表達cldn6并以cldn6與其細胞表面締合為特征的細胞，任選地在效應細胞存在下，例如通過cdc、凋亡、adcc、吞噬作用或通過這些機制中的兩種或更多種的組合來進行殺傷。可使用本發明的抗體抑制或殺傷的表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞包括癌細胞。

本發明的抗體、綴合物、雙特異性/多特異性分子和組合物可用于治療和/或預防多種與表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞相關的疾病，通過向遭受此類疾病的患者施用所述抗體來實現。可被治療(例如，改善)或預防的示例疾病包括但不限于腫瘤發生性疾病(tumorigenicdisease)。可被治療和/或預防的腫瘤發生性疾病的實例包括癌疾病，例如卵巢癌(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺癌(包括小細胞肺癌(sclc)和非小細胞肺癌(nsclc)，特別是鱗狀細胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(特別是基底細胞癌和鱗狀細胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、膀胱癌(特別是移行細胞癌和乳頭狀癌)、腎癌(特別是腎細胞癌，包括明細胞腎細胞癌和乳頭狀腎細胞癌)、結腸癌、小腸癌(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎性癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌(特別是睪丸精原細胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌)、子宮癌、生殖細胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細胞腫瘤)、及其轉移形式。

在另一個方面中，本發明涉及治療或預防與表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞相關的疾病或病癥的方法，其包括向對象施用本發明的抗體、綴合物、雙特異性/多特異性分子或組合物。優選地，所述疾病或病癥是腫瘤相關的疾病，并且在一些具體的實施方案中，所述疾病或病癥選自：卵巢癌(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺癌(包括小細胞肺癌(sclc)和非小細胞肺癌(nsclc)，特別是鱗狀細胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(特別是基底細胞癌和鱗狀細胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、膀胱癌(特別是移行細胞癌和乳頭狀癌)、腎癌(特別是腎細胞癌，包括明細胞腎細胞癌和乳頭狀腎細胞癌)、結腸癌、小腸癌(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎性癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌(特別是睪丸精原細胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌)、子宮癌、生殖細胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細胞腫瘤)、及其轉移形式。cldn6優選地表達于所述細胞的表面上。

本發明可涉及使用本文中描述的藥劑和組合物用于腫瘤疾病的預防性和/或治療性治療，即用于治療患有腫瘤疾病或有腫瘤疾病發病風險的患者。在一個方面中，本發明提供用于抑制腫瘤生長的方法，其包括施用一種或更多種本文中描述的藥劑和組合物。

優選地，以這樣的方式施用本文中描述的藥劑和組合物，以使當組織或器官(例如，胎盤組織或胎盤)沒有腫瘤時，即使其中的細胞表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征，治療活性物質也不被遞送或基本不被遞送至所述組織或器官。為此，可局部施用本文中描述的藥劑和組合物。

在一個方面中，本發明提供本文中描述的抗體用于本文中描述的治療方法。在一個實施方案中，本發明提供本文中描述的藥物組合物用于本文中描述的治療方法。

在本發明的一個具體的實施方案中，另外用化療劑、輻射或者調節(例如，增強或抑制)fc受體(例如，fc-γ受體)之表達或活性的藥劑(例如，細胞因子)治療施用了所述抗體的對象。在治療過程中用于施用的典型細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(g-csf)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、干擾素-γ(ifn-γ)和腫瘤壞死因子(tnf)。除此之外，典型的治療劑還包括抗腫瘤劑，例如多柔比星、順鉑、泰素帝(taxotere)、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤(methotrexat)、吉西他濱和環磷酰胺。

在另一個方面中，本發明涉及用人cldn6或其肽片段免疫接種非人動物(例如，小鼠)以獲得抗體的免疫策略。用于免疫接種的優選的肽是選自seqidno：6、seqidno：7、seqidno：14和seqidno：15的肽，以及免疫等效肽。

可用cldn6抗原或其肽片段和/或表達cldn6或其肽片段的核酸和/或細胞的純化或富集的制備物免疫接種野生型以及轉基因的非人動物。優選地，所述轉基因非人動物能夠通過進行v-d-j重組和同種型轉換產生多同種型的抗cldn6的人單克隆抗體(例如，igg、iga和/或igm)。可通過例如經典的或非經典的同種型轉換而發生同種型轉換。

因此，在另一個方面中，本發明提供來自上文中所描述的非人動物中的分離的b細胞。可隨后通過與永生化細胞融合而使所述分離的b細胞永生化以提供本發明的抗體來源(例如，雜交瘤)。這樣的雜交瘤(即，其產生本發明的抗體)也包括在本發明的范圍之內。

在另一個方面中，本發明涉及用于診斷、檢測或監控腫瘤疾病的方法，其包括使用本發明抗體檢測和/或測定從患者中分離的生物樣品中cldn6的量或表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞的量。所述生物樣品可以從患有腫瘤疾病、懷疑患有或發生腫瘤疾病或者具有腫瘤疾病之潛力的患者中分離。

在根據本發明的用于診斷、檢測或監控腫瘤疾病的方法的一個實施方案中，生物樣品和/或對照/參比樣品來自與受腫瘤疾病所影響的要診斷、檢測或監控的組織或器官相對應的組織或器官，例如要診斷、檢測或監控的腫瘤疾病是卵巢癌，則生物樣品和/或對照/參比樣品是卵巢組織。本文中描述了這樣的組織和器官，例如與不同的腫瘤疾病和癌癥一起描述。

在根據本發明的用于診斷、檢測或監控腫瘤疾病的方法的一個實施方案中，所述生物樣品來自這樣的組織或器官，當所述組織或器官沒有腫瘤時，其中的細胞基本不表達cldn6以及基本不以cldn6與其細胞表面相締合為特征。優選地，所述組織不是胎盤組織。

一般來說，相對于參比水平來比較生物樣品中靶分子的水平，其中與所述參比水平的偏差指示腫瘤疾病在對象中的存在和/或階段。所述參比水平可以是在對照樣品(例如，來自健康的組織或對象)中測定的水平或者來自健康對象的中位水平。與所述參比水平的“偏差”表示任何顯著改變，例如升高或降低至少10％、20％或30％，優選至少40％或50％或者甚至更高。優選地，在所述生物樣品中存在cldn6或表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞或者所述生物樣品中cldn6或表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞的量相對于參比水平升高指示腫瘤疾病的存在。

一般來說，本發明的方法中的檢測和/或定量涉及使用與靶分子特異性結合的標記抗體。

在一個具體的方面中，本發明涉及用于檢測腫瘤疾病(即，測定位置或位點(例如，具體的組織或器官))的方法，其包括向患者施用偶聯了可檢測標記物的本發明抗體。在所述患者中標記組織或器官可指示在所述組織或器官中存在腫瘤疾病或有發生腫瘤疾病的風險。

如本文中示例的那樣，本發明的抗體可直接從表達抗體的雜交瘤獲得，或者可在宿主細胞(例如，cho細胞或淋巴細胞)中克隆和重組表達。宿主細胞的其他實例是微生物(例如，大腸桿菌(e.coli))和真菌(例如，酵母)。或者，可在轉基因的非人動物或植物中重組地產生它們。然而，本發明還考慮這樣的一些實施方案，其中通過使用本文中公開的免疫策略在患者中原位免疫或接種來產生抗體。

本發明還涉及核酸，所述核酸包含編碼本文中描述的抗體或其部分(例如，抗體鏈)的基因或核酸序列。所述核酸可包含于載體(vector)(例如，質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者例如常規地用于基因工程中的其他載體)中。所述載體可包含其他基因，例如標志物基因，其允許在合適的宿主細胞和在合適的條件下選擇所述載體。此外，所述載體可包含表達控制元件，其允許在合適的宿主中適當地表達編碼區。這樣的控制元件是技術人員已知的，并且可包括啟動子、剪接盒(splicecassette)和翻譯起始密碼子。

優選地，本發明的核酸與上文中允許在真核或原核細胞中表達的表達控制序列可操作地連接。確保在真核或原核細胞中表達的控制元件是本領域技術人員公知的。

用于構建根據本發明的核酸分子的方法，用于構建包含上述核酸分子之載體的方法，用于將載體引入到合適地選擇的宿主細胞中的方法，用于引起或實現表達的方法是現有技術中公知的。

本發明的另一個方面涉及包含本文中所公開的核酸或載體的宿主細胞。

通過以下的詳細描述和權利要求，本發明的其他特征和優勢將是顯而易見的。

附圖說明

圖1.cldn3、cldn4、cldn6和cldn9的序列比對。

圖2.從經免疫接種以產生cldn6特異性抗體的小鼠中獲得的血清的免疫熒光分析。

(a)用抗cldn6單克隆小鼠抗體(r&dsystems，mab3656)探查分別以編碼人cldn6和gfp的核酸共轉染的未固定的cho-k1細胞。cldn6位于經轉染細胞的質膜，并且可在活細胞上被特異性抗體所靶向。

(b)來自以其為基礎產生雜交瘤f3-6c3-h8的小鼠的血清含有與未固定的cho-k1細胞表面上的cldn6相結合的抗體，所述cho-k1細胞是以編碼人cldn6和gfp的核酸共轉染的。

圖3.用于測定hek293t細胞中密蛋白之內源性表達的western印跡分析。

使用可商購的抗-cldn3(a)(invitrogen，catno.34-1700)、抗-cldn4(a)(zymed，32-9400)、抗-cldn6(a)(arp，01-8865)和抗-cldn9(a)(santacruz，sc-17672)抗體，通過western印跡測試分別以編碼cldn3、cldn4、cldn6和cldn9的核酸轉染的或者模擬轉染的hek293t細胞的蛋白質裂解液。所述抗體僅在各自的hek293t轉化體中檢出與抗體對應的靶標的表達。在未轉染的hek293t細胞中，未觀察到這些密蛋白的任何內源性表達。

圖4.用于測定可商購抗cldn抗體之特異性的流式細胞術分析。

通過流式細胞術測定可商購的抗cldn抗體與分別轉染了編碼cldn3、cldn4、cldn6和cldn9之核酸的或者未轉染的hek293t細胞的結合。僅可商購的抗cldn3抗體對其靶標是特異性的。

圖5.用于測定根據本發明制備的抗cldn抗體之特異性的流式細胞術分析。

通過流式細胞術測定來自單克隆的雜交瘤細胞亞克隆之上清液中的抗體與編碼cldn6、cldn3、cldn4或cldn9的載體和編碼熒光標志物的載體共轉染的hek293t細胞的結合。

(a)來自單克隆的雜交瘤亞克隆f3-6c3-h8之上清液中的抗體與轉染了cldn6的細胞(但不與分別轉染了cldn3、cldn4和cldn9的細胞)特異性地結合。相反，來自單克隆的雜交瘤亞克隆f4-4f7-f2之上清液中的抗體與轉染了cldn6或cldn9的細胞結合。來自單克隆雜交瘤亞克隆f3-6c3-h8之上清液中的抗體還與轉染了cldn6的(i143v)-snp變體的細胞結合。

(b)來自單克隆雜交瘤亞克隆f3-7b3-b4之上清液中的抗體與轉染了cldn6、cldn3或cldn9的細胞結合。來自單克隆雜交瘤亞克隆f3-3f7-a5之上清液中的抗體與轉染了cldn6、cldn4或cldn9的細胞結合。

圖6.抗cldn6鼠單克隆抗體mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a的結合特異性。

使用瞬時表達相應的人密蛋白的hek293t細胞，通過流式細胞術分析抗cldn6抗體與人cldn6、3、4、9和cldn6snp(單核苷酸多態性)變體i143v的結合。與熒光標志物共轉染hek293t以區分未轉染的(q1和q3群)和轉染的(q2和q4群)細胞。所使用的抗體濃度是飽和結合cldn6的濃度(25μg/ml)。用抗人密蛋白-6(r&dsystems，mab3656)、人密蛋白-3(r&dsystems，mab4620)和人密蛋白-4(r&dsystems，mab4219)的可商購單克隆抗體確證人cldn6、3、4、9和cldn6-snp(i143v)的表達。

圖7.抗cldn6鼠單克隆抗體mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a的相對親和力。

通過流式細胞術分析抗cldn6抗體與穩定表達于hek293細胞表面上的人cldn6之結合以測定相對親和力。在飽和結合實驗中，以抗體的濃度對facs信號(熒光強度的中位值)作圖。通過非線性回歸計算ec50(在平衡時與一半的結合位點結合的抗體濃度)。cldn6特異性的抗體mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a表現出非常低的ec50值(ec50200至500ng/ml)，并且在低濃度達到飽和結合。

圖8.抗cldn6鼠單克隆抗體mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a的補體依賴的細胞毒作用(cdc)活性。

使用檢測未裂解細胞中內源性atp的螢光素酶依賴的測定分析抗cldn6抗體的cdc活性。因此，用不同濃度的mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a處理穩定表達人cldn6的cho-k1細胞。mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a表現出劑量依賴的cdc活性，并在低濃度下誘導cdc。

圖9.抗cldn6鼠單克隆抗體mumab65a和66b對內源性表達cldn6之nec8和nec8lvts254(cldn6敲低(knock-down))細胞的補體依賴的細胞毒作用(cdc)。

抗cldn6抗體mumab65a和66b以劑量依賴的方式誘導對nec8細胞的cdc。通過使用nec8lvts254細胞(cldn6敲低)證明mumab65a和66b的靶標特異性。

圖10.在使用植入腫瘤細胞系nec8之小鼠的早期治療異種移植模型中，mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a的治療作用。該模型使用無胸腺的nude-foxn1^nu小鼠中的內源性表達cldn6的nec8異種移植物。與鹽水對照組相比，在植入nec8細胞的小鼠中，mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a顯示出腫瘤生長抑制。

圖11.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab61d、64a、67a和89a的結合特異性。

使用穩定表達相應人密蛋白的hek293細胞，通過流式細胞術分別分析抗cldn6抗體與人cldn6、3、4和9的結合。所使用的抗體濃度是飽和結合的濃度(25μg/ml)。分別用可商購的抗人密蛋白-3(r&dsystems，mab4620)和人密蛋白-4(r&dsystems，mab4219)的單克隆抗體以及cldn6/9反應性鼠單克隆抗體mumab5f2d2確證人cldn3、4、6和9的表達。在沒有一抗(primaryantibody)的相同條件下進行陰性對照。

圖12.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab61d、64a、67a和89a與hek293-cldn6細胞的相對親和力。

通過流式細胞術分析抗cldn6抗體與hek293細胞表面上穩定表達的人cldn6的結合以測定相對親和力。在飽和結合實驗中，將抗體的濃度相對于facs信號(熒光強度的中位值)作圖。通過非線性回歸計算ec50(在平衡時與一半的結合位點結合的抗體濃度)。cldn6特異性的抗體chimab64a和89a表現出非常低的ec50值(ec50450～600ng/ml)，并且在低濃度達到飽和結合。chimab67a和61d分別顯示低的(ec501000ng/ml)和中等的(ec502300ng/ml)ec50值。

圖13.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab61d、64a、67a和89a對nec8細胞的相對親和力。

為測定抗cldn6抗體與內源性表達人cldn6之腫瘤細胞的結合親和力，通過流式細胞術分析所述抗體與睪丸癌細胞系nec8的結合。cldn6特異性抗體chimab64a和89a表現出非常低的ec50值(ec50600～650ng/ml)，并且在低濃度下達到飽和結合，而chimab61d和67a分別表現出中等的(ec501700ng/ml)和高的(ec506100ng/ml)ec50值。

圖14.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab61d、64a、67a和89a對ov90細胞的相對親和力。

為測定抗cldn6抗體與內源性表達人cldn6之腫瘤細胞的結合親和力，通過流式細胞術分析所述抗體與卵巢癌細胞系ov90的結合。cldn6特異性抗體chimab64a和89a表現出非常低的ec50值(ec50550～600ng/ml)，并且在低濃度下達到飽和結合。chimab61d和67a顯示中等的ec50值(分別為ec501500ng/ml和ec502300ng/ml)。

圖15.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab61d、64a、67a和89a對nec8野生型和nec8敲低細胞的補體依賴的細胞毒作用(cdc)活性。

使用檢測未裂解細胞中內源性atp的螢光素酶依賴的測定分析抗cldn6抗體的cdc活性。因此，用不同濃度的chimab61d、64a、67a和89a處理異位表達螢光素酶的nec8野生型細胞(nec8lvts277)。在nec-8細胞上，chimab61d、64a、67a和89a以劑量依賴的方式表現出cdc活性，而在nec-8cldn6敲低細胞(nec8lvts254)中，這些抗體都沒有誘導非特異性的細胞裂解。該結果證明了chimab61d、64a、67a和89a的靶標特異性效應功能。

圖16.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab61d、64a、67a和89a對nec8野生型和nec8敲低細胞的抗體依賴性細胞的細胞毒作用(adcc)活性。

使用檢測未裂解細胞中內源性atp的螢光素依賴的測定分析抗cldn6抗體的adcc活性。因此，用不同濃度的chimab61d、64a、67a和89a處理nec-8野生型細胞(nec8lvts277)。chimab61d、64a、67a和89a表現出劑量依賴的adcc活性，并且甚至在低抗體濃度下誘導adcc。為了證明靶標特異性，使用了具有穩定cldn6敲低的nec8細胞(nec8lvts254)。

圖17.在使用植入腫瘤細胞系nec8之小鼠的早期治療異種移植模型中抗cldn6鼠單克隆抗體mumab61d、64a和67a的治療性長期作用。

該模型使用無胸腺的nude-foxn1^nu小鼠中的內源性表達cldn6的nec8異種移植物。用cldn6特異性的抗體治療小鼠46天。治療之后，監控腫瘤生長60天。即便是在終止免疫治療之后，用鼠單抗mumab61d、64a和67a治療的小鼠沒有顯示出任何腫瘤生長。

圖18.在使用植入腫瘤細胞系nec8之小鼠的早期治療異種移植模型中抗cldn6鼠單克隆抗體mumab89a的治療性作用。

該模型使用無胸腺的nude-foxn1^nu小鼠中的內源性表達cldn6的nec8異種移植物。散點表示無胸腺的nude-foxn1^nu小鼠中nec8異種移植物的早期治療過程中不同時間點時所植入腫瘤的體積。與鹽水對照組相比，mumab89a在植入nec8細胞的小鼠中顯示出腫瘤生長抑制(a)。分別用pbs(作為對照)和cldn6特異性抗體治療小鼠47天。再監控腫瘤生長51天。在研究結束時，與pbs對照相比，在以mumab89a治療的小鼠中沒有可檢出的腫瘤(b)。

圖19.在使用植入腫瘤細胞系nec8之小鼠的晚期治療異種移植模型中抗cldn6鼠單克隆抗體mumab64a的治療性作用。

散點表示無胸腺的nude-foxn1^nu小鼠中nec8異種移植物的晚期治療過程中不同時間點時所植入腫瘤的體積。與抗體和鹽水對照組相比，用鼠單克隆抗cldn6抗體mumab64a的免疫治療顯示對實體nec8異種移植物之腫瘤生長的抑制。

圖20.在使用植入腫瘤細胞系nec8之小鼠的晚期治療異種移植模型中抗cldn6鼠單克隆抗體mumab64a的治療性長期作用。

植入15天之后，用cldn6特異性抗體mumab64a治療小鼠45天。再監控腫瘤生長49天(a)。存活圖顯示用cldn6特異性抗體mumab64a治療之小鼠的存活延長(b)。

圖21.在使用植入腫瘤細胞系nec8之小鼠的晚期治療異種移植模型中，抗cldn6鼠單克隆抗體mumab61d、67a和89a的治療性作用。散點表示晚期nec8異種移植物的治療過程中不同時間點時所植入nec8腫瘤的體積。與鹽水和抗體對照組相比，用鼠單克隆抗cldn6抗體mumab61d、67a和89a實現了對腫瘤生長的抑制。

圖22.在使用植入腫瘤細胞系nec8之小鼠的晚期治療異種移植模型中，抗cldn6鼠單克隆抗體mumab61d、67a和89a的治療性長期作用。

植入之后17天，用cldn6特異性抗體mumab61d、67a和89a治療小鼠42天。再監控腫瘤生長49天(a)。存活圖顯示用cldn6特異性抗體mumab61d和67a治療之小鼠的存活延長(b)。

圖23.在使用植入腫瘤細胞系nec8野生型和具有穩定cldn6敲低的nec8細胞之小鼠的晚期治療異種移植模型中抗cldn6鼠單克隆抗體mumab64a和89a的治療性作用。

mumab64a和89a僅在植入nec8野生型而非植入nec8cldn6敲低細胞之小鼠中顯示治療性作用，這證明了抗體的體內靶標特異性。

圖24.chimmab61d、64a、67a和89a的高分辨率表位作圖。

丙氨酸突變體被命名為“野生型殘基號丙氨酸”或在野生型丙氨酸的情況下命名為“野生型殘基號甘氨酸”，其中以單個字母的代碼給出氨基酸。cldn6的第一細胞外結構域的氨基酸f35、g37、s39以及可能的t33對于與cldn6特異性嵌合抗體chimab61d、64a、67a和89a的相互作用是重要的。殘基i40對于chimab89a的結合是至關重要的，并且它有助于chimab61d和67a的結合。此外，cldn6的第二細胞外結構域的l151有助于與chimab67a的相互作用。盡管免疫熒光實驗確證了cldn6突變體p28a、w30a、g49a、l50a、w51a、c54a和c64a的表達，但它們沒有顯示膜染色。因此，我們不能排除我們的抗體與這些氨基酸的相互作用。總之，在此定義的表位與我們使用cldn6的ec1結構域之dna和肽的免疫策略相一致。

圖25.本發明的cldn6特異性抗體重鏈可變區氨基酸序列的比對。以方框描畫出cdr序列(hcdr1、hcdr2和hcdr3)的輪廓。

圖26.本發明的cldn6特異性抗體輕鏈可變區氨基酸序列的比對。以方框描畫出cdr序列(lcdr1、lcdr2和lcdr3)的輪廓。

圖27.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs的結合特異性。

使用分別經人cldn6、3、4和9瞬時轉染的hek293t細胞通過流式細胞術分析抗cldn6的結合特異性。為了區分轉染的與未轉染的細胞群體，用熒光標志物作為報道分子共轉染細胞。所使用的抗體濃度是飽和結合的濃度(100μg/ml)。分別用可商購的抗人密蛋白-3(r&dsystems，mab4620)和抗人密蛋白-4(r&dsystems，mab4219)的單克隆抗體以及cldn6/9反應性鼠單克隆抗體mumab5f2d2確證人cldn3、4、6和9的表達。嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs分別顯示出與cldn6結合而不與cldn3、4和9相互作用。

圖28.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs對hek293-cldn6細胞的相對結合親和力。

通過流式細胞術分析抗cldn6抗體與在hek293細胞表面上穩定表達的人cldn6的結合以測定相對親和力。在飽和結合實驗中，以抗體的濃度對facs信號(熒光強度的中位值)作圖。通過非線性回歸計算ec50(在平衡時與一半的結合位點結合的抗體濃度)。cldn6特異性抗體表現出類似低的ec50值，并且在低濃度達到飽和結合。

圖29.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs對nec8細胞的相對結合親和力。

為測定抗cldn6抗體與內源性表達人cldn6之腫瘤細胞的結合親和力，通過流式細胞術分析所述抗體與睪丸癌細胞系nec8的結合。與cldn6特異性抗體chimab64a、mab206-subg和mab206-subs相比，輕鏈組合變體mab206-lcc對nec8細胞顯示出三倍更強的結合親和力。在所有的情況下，在低濃度達到飽和結合。

圖30.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs對ov90細胞的相對結合親和力。

通過流式細胞術分析抗cldn6抗體與人卵巢癌細胞系ov90的結合親和力。cldn6特異性抗體表現出類似低的ec50值。輕鏈組合變體mab206-lcc顯示出與ov90細胞最強的結合。

圖31a.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc和mab206-subg對nec8野生型細胞和nec8敲低細胞的補體依賴的細胞毒作用(cdc)活性。

使用檢測未裂解細胞中內源性atp的螢光素酶依賴的測定分析抗cldn6抗體的cdc活性。因此，用不同濃度的chimab64a、mab206-lcc和mab206-subg處理異位表達螢光素酶的nec8野生型細胞。在nec-8細胞中，抗體以劑量依賴的方式表現出cdc活性，而在nec-8cldn6敲低細胞中，這些抗體都沒有誘導非特異性的細胞裂解。該結果證明了chimab64a、mab206-lcc和mab206-subg的靶標特異性效應功能。

圖31b.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs對nec8細胞的補體依賴的細胞毒作用(cdc)活性。

抗體以劑量依賴的方式表現出cdc活性。與chimab64a相比，氨基酸替換變體mab206-subg和mab206-subs對nec8細胞顯示出類似的cdc。

圖32a.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs對nec8和ov90細胞的抗體依賴性細胞的細胞毒作用(adcc)活性。

使用檢測未裂解細胞中內源性atp的螢光素酶依賴的測定分析抗cldn6抗體的adcc活性。因此，用不同濃度的抗cldn6的嵌合抗體處理nec8和ov90細胞。所有的抗體在兩種腫瘤細胞系中顯示出劑量依賴性adcc活性并且甚至在低抗體濃度下誘導adcc。

圖32b.抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc和mab206-subg對nec8野生型和nec8敲低細胞的抗體依賴性細胞的細胞毒作用(adcc)活性。

為了證明靶標特異性，使用了具有穩定cldn6敲低的nec8細胞。

圖33.在使用植入腫瘤細胞系nec8之小鼠的晚期治療異種移植模型中抗cldn6嵌合單克隆抗體mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs的治療作用。

模型使用了無胸腺nude-foxn1^nu小鼠中的nec8異種移植物。植入17天之后，用cldn6特異性抗體mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs治療小鼠并監控腫瘤生長。散點表示小鼠中nec8異種移植物的晚期治療過程中不同時間點時所植入腫瘤的體積。與抗體對照組相比，嵌合單克隆抗cldn6抗體mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs顯示出腫瘤生長的抑制。

圖34.在使用植入腫瘤細胞系nec8之小鼠的晚期治療異種移植模型中抗cldn6嵌合單克隆抗體mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs的治療作用。

與圖33相比，生長曲線更詳細地顯示出，嵌合單克隆抗cldn6抗體能夠抑制腫瘤生長(a)。存活圖顯示用cldn6特異性抗體治療之小鼠的存活延長(b)。

圖35.chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs的高分辨率表位作圖。

丙氨酸突變體被命名為“野生型殘基號丙氨酸(wildtyperesiduenumberalanine)”，其中以單個字母的代碼給出氨基酸。cldn6的第一細胞外結構域的氨基酸f35、g37、s39以及可能的t33對于與cldn6特異性嵌合抗體的相互作用是重要的。chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs顯示出相同的結合形式。

圖36.在使用植入腫瘤細胞系nec8之小鼠的轉移異種移植模型中抗cldn6鼠單克隆抗體mumab64a的治療作用。

在轉移模型中將nec8細胞注入無胸腺nude-foxn1^nu小鼠尾靜脈中。植入3天之后，用cldn6特異性抗體mumab64a治療小鼠。8周之后制備肺并且通過pcr分析腫瘤負荷。與pbs對照組相比，鼠單克隆抗cldn6抗體mumab64a顯示出抑制腫瘤生長。

圖37.使用單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc和mab206-subg對人癌組織和正常組織的免疫組織化學染色。

與正常組織相比，在來自卵巢癌和睪丸癌的組織切片上觀察到強的均勻的染色。檢測了惡性上皮細胞群體的非常強的膜染色，而鄰近的基質上皮細胞和非惡性上皮細胞未被染色。這些結果清楚地顯示出，我們的cldn6特異性抗體與來源于腫瘤患者的惡性細胞特異性結合。(解釋：被抗體染色的組織數目/被分析組織的數目)。

術語的定義

為了使本發明可被更容易地理解，首先定義了某些術語。在整個詳細描述中闡述另一些定義。

在整個本說明書和所附的權利要求書中，除非上下文中另外要求，詞語“包括/包含(comprise)”以及變化形式將被理解為意指包括所陳述的數目、整數或步驟或者數目、整數或步驟的組，但不排除任何其他數目、整數或步驟或者數目、整數或步驟的組。除非本文中另外指明或者與上下文明確地相矛盾，描述本發明的上下文中(尤其是在權利要求書的上下文中)使用的沒有數量詞修飾的名詞要解釋為一個/種或更多個/種。本文中數值的引用范圍僅是意在充當單獨參照落入該范圍的每個分別的數值的快捷方法。除非本文中另外指明，每個單獨的值均如同其在本文中被單獨引用而被并入本說明書。除非本文中另外指明或者與上下文明確地相矛盾，可以以任何合適的順序進行本文中所描述的所有方法。除非另外要求，本文中提供的任何和全部實施例或示例性語言(例如，“例如”)的使用僅意在更好地舉例說明本發明，并不對本發明的范圍進行限制。本說明書中沒有應當被解釋為表明對實施本發明至關重要的任何不要求保護之要素的語言。

密蛋白是一個蛋白質家族，是緊密連接的最重要組分，所述緊密連接建立控制上皮細胞之間的胞間空間中的分子流的細胞旁屏障(paracellularbarrier)。密蛋白是4次跨膜的跨膜蛋白質，其n端和c端均位于胞質中。第一細胞外環由平均53個氨基酸組成，而第二細胞外環由約24個氨基酸組成。cldn6和cldn9是cldn家族中最相似的成員。

本文中使用的術語“cldn”意為密蛋白，并且包括cldn6、cldn9、cldn4和cldn3。優選地，cldn是人cldn。

術語“cldn6”優選地表示人cldn6，并且特別是表示(i)核酸，其包含編碼seqidno：2之氨基酸序列或編碼seqidno：8之氨基酸序列的核酸序列，例如，包含seqidno：1之核酸序列的核酸，或者(ii)蛋白質，其包含seqidno：2之氨基酸序列或包含seqidno：8之氨基酸序列。cldn6的第一細胞外環優選地包含seqidno：2中所示或seqidno：8中所示氨基酸序列的氨基酸28至80，更優選氨基酸28至76，例如，seqidno：7中所示的氨基酸序列。cldn6的第二細胞外環優選地包含seqidno：2中所示氨基酸序列或seqidno：8中所示氨基酸序列的氨基酸138至160，優選氨基酸141至159，更優選氨基酸145至157，例如seqidno：6中所示的氨基酸序列。所述第一和第二細胞外環優選地形成cldn6的胞外部分。

術語“cldn9”優選地表示人cldn9，并且特別是表示(i)核酸，其包含編碼seqidno：9之氨基酸序列的核酸序列，或者(ii)蛋白質，其包含seqidno：9之氨基酸序列。cldn9的第一細胞外環優選地包含seqidno：9中所示氨基酸序列的氨基酸28至76。cldn9的第二細胞外環優選地包含seqidno：9中所示氨基酸序列的氨基酸141至159。所述第一和第二細胞外環優選地形成cldn9的胞外部分。

術語“cldn4”優選地表示人cldn4，并且特別是表示(i)核酸，其包含編碼seqidno：10之氨基酸序列的核酸序列，或者(ii)蛋白質，其包含seqidno：10之氨基酸序列。cldn4的第一細胞外環優選地包含seqidno：10中所示氨基酸序列的氨基酸28至76。cldn4的第二細胞外環優選地包含seqidno：10中所示氨基酸序列的氨基酸141至159。所述第一和第二細胞外環優選地形成cldn4的胞外部分。

術語“cldn3”優選地表示人cldn3，并且特別是表示(i)核酸，其包含編碼seqidno：11之氨基酸序列的核酸序列，或者(ii)蛋白質，其包含seqidno：11之氨基酸序列。cldn3的第一細胞外環優選地包含seqidno：11中所示氨基酸序列的氨基酸27至75。cldn3的第二細胞外環優選地包含seqidno：11中所示氨基酸序列的氨基酸140至158。所述第一和第二細胞外環優選地形成cldn3的胞外部分。

上文中描述的cldn序列包括所述序列的任何變體，特別是突變體，剪接變體，構象，同種型，等位基因變體，物種變體和物種同源物，特別是天然存在的變體。等位基因變體表示基因正常序列的改變，其重要性通常是不清楚的。完整的基因序列通常鑒定出給定基因的很多等位基因變體。物種同源物是給定核酸或氨基酸序列的具有不同物種來源的核酸或氨基酸序列。術語“cldn”應包括(i)cldn剪接變體，(ii)cldn轉錄后修飾變體，特別是包括具有不同糖基化(例如，n-糖基化狀態)的變體，(iii)cldn構象變體，(iv)cldn癌相關的和cldn非癌相關的變體。優選地，cldn以其天然構象存在。

已發現cldn6表達于例如卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌、黑色素瘤、頭頸癌、肉瘤、膽管癌、腎細胞癌和膀胱癌。cldn6是特別優選的靶標，用于預防和/或治療卵巢癌(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺癌(包括小細胞肺癌(sclc)和非小細胞肺癌(nsclc)，特別是鱗狀細胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(特別是基底細胞癌和鱗狀細胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、膀胱癌(特別是移行細胞癌和乳頭狀癌)、腎癌(特別是腎細胞癌，包括明細胞腎細胞癌和乳頭狀腎細胞癌)、結腸癌、小腸癌(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎性癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌(特別是睪丸精原細胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌)、子宮癌、生殖細胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細胞腫瘤)、及其轉移形式。在一個實施方案中，與cldn6表達相關的癌疾病選自卵巢癌、肺癌、轉移性卵巢癌和轉移性肺癌。優選地，所述卵巢癌是癌或腺癌。優選地，所述肺癌是癌或腺癌，并且優選地是細支氣管癌，例如細支氣管癌或細支氣管腺癌。在一個實施方案中，所述與cldn6表達相關的腫瘤細胞是此類癌的細胞。

術語“部分(portion)”是指級分(fraction)。對于具體結構(例如氨基酸序列或蛋白質)，術語其“部分”可表示所述結構的連續或不連續級分。優選地，氨基酸序列的部分包含所述氨基酸序列之氨基酸的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、優選至少40％、優選至少50％、更優選至少60％、更優選至少70％、甚至更優選至少80％以及最優選至少90％。優選地，如果所述部分是不連續的級分，所述不連續級分是由結構的2、3、4、5、6、7、8或更多個部分構成，每個部分是連續的結構元件。例如，氨基酸序列的不連續級分可由所述氨基酸序列的2、3、4、5、6、7、8或更多個(優選不超過4個)部分構成，其中每個部分優選地包含所述氨基酸序列的至少5個連續的氨基酸、至少10個連續的氨基酸、優選至少20個連續的氨基酸、優選至少30個連續的氨基酸。

術語“部分(part)”和“片段(fragment)”在本文中可互換使用，并且是指連續的元件。例如，結構(例如氨基酸序列或蛋白質)的部分是指所述結構的連續元件。結構的部分(portion)、部分(part)或片段(fragment)優選地包含所述結構的一個或更多個功能特征。例如，表位或肽的部分(portion)、部分(part)或片段(fragment)優選地與從其來源的表位或肽免疫等效。

在本發明的情況下，術語“cldn的胞外部分”是指cldn朝向細胞外空間的部分，并優選地可從所述細胞的外側接近，例如通過位于細胞外的抗體而接近。優選地，該術語是指cldn的一個或更多個細胞外環或其部分或者任何其他胞外部分(所述其他胞外部分優選地是對所述cldn特異性的)。優選地，所述部分包含至少5、至少8、至少10、至少15、至少20、至少30或至少50個或者更多個氨基酸。

術語“與細胞表面相締合的cldn”被理解為表示天然的cldn，即非變性的、優選天然折疊狀態的cldn。優選地，術語“與細胞表面相締合的cldn”意為cldn與所述細胞的質膜相締合并位于所述質膜，其中cldn的至少一部分(優選胞外部分)朝向所述細胞的細胞外空間，并且可從所述細胞的外側接近，例如通過位于細胞外的抗體接近。所述締合可以是直接或間接的。例如，所述締合可以是通過一個或更多個跨膜結構域、一個或更多個脂質錨，和/或通過與見于細胞質膜外小葉(outerleaflet)的任何其他蛋白質、脂質、糖或其他結構的相互作用。例如，與細胞表面締合的cldn可以是具有胞外部分的跨膜蛋白質(即，整合膜蛋白)或者可以是通過與其他蛋白質(其為跨膜蛋白質)相互作用而與細胞表面相締合的蛋白質。

如果cldn6位于所述細胞的表面并且可被添加至細胞的cldn6特異性的抗體接近并結合，則cldn6與細胞表面相締合。在一些優選的實施方案中，以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞是表達cldn6的細胞。要理解的是，在細胞表達cldn6的情況下，與所述細胞表面相締合的cldn6可僅是所表達的cldn6的一部分。

術語“帶有cldn的細胞”優選地意為所述細胞在其表面上帶有cldn，即cldn與所述細胞的表面相締合。

按照現有技術中通常的意義使用“細胞表面”或“細胞的表面”，并且因此包括可被蛋白質和其他分子接近并結合的細胞的外側。

詞語“表達于細胞表面上的cldn”意為細胞所表達的cldn與所述細胞的表面相締合。

根據本發明，如果表達和締合水平低于胎盤細胞或胎盤組織中的表達和締合，則cldn6基本不表達于細胞中并且基本不與細胞表面相締合。優選地，表達和締合的水平低于胎盤細胞或胎盤組織中表達和締合的10％，優選低于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％，或者甚至更低。優選地，如果表達和締合的水平超過非腫瘤發生性、非癌性的組織(除了胎盤組織之外)中的表達和締合水平的2倍(優選1.5倍)并且優選地不超過所述非腫瘤發生性、非癌性的組織中的表達和締合水平，則cldn6基本不表達于細胞中并且基本不與細胞表面相締合。優選地，如果表達或締合水平低于檢出限和/或如果表達或締合水平太低而使添加至細胞的cldn6特異性抗體無法結合，則cldn6基本不表達于細胞中并且基本不與細胞表面相締合。

根據本發明，如果表達和締合水平超過非腫瘤發生性、非癌性的組織(除了胎盤組織之外)中的表達和締合水平，優選超過2倍，優選10倍、100倍、1000倍或10000倍，則cldn6表達于細胞中并且與細胞表面相締合。優選地，如果表達和締合水平高于檢出限和/或如果表達和締合水平足夠高以使添加至細胞的cldn6特異性抗體結合，則cldn6表達于細胞中并且與細胞表面相締合。優選地，表達于細胞中的cldn6表達或暴露于所述細胞的表面上。

術語“膜筏(raft)”是指位于細胞質膜的外小葉區域中的富含鞘脂和膽固醇的膜微域(microdomain)。某些蛋白質與這樣的結構域相締合的能力及其形成“聚集體”或“焦點聚集體(focalaggregate)”的能力可影響蛋白質的功能。例如，被本發明的抗體結合之后，cldn6分子轉位到這樣的結構中，在質膜中產生高密度的cldn6抗原-抗體復合物。這樣的高密度的cldn6抗原-抗體復合物可使cdc過程中的補體系統有效活化。

根據本發明，術語“疾病”是指任何病理狀態，包括癌癥，特別是本文中所描述形式的癌癥。

根據本發明，“與表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞相關的疾病”意為與健康組織或器官中的狀態相比，病態的組織或器官的細胞中的表達和締合優選地升高。升高是指升高至少10％，特別是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或者甚至更高。在一個實施方案中，表達以及與細胞表面的締合僅見于病態的組織，而健康組織中的表達被抑制。根據本發明，與表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞相關的疾病包括腫瘤疾病，例如癌疾病。此外，根據本發明，腫瘤疾病(例如癌疾病)優選是這樣的疾病，其中腫瘤細胞或癌細胞表達cldn6并且以cldn6與其細胞表面相締合為特征。

本文中使用的“腫瘤疾病”、“腫瘤相關疾病”或“腫瘤發生性疾病”包括以異常調節的細胞生長、增殖、分化、黏附和/或遷移為特征的疾病，其可導致腫瘤和/或腫瘤轉移的產生或產生所述腫瘤和/或腫瘤轉移的趨勢。“腫瘤細胞”意為通過迅速的、不可控的細胞增殖而生長并且在引起該新生長的刺激消除之后繼續生長的異常細胞。

“腫瘤”意為通過快速的、不可控的細胞增殖而生長的并且在引起該新生長的刺激消除之后繼續生長的異常的細胞群或組織。腫瘤表現為部分或完全缺乏結構性組織(structrualorganization)和與正常組織的功能性協調，并且通常形成獨特的組織塊，所述腫瘤可以是良性的、惡化前的(pre-malignant)或惡性的。

優選地，根據本發明的“腫瘤疾病”、“腫瘤相關疾病”或“腫瘤發生性疾病”是癌疾病(即，惡性疾病)，并且腫瘤細胞是癌細胞。優選地，“腫瘤疾病”、“腫瘤相關疾病”或“腫瘤發生性疾病”以表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞為特征，并且腫瘤細胞表達cldn6并且以cldn6與其細胞表面締合為特征。

表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞優選地是腫瘤細胞或癌細胞，優選本文中描述的腫瘤和癌的腫瘤細胞或癌細胞。優選地，這樣的細胞不是胎盤細胞。

根據本發明的優選的癌疾病或癌癥選自：卵巢癌(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤)、肺癌(包括小細胞肺癌(sclc)和非小細胞肺癌(nsclc)，特別是鱗狀細胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(特別是基底細胞癌和鱗狀細胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、膀胱癌(特別是移行細胞癌和乳頭狀癌)、腎癌(特別是腎細胞癌，包括明細胞腎細胞癌和乳頭狀腎細胞癌)、結腸癌、小腸癌(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎性癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌(特別是睪丸精原細胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌)、子宮癌、生殖細胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細胞腫瘤)、及其轉移形式。

肺癌的主要類型是小細胞肺癌(sclc)和非小細胞肺癌(nsclc)。有三種主要亞型的非小細胞肺癌：鱗狀細胞肺癌、腺癌和大細胞肺癌。腺癌占肺癌的約10％。與小細胞肺癌和鱗狀細胞肺癌(二者均傾向于位于更中心的位置)相反，這種癌通常見于肺的外周。

皮膚癌是皮膚上的惡性生長。最常見的皮膚癌是基底細胞癌、鱗狀細胞癌和黑色素瘤。惡性黑色素瘤是嚴重類型的皮膚癌。它是由色素細胞(稱為黑素細胞)的不可控生長所引起的。

根據本發明，“癌(carcinoma)”是始于器官襯里層(上皮細胞)的癌癥(cancer)。

“細支氣管癌”是肺的癌，被認為源自終末細支氣管的上皮，其中腫瘤組織沿著肺泡壁延伸，并在肺泡中以小團塊生長。在一些細胞中以及在肺泡中的物質(其還包含裸露的細胞)中可展示出黏蛋白。

“腺癌”是源自腺組織的癌癥。該組織也是稱為上皮組織的較大組織分類的一部分。上皮組織包括皮膚、腺體以及內襯于身體的腔和器官的多種其他組織。上皮在胚胎學上源自外胚層、內胚層和中胚層。被分類為腺癌的細胞不一定必需是腺體的一部分，只要他們具有分泌特征即可。這種形式的癌可發生于一些高等哺乳動物(包括人)中。分化良好的腺癌傾向于與其所來源的腺組織類似，而低分化的腺癌可以不是這樣。通過染色來自活檢的細胞，病理學家將確定腫瘤是否是腺癌或其他一些類型的癌癥。因為身體內腺體普遍存在的屬性，腺癌可源自身體的很多組織。雖然每種腺體可不分泌相同的物質，只要細胞有外分泌功能，它就可被認為是腺性的，并且它的惡性形式因而被命名為腺癌。只要有充足的時間，惡性腺癌侵襲其他組織并經常轉移。卵巢腺癌是最常見類型的卵巢癌。它包括漿液性和黏液性腺癌、明細胞腺癌和子宮內膜樣腺癌。

“囊腺癌”是表面上皮-間質腫瘤(surfaceepithelial-stromaltumor)(一種類型的卵巢癌)的惡性形式。

表面上皮-間質腫瘤是被認為源自卵巢表面上皮(改良腹膜(modifiedperitoneum))或源自異位子宮內膜或輸卵管(fallopiantube)(管)組織的一類卵巢腫瘤。該組腫瘤占所有卵巢腫瘤的絕大多數。

畸胎癌是指生殖細胞腫瘤，它是畸胎瘤與胚胎性癌或與絨毛膜癌或與這二者的混合物。絨毛膜癌是惡性的、滋養層的和侵襲性的癌，通常是胎盤的癌。它以早期血行擴散至肺為特征。

肉瘤是導致中胚層增殖的結締組織(骨、軟骨、脂肪)的癌癥。這與上皮來源的癌不同。滑膜肉瘤是罕見形式的癌癥，其通常發生在臂或腿的關節附近。它是一種軟組織肉瘤。

腎細胞癌(renalcellcarcinoma)(還稱為腎細胞癌(renalcellcancer)或腎細胞腺癌)是源自近曲小管(腎中過濾血液并除去廢物的非常小的管)之襯里的腎癌。目前，腎細胞癌是成人中最常見的腎癌類型，并且是所有生殖泌尿腫瘤中最致命的。腎細胞癌的獨特亞型是明細胞腎細胞癌和乳頭狀腎細胞癌。明細胞腎細胞癌是最常見形式的腎細胞癌。當在顯微鏡下觀察時，組成明細胞腎細胞癌的細胞表現的非常蒼白或透明。乳頭狀腎細胞癌是第二常見的亞型。這些癌癥在一些(如果不是大多數的話)腫瘤中形成小的手指樣突出(finger-likeprojection)(稱為乳頭狀突起)。

生殖細胞腫瘤是源自生殖細胞的腫瘤。生殖細胞腫瘤可以是癌性或非癌性的腫瘤。生殖細胞通常發生于性腺(卵巢和睪丸)內。源自性腺外(例如，頭中，口內，頸，骨盆；在胎兒、嬰兒和幼兒中最常見于身體中線，特別是在尾骨的尖部)的生殖細胞腫瘤可以是源自胚胎發育過程中之錯誤的出生缺陷。

兩種主要類型的生殖細胞腫瘤是精原細胞瘤和非精原細胞瘤，其中非精原細胞瘤包括：畸胎癌、胚胎性癌、卵黃囊瘤、絨毛膜癌和分化的畸胎瘤。來自非精原細胞的多數細胞系等同于胚胎性癌，即它們幾乎完全由在基礎條件下不分化的干細胞組成，盡管其中一些可以響應于分化誘導劑(例如，視黃酸)。

“轉移”意為癌細胞從其初始位置擴散至身體的其他部分。轉移的形成是非常復雜的過程，有賴于惡性細胞從原發腫瘤脫離，侵襲細胞外基質，穿透內皮基底膜以進入體腔和血管，并隨后通過血液運輸，然后浸潤靶器官。最終，新腫瘤在目標位置的生長有賴于血管發生。甚至在除去原發腫瘤之后仍經常發生腫瘤轉移，因為腫瘤細胞或組分可殘留并發展出轉移潛力。在一個實施方案中，根據本發明的術語“轉移”表示“遠轉移(distalmetastasis)”，其表示遠離原發腫瘤和局部淋巴結系統的轉移。

繼發性或轉移性腫瘤的細胞與原發性腫瘤中的細胞類似。這意味著例如如果卵巢癌轉移至肝，則所述繼發性腫瘤由異常的卵巢細胞(而不是異常的肝細胞)構成。則肝中的腫瘤被稱為轉移性卵巢癌(而不是肝癌)。

“治療”意為向對象施用本文中描述的化合物或組合物以預防或清除疾病，包括使對象中的腫瘤的大小或腫瘤的數目降低；阻滯或減緩對象中的疾病；抑制或減緩對象中新疾病的發生；降低目前患有或以前曾患有疾病之對象中的癥狀和/或復發的頻率或嚴重程度；和/或延長(即，提高)所述對象的壽命。

術語“疾病的治療”包括疾病或其癥狀的治愈、縮短時程、改善、預防、減緩或抑制進展或惡化，或者預防或延緩發生。

“有風險”意為鑒定為與一般人群相比具有高于正常發病(特別是癌癥)機會的對象(即，患者)。此外，已患有或目前患有疾病(特別是癌癥)的對象是具有升高的發病風險的對象，因為這樣的對象可繼續發病。目前已患有或曾患有癌癥的對象還具有升高的癌轉移風險。

術語“免疫治療”表示與特異性免疫反應相關的治療。在本發明的情況下，術語例如“保護”、“預防”、“預防性的(prophylactic)”、“預防的(preventive)”或“保護性的(protective)”表示在個體中預防或治療(或二者兼有)腫瘤的發生和/或增殖傳播。在本發明的情況中，術語“免疫治療”優選地是指主動腫瘤免疫或腫瘤接種。預防性施用免疫治療(例如，預防性施用本發明的組合物)優選地對接受者進行保護以避免發生腫瘤生長。治療性施用免疫治療(例如，治療性施用本發明的組合物)可導致抑制腫瘤的進展/生長。這包括使腫瘤的進展/生長減速(特別是破壞腫瘤的進展)，這優選地導致腫瘤的清除。治療性施用免疫治療可對個體進行保護以避免例如現存腫瘤的播散或轉移。

術語“免疫(immunization)”或“接種(vaccination)”描述以誘導用于治療性或預防性原因的免疫應答為目的向對象施用抗原的過程。

可互換地使用術語“對象”、“個體”、“生物”或“患者”，其表示脊椎動物，優選哺乳動物。例如，在本發明的情況中，哺乳動物是人、非人靈長類、家養的動物(domesticatedanimal)(例如，犬、貓、綿羊、牛、山羊、豬、馬等)、實驗動物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等)以及圈養的動物(例如，動物園的動物)。本文中使用的術語“動物”還包括人。術語“對象”還可包括患者，即，患有疾病(優選與cldn6之表達相關的疾病(優選腫瘤發生性疾病(例如癌癥)))的動物(優選人)。

術語“佐劑”表示延長或增強或加速免疫應答的化合物。本發明的組合物優選地無需添加佐劑而發揮其作用。盡管如此，本申請的組合物可包含任何已知的佐劑。佐劑包含一組異質的化合物，例如油乳劑(例如，弗氏佐劑)、無機化合物(例如，明礬(alum))、細菌產物(例如，百日咳桿菌(bordetellapertussis)毒素)、脂質體和免疫刺激復合物。佐劑的實例是單磷酰基-脂質-a(mplsmithklinebeecham)。皂苷，例如qs21(smithklinebeecham)、dqs21(smithklinebeecham；wo96/33739)、qs7、qs17、qs18和qs-l1(so等，1997，mol.cells7：178-186)，不完全弗氏佐劑，完全弗氏佐劑，維生素e，montanid，明礬，cpg寡核苷酸(krieg等，1995，nature374：546-549)和多種由生物可降解的油(例如，角鯊烯和/或生育酚)制備的油包水型乳劑。

根據本發明，樣品可以是任何根據本發明可使用的樣品，特別是生物樣品，例如組織樣品(包括體液)和/或細胞樣品，并且可以以常規方式獲得，例如通過組織活檢(包括鉆取活檢)以及通過取血、支氣管吸出物、痰、尿、糞便或其他體液。根據本發明，術語“生物樣品”還包括生物樣品的級分。

術語“抗體”是指包含通過二硫鍵相互連接的至少兩個重(h)鏈和兩個輕(l)鏈的糖蛋白，并且包括包含其抗原結合部分的任何分子。術語“抗體”包括單克隆抗體及其片段或衍生物，包括但不限于人單克隆抗體、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體、單鏈抗體(例如，scfv′s)和抗原結合的抗體片段(例如，fab和fab′片段)，并且還包括抗體的所有重組形式，例如原核細胞中表達的抗體、非糖基化的抗體以及本文中描述的任何抗原結合的抗體片段和衍生物。每個重鏈包含重鏈可變區(在本文中縮寫為vh)和重鏈恒定區。每個輕鏈包含輕鏈可變區(在本文中縮寫為vl)和輕鏈恒定區。vh和vl區還可再分為高變區(稱為互補決定區(complementaritydeterminingregion，cdr))，其間散布著更保守的區域(稱為框架區(frameworkregion，fr))。vh和vl各自由三個cdr和四個fr構成，按照以下順序從氨基末端向羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的多種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(c1q))的結合。

根據本發明，術語“cdr序列的至少一個”優選地意為至少cdr3序列。術語“抗體鏈的cdr序列”優選地表示抗體重鏈或輕鏈的cdr1、cdr2和cdr3。

根據本發明，提及包含具體cdr序列(例如，具體的cdr3序列)的抗體鏈意為所述具體cdr序列形成所述抗體鏈的cdr區(例如cdr3區)，即所述cdr區由所述具體cdr序列組成，或形成cdr區(例如，所述抗體鏈的cdr3區)的一部分，即所述cdr區包含所述具體cdr序列。

如果根據本發明提到包含具體抗體重鏈和/或具體抗體輕鏈(例如，包含具體cdr序列的鏈)，抗體的兩個重鏈和/或兩個輕鏈優選地分別由具體抗體重鏈和/或具體抗體輕鏈構成。

術語“人源化抗體”是指具有基本源自非人物種免疫球蛋白之抗原結合位點的分子，其中分子的其余免疫球蛋白結構基于人免疫球蛋白之結構和/或序列。抗原結合位點可包含與恒定結構域融合的完整可變結構域或僅包含移植到可變結構域中合適框架區上的互補決定區(cdr)。抗原結合位點可以是野生型或者可通過一個或更多個氨基酸替換而被修飾，例如被修飾而更接近于人免疫球蛋白。人源化抗體的一些形式保持所有cdr序列(例如，含有小鼠抗體全部6個cdr的人源化小鼠抗體)。其他形式具有相對于初始抗體改變的一個或更多個cdr。

術語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其中每個重鏈和輕鏈氨基酸序列的一部分與源自特定物種的抗體中的相應序列同源，而所述鏈的其余區段與另一物種中相應的序列同源。一般來說，輕鏈和重鏈的可變區都模擬源自一個哺乳動物物種之抗體的可變區，而恒定部分與源自另一物種的抗體序列同源。這種嵌合形式的一個明顯的優勢是與源自例如人細胞制備物的恒定區組合的可變區可便利地源自目前已知的使用容易獲得的來自非人宿主生物的b細胞或雜交瘤的來源。雖然可變區具有方便制備以及特異性不受來源影響的優勢，但當注射所述抗體時，人的恒定區比來自非人來源的恒定區引起更低可能性的人對象免疫應答。然而，該定義不限于這個具體的實例。

本文中使用的術語抗體的“抗原結合部分”(或者簡單地“結合部分”)是指抗體的一個或更多個片段，其保持與抗原特異性的結合能力。已證明可通過全長抗體的片度來進行抗體的抗原結合功能。包括在術語抗體的“抗原結合部分”之內的結合片段的實例包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch結構域組成的一價片段；(ii)f(ab′)2片段，包含通過鉸鏈區中二硫鍵連接的兩個fab片段的二價片段；(iii)由vh和ch結構域組成的fd片段；(iv)由抗體單臂的vl和vh結構域組成的fv片段，(v)dab片段(ward等，(1989)nature341：544-546)，其由vh結構域組成；(vi)分離的互補決定區(cdr)，以及(vii)可任選地通過合成接頭(syntheticlinker)連接的兩種或更多種分離的cdr的組合。此外，盡管fv片段的兩個結構域(vl和vh)是不同基因編碼的，可使用重組方法通過合成接頭將它們連接，所述合成接頭使它們作為單個蛋白質鏈而制造，其中vl和vh區配對以形成一價分子(被稱為單鏈fv(singelchainfv，scfv)；參見例如bird等(1988)science242：423-426和huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：5879-5883)。這樣的單鏈抗體也意在包括于術語抗體的“抗原結合部分”之中。另一個實例是結合結構域免疫球蛋白融合蛋白質，其包含(i)與免疫球蛋白鉸鏈區多肽融合的結合結構域多肽，(ii)與鉸鏈區融合的免疫球蛋白重鏈ch2恒定區，以及(iii)與ch2恒定區融合的免疫球蛋白重鏈ch3恒定區。所述結合結構域多肽可以是重鏈可變區或輕鏈可變區。us2003/0118592和us2003/0133939中也公開了結合結構域免疫球蛋白融合蛋白質。通過使用本領域技術人員已知的常規技術獲得這些抗體片段，篩選所述片段，以與完整抗體相同的方式使用所述片段。

術語“表位”是指分子中的抗原決定簇，即是指分子中被免疫系統識別(例如被抗體識別)的部分。例如，表位是被免疫系統識別的抗原上不連續的三維位點。在本發明的情況下，所述表位優選地源自cldn蛋白。表位通常由分子的化學活性表面基團(例如，氨基酸或糖側鏈)組成，并且經常具有特異性的三維結構特征，以及特異性的電荷特征。構象和非構象表位的區別在于，在變性溶劑存在下，喪失與前者而非與后者的結合。蛋白質(例如，cldn)的表位優選地包含所述蛋白質的連續或不連續部分，并且長度優選地是5至100、優選5至50、更優選8至30、最優選10至25個氨基酸，例如，所述表位的長度可優選地是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個氨基酸。

本文中使用的術語“不連續表位”意為蛋白質抗原上的構象表位，其是由蛋白質的一級序列中的至少兩個不同區域形成的。

術語“雙特異性分子”意在包括具有兩個不同的結合特異性的任何試劑，例如蛋白質、肽或者蛋白質或肽的復合物。例如，所述分子可以與以下結合或相互作用：(a)細胞表面抗原，和(b)效應細胞表面上的fc受體。術語“多特異性”或“異種特異性分子”意在包括具有超過兩個不同的結合特異性的任何試劑，例如，蛋白質、肽或者蛋白質或肽的復合物。例如，所述分子可以與以下結合或相互作用：(a)細胞表面抗原，(b)效應細胞表面上的fc受體，和(c)至少一種其他成分。因此，本發明包括但不限于導向cldn6以及導向其他靶標(例如，效應細胞上的fc受體)的雙特異性、三特異性、四特異性和其他多特異性分子。術語“雙特異性抗體”還包括雙抗體(diabody)。雙抗體是二價、雙特異性抗體，其中vh和vl結構域表達于單個多肽鏈上，但使用的接頭太短從而無法使相同鏈上的兩個結構域之間配對，因而迫使所述結構域與其他鏈的互補結構域配對并且產生兩個抗原結合位點(參見例如holliger，p.，等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90：6444-6448；poljak，r.j.，等(1994)structure2：1121-1123)。

本文中使用的術語“異種抗體”是指兩個或更多個抗體、其衍生物或連接在一起的抗原結合區，其中至少兩個具有不同的特異性。這些不同的特異性包括對效應細胞上的fc受體的結合特異性，以及對靶細胞(例如，腫瘤細胞)上的抗原或表位的結合特異性。

本文中描述的抗體可以是人抗體。本文中使用的術語“人抗體”意在包括具有源自人種系免疫球蛋白序列之可變區和恒定區的抗體。本發明的人抗體可包括不被人種系免疫球蛋白序列(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或者通過體內體細胞突變而引入的突變)所編碼的氨基酸殘基。

本文中使用的術語“單克隆抗體”是指單個分子組成之抗體分子的制備物。單克隆抗體顯示對特定表位的單一結合特異性和親和力。在一個實施方案中，單克隆抗體由雜交瘤產生，所述雜交瘤包含與永生化細胞融合的獲自非人動物(例如，小鼠)的b細胞。

本文中使用的術語“重組抗體”包括由重組方式制備、表達、產生或分離的所有抗體，例如(a)從以免疫球蛋白基因轉基因的或轉染色體動物(例如，小鼠)或從其制備的雜交瘤中分離的抗體，(b)從轉化以表達抗體的宿主細胞中(例如，從轉染瘤(transfectoma)中)分離的抗體，(c)從重組的、組合的抗體文庫中分離的抗體，和(d)由涉及將免疫球蛋白基因序列剪接至其他dna序列的任何其他方式制備、表達、產生或分離的抗體。

本文中使用的術語“轉染瘤”包括表達抗體的重組真核宿主細胞，例如cho細胞、ns/0細胞、hek293細胞、hek293t細胞、植物細胞或真菌(包括酵母)細胞。

本文中使用的“異源抗體”是相對于產生所述抗體的轉基因生物而定義的。該術語是指這樣的抗體，其具有對應于生物中所發現的但不組成轉基因生物的氨基酸序列或編碼性核酸序列，并且通常源自不同于所述轉基因生物的物種。

本文中使用的“異雜合抗體(heterohybridantibody)”是指具有不同生物來源之輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與鼠輕鏈相締合之人重鏈的抗體是異源雜合抗體。

本發明包括本文中描述的所有抗體和衍生物，其對于本發明的目的而言均包括于術語“抗體”中。術語“抗體衍生物”是指抗體的任何修飾形式，例如，抗體與其他試劑或抗體的綴合物或者抗體片段。

本文中描述的抗體優選地是分離的。本文中使用的“分離的抗體”意指這樣的抗體，其基本沒有具有不同抗原特異性的其他抗體(例如，與cldn6特異性結合的分離抗體是這樣的抗體，其基本沒有與cldn6以外的抗原特異性結合的抗體)。然而，與人cldn6的表位、同種型或變體特異性結合的分離的抗體可以具有與其他相關抗原(例如，來自其他物種)(例如，cldn6的物種同源物)的交叉反應性。此外，分離的抗體可基本沒有其他細胞物質和/或化學品。在本發明的一個實施方案中，“分離的”單克隆抗體的組合表示具有不同特異性并且組合于明確界定的組合物中的抗體。

根據本發明，在標準測定(例如，本文中描述的測定)中，如果抗體與預先確定靶標有顯著的親和力并且與所述預先確定的靶標結合，則所述抗體能夠與所述預先確定的靶標結合。優選地，在流式細胞術分析(facs分析)中(其中測定所述抗體與表達于完整細胞表面上的所述靶標的結合)，如果抗體可檢測地與所述靶標結合，則所述抗體能夠與所述靶標結合。優選地，如果以10μg/ml或更低、5μg/ml或更低或者2μg/ml或更低的濃度存在，所述抗體可檢測地與所述靶標結合。優選地，如果以50nm或更低、30nm或更低或者15nm或更低的濃度存在，所述抗體可檢測地與所述靶標結合。經常通過平衡解離常數(kd)測量“親和力”或“結合親和力”。優選地，術語“顯著的親和力”是指以10^-5m或更低、10^-6m或更低、10^-7m或更低、10^-8m或更低、10^-9m或更低、10^-10m或更低、10^-11m或更低或者10^-12m或更低的解離常數(kd)與預先確定的靶標結合。本發明的抗體優選地具有6500ng/ml或更低、3000ng/ml或更低、2500ng/ml或更低、2000ng/ml或更低、1500ng/ml或更低、1000ng/ml或更低、500ng/ml或更低、400ng/ml或更低、300ng/ml或更低、200ng/ml或更低或者100ng/ml或更低的與cldn6結合的ec50值。

在標準的測定中，如果抗體不具有對靶標的顯著親和力并且不與所述靶標顯著地結合，則所述抗體(基本)不能與所述靶標結合。優選地，在流式細胞術分析(facs分析)中(其中測定所述抗體與表達于完整細胞表面上的所述靶標的結合)，如果抗體不與靶標可檢測地結合，則所述抗體(基本)不能與所述靶標結合。優選地，如果以高達2μg/ml、優選高達5μg/ml、優選高達10μg/ml、優選高達20μg/ml、更優選高達50μg/ml、特別是高達100μg/ml或高達150μg/ml、高達200μg/ml或者更高的濃度存在，則所述抗體不與所述靶標可檢測地結合。優選地，如果以高達15nm、優選高達30nm、優選高達50nm、優選高達100nm、優選高達150nm或高達170nm、高達300mm、高達600nm、高達1000nm、高達1300nm或者更高的濃度存在，則所述抗體不與所述靶標可檢測地結合。優選地，如果以與抗體所結合靶標飽和結合的濃度存在，則所述抗體不與所述靶標(即，cldn6)可檢測地結合。優選地，如果抗體與所述靶標以高于與預先確定之靶標(所述抗體所能夠與其結合)結合之kd的至少10倍、100倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍或10⁶倍高的kd結合，則抗體不具有對靶標的顯著親和力。例如，如果抗體與所述抗體所能夠結合的所述靶標相結合的kd是10^-7m，則抗體不具有顯著親和力的與靶標結合的kd可以是至少10^-6m、10^-5m、10^-4m、10^-3m、10^-2m或10^-1m。

如果抗體能夠與預先確定的靶標結合而不能與其他靶標結合(即，在標準測定中對其他靶標沒有顯著的親和力并且不與其他靶標顯著地結合)，則所述抗體對所述預先確定的靶標是特異性的。根據本發明，如果抗體能夠與cldn6結合但不能與其他靶標(特別是除cldn6之外的密蛋白，例如cldn9、cldn4、cldn3和cldn1)結合，則所述抗體是cldn6特異性的。優選地，如果與cldn6之外的密蛋白(例如，cldn9、cldn4、cldn3和cldn1)的親和力和結合沒有顯著超過與密蛋白不相關的蛋白質(例如，牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)、酪蛋白、人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)或非密蛋白的膜蛋白質(例如，mhc分子或轉鐵蛋白受體)或任何其他指定的多肽)的親和力和結合，則所述抗體是cldn6特異性的。優選地，如果抗體與所述靶標以低于與預先確定之靶標(所述抗體對其不是特異性的)結合之kd的至少10倍、100倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍或10⁶倍的kd結合，則所述抗體對預先確定的靶標是特異性的。例如，如果抗體與對其特異性靶標之結合的kd是10^-7m，則與對其非特異性靶標之結合的kd可以是至少10^-6m、10^-5m、10^-4m、10^-3m、10^-2m或10^-1m。

可使用任何合適的方法實驗性測定抗體與靶標的結合；參見例如berzofsky等，″antibody-antigeninteractions″infundamentalimmunology，paul，w.e.編，ravenpressnewyork，ny(1984)，kuby，janisimmunology，w.h.freemanandcompanynewyork，ny(1992)和本文中描述的方法。可使用常規技術很容易地測定親和力，例如，通過平衡透析；通過使用biacore2000儀器，使用制造商所描述的一般方法；通過使用放射標記的靶抗原的放射免疫測定；或通過技術人員已知的其他方法。例如，可通過scatchard等，annn.y.acad.scl，51：660(1949)的方法分析親和力數據。如果在不同條件(例如，鹽濃度、ph)下測量，所測量的具體抗體-抗原相互作用的親和力可以不同。因此，親和力的測量和其他抗原-結合參數(例如，kd、ic50)優選地用抗體與抗原的標準化的溶液以及標準化的緩沖液制成。

本發明抗體的獨特特征是與細胞表面密蛋白6結合的能力。這已通過流式細胞術分析表達密蛋白6的細胞而被證明。

為了測試單克隆抗體與表達密蛋白之活細胞的結合，可使用流式細胞術。簡單地說，將表達與膜締合之密蛋白(在標準的生長條件下生長)的細胞系與多個濃度的pbs(含有2％熱滅活的fcs和0.1％nan3)中的抗體在4℃下混合30分鐘。清洗之后，在與一抗染色相同的條件下，使細胞與熒光標記的二抗反應。利用光和側向散射特性，可通過facs分析樣品以對單種細胞圈門(gate)，并測定被標記抗體的結合。

根據本發明的術語“結合”優選地表示本文中定義的特異性結合。

本文中使用的“同種型”是指由重鏈恒定區基因所編碼的抗體類型(例如，igm或igg1)。

本文中使用的“同種型轉換”是指抗體的類型或同種型從一種ig類型變為另一種ig類型的現象。

本文中使用的應用于對象的術語“天然的(naturallyoccurring)”是指對象可在自然中找到的事實。例如，可已從天然來源中分離的存在于生物(包括病毒)中的并且已在實驗室中被人刻意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然的。

本文中使用的術語“重排的”是指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構型，其中在實質上編碼完整的vh或vl結構域的構象中，v區段的位置分別緊鄰d-j或j區段。可通過比較種系dna來鑒定重排的免疫球蛋白(抗體)基因座；重排的基因座將具有至少一個重組的七聚體/九聚體同源性元件。

本文中關于v區段而使用的術語“未重排的”或“種系構型”是指這樣的構型，其中v區段未重組，以使其緊鄰d或j區段。

本文中使用的術語“核酸分子”意在包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優選地是雙鏈的dna。可以以例如rna的形式將核酸分子用于引入(即，轉染)細胞，所述rna可通過體外轉錄從dna模板制備。此外，在應用之前，可通過穩定序列、加帽和多聚腺苷酸化來修飾所述rna。

根據本發明描述的核酸已優選地被分離。根據本發明，術語“分離的核酸”意為所述核酸是(i)體外擴增的，例如通過聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，pcr)，(ii)通過克隆重組產生的，(iii)純化的，例如通過切割和凝膠電泳分離，或者(iv)合成的，例如通過化學合成。分離的核酸是可用于重組dna技術之操作的核酸。

根據本發明，核酸可單獨存在或與其他核酸聯合存在，所述其他核酸可以是同源的或異源的。在一些優選的實施方案中，核酸與表達控制序列功能性連接，所述表達控制序列與所述核酸可以是同源或異源的，其中術語“同源的”意為所述核酸還天然地與表達控制序列功能性連接，而術語“異源的”意為所述核酸天然地不與表達控制序列功能性連接。

如果它們是彼此以這樣的方式共價連接以使所述核酸的表達或轉錄在所述表達控制序列的控制或影響之下，則核酸(例如，表達rna和/或蛋白質或肽的核酸)與表達控制序列彼此功能性連接。如果要將所述核酸翻譯成為功能性蛋白質，那么用表達控制序列與編碼序列功能性連接，誘導所述表達控制序列導致所述核酸的轉錄，而不引起編碼序列中的移碼或者所述編碼序列不能被翻譯成為所需的蛋白質或肽。

根據本發明，術語“表達控制序列”包含啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mrna翻譯的其他控制元件。在本發明的一些具體的實施方案中，可調節所述表達控制序列。表達控制序列的精確結構可作為物種或細胞類型的函數而不同，但通常包含5′-非轉錄的以及5′-和3′-非翻譯序列，其分別參與轉錄和翻譯的起始，例如tata框、加帽序列、caat序列等。更具體地說，5′-非轉錄的表達控制序列包含啟動子區，其包含用于功能性連接的核酸之轉錄控制的啟動子序列。表達控制序列還可包括增強子序列或上游激活子序列。

根據本發明，術語“啟動子”或“啟動子區”表示這樣的核酸序列，其位于被表達核酸序列的上游(5′)，并且通過提供對rna聚合酶的識別和結合位點而控制序列的表達。“啟動子區”還可包含識別和結合參與基因轉錄調節之其他因子的位點。啟動子可控制原核或真核基因的轉錄。此外，啟動子可以是“可誘導型的”并且可以響應于誘導劑而起始轉錄，或者如果轉錄不受誘導劑控制，所述啟動子可以是“組成型的”。如果不存在誘導劑，在可誘導型啟動子控制之下的基因不表達或僅少量表達。在誘導劑存在下，所述基因被打開或轉錄水平升高。這一般是通過特定轉錄因子的結合所介導的。

根據本發明，優選的啟動子包括sp6、t3和t7聚合酶的啟動子、人u6rna啟動子、cmv啟動子及其人工的雜合啟動子(例如，cmv)，其中一部分或一些部分與其他細胞蛋白質(例如，人gapdh(甘油醛-3-磷酸脫氫酶))的基因啟動子的一部分或一些部分融合，并且包含或不包含額外的內含子。

根據本發明，以最通常的意義使用術語“表達”，其包括產生rna或產生rna和蛋白質/肽。它還包括核酸的部分表達。此外，可以瞬時地或穩定地進行表達。根據本發明，術語表達還包括“異常表達”或“不正常表達”。

根據本發明，“異常表達”或“不正常表達”意為與參比相比(優選與非腫瘤發生性的正常細胞或健康的個體中的狀態相比)表達改變(優選升高)。表達的升高是指升高至少10％，特別是至少20％，至少50％或至少100％。在一個實施方案中，表達僅見于患病的組織，而健康組織中的表達被抑制。

在一個優選的實施方案中，根據本發明，核酸分子(在適當情況下)與啟動子(其控制核酸的表達)存在于載體中。在此以其最常用的意義使用的術語“載體”，其包括用于核酸的任何中間媒介物(vehicle)，其使所述核酸例如被引入原核和/或真核細胞，并且在適當情況下被整合進入基因組。這類載體優選地在所述細胞中復制和/或表達。載體包括質粒、噬菌粒、噬菌體或病毒基因組。本文中使用的術語“質粒”通常表示可獨立于染色體dna而復制的染色體外遺傳物質的構建體，通常為環狀dna雙鏈體。

對于表達抗體的載體，可使用其中抗體重鏈和輕鏈存在于不同的載體中的載體類型或者其中重鏈和輕鏈存在于同一載體中的載體類型。

要這樣解釋本文中給出的關于特定核酸和氨基酸序列(例如，序列表中的序列)的教導，以使其還表示所述特定序列的修飾形式(即，變體)，其導致功能性等同于所述特定序列的序列，例如，氨基酸序列表現出與所述特定氨基酸序列相同或相似的特性，并且編碼氨基酸序列的核酸序列表現出與所述特定核酸序列所編碼的氨基酸序列相同或相似的特性。一個重要的特性是保持抗體與其靶標的結合，或者維持抗體的效應功能，例如cdc和/或adcc。優選地，當在抗體中替換所述特異性序列時，相對于特定序列而修飾的序列保持所述抗體與靶標的結合，并且優選保持本文中描述的所述抗體的功能。

類似地，要這樣解釋本文中給出的關于特定抗體或產生特異性抗體之雜交瘤的教導，以使其還表示以氨基酸序列和/或核酸序列為特征的抗體，所述氨基酸序列和/或核酸序列是與所述特定抗體的所述氨基酸序列和/或核酸序列相比較而修飾的，但在功能上是等同的。一個重要的特性是保持抗體與其靶標的結合或維持抗體的效應功能。優選地，當用相對于特定序列修飾的序列替換抗體中的特定序列時，保持所述抗體與靶標的結合，并且優選保持本文中描述的所述抗體的功能，例如cdc介導的裂解或adcc介導的裂解。

本領域技術人員會理解，可修飾高變區和可變區(特別是cdr的序列)而不失去與靶標結合的能力。例如，cdr區會與本文中指定的抗體相同或高度同源。對于“高度同源”，考慮可在cdr中進行1至5(優選1至4，例如1至3或者1或2)個替換。此外，可修飾高變區和可變區，以使其顯示出與本文中具體公開的抗體區域基本同源。

要理解的是，本文中描述的特定核酸還包括為在具體宿主細胞或生物中優化密碼子使用而修飾的核酸。生物之間密碼子使用的差異可導致涉及異源基因表達的很多問題。通過改變原序列的一個或更多個核苷酸的密碼子優化可導致要在其中表達所述核酸的同源或異源宿主中核酸表達的優化(特別是翻譯效率的優化)。

根據本發明，核酸序列、氨基酸序列或肽的變體、衍生物、修飾形式或片段優選地分別具有從其來源的核酸序列、氨基酸序列或肽的功能特性。這樣的功能特性包括與其他分子的相互作用或結合。在一個實施方案中，核酸序列、氨基酸序列或肽的變體、衍生物、修飾形式或片段分別與從其來源的核酸序列、氨基酸序列或肽免疫等效。

優選地，特定核酸序列與相對于所述特定核酸序列而修飾的核酸序列或所述特定核酸序列之變體的核酸序列的同一性程度會為至少70％，優選至少75％，更優選至少80％，甚至更優選至少90％或者最優選至少95％、96％、97％、98％或99％。對于cldn6核酸變體，同一性的程度優選以至少約300、至少約400、至少約450、至少約500、至少約550、至少約600或至少約630個核苷酸的區域給出。在一些優選的實施方案中，為全長的參比核酸序列(例如，序列表中給出的核酸序列)給出同一性程度。優選地，這兩個序列能夠彼此雜交并形成穩定的雙鏈體，雜交優選在允許多核苷酸之間特異性雜交的條件(嚴格條件)下進行。嚴格條件描述于例如molecularcloning：alaboratorymanual，j.sambrook等編，第2版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，newyork，1989或者currentprotocolsinmolecularbiology，f.m.ausubel等編，johnwiley&sons，inc.，newyork，并且是指例如在65℃下在雜交緩沖液(3.5×ssc、0.02％ficoll、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白、2.5mmnah2p04(ph7)、0.5％sds、2mmedta)中的雜交。ssc是0.15m氯化鈉/0.15m檸檬酸鈉，ph7。雜交之后，清洗已被轉移了dna的膜，例如室溫下在2×ssc中清洗，并隨后在高達68℃的溫度下在0.1～0.5×ssc/0.1×sds中清洗。

根據本發明，術語“變體”還包括突變體，剪接變體，構象，同種型，等位基因變體，物種變體和物種同源物，特別是天然存在的變體。等位基因變體涉及基因正常序列中的改變，其重要性通常不清楚。全基因測序通常鑒定給定基因的大量等位基因變體。物種同源物是給定核酸或氨基酸序列的具有不同物種來源的核酸或氨基酸序列。

對于本發明的目的而言，氨基酸序列的“變體”包含氨基酸插入變體、氨基酸添加變體、氨基酸缺失變體和/或氨基酸替換變體。在蛋白質的n端和/或c端包含缺失的氨基酸缺失變體還稱為n端和/或c端截斷變體(truncationvariant)。

氨基酸插入變體包括在特定氨基酸序列中插入單個或兩個或更多個氨基酸。在具有插入的氨基酸序列變體的情況中，向氨基酸序列的特定位點中插入一個或更多個氨基酸殘基，但是隨機插入并對所產生的產物進行合適的篩選也是可能的。

氨基酸添加變體包含氨基和/或羧基末端融合一個或更多個氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多個氨基酸。

氨基酸缺失變體以從序列中除去一個或更多個氨基酸(例如，通過除去1、2、3、5、10、20、30、50或更多個氨基酸)為特征。所述缺失可以在蛋白質的任何位置。

氨基酸替換變體以序列中至少一個殘基被除去并在其位置中插入其他殘基為特征。優選在氨基酸序列中同源蛋白質或肽之間非保守的位置處修飾和/或優選將氨基酸置換為其他具有相似特性的氨基酸。優選地，蛋白質變體中的氨基酸改變是保守性氨基酸改變，即替換帶有類似電荷的或不帶電荷的氨基酸。保守性氨基酸改變涉及替換以其側鏈相關聯的氨基酸家族的一個。天然氨基酸通常分為四個家族：酸性的(天冬氨酸、谷氨酸)、堿性的(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、非極性的(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不帶電的極性的(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時共同分類為芳族氨基酸。

關于根據seqidno：37的氨基酸序列，術語變體特別地涉及其中位置46處的半胱氨酸替換為除半胱氨酸之外的另一種氨基酸(例如如上所述的氨基酸，優選甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、色氨酸、脯氨酸或亮氨酸)的序列。

特定氨基酸序列與相對于所述特定氨基酸而修飾的氨基酸序列或所述氨基酸序列的變體之間(例如，顯示基本同源的氨基酸序列之間)優選的相似性程度、優選的同一性會為至少70％，優選至少80％，甚至更優選至少90％或者最優選至少95％、96％、97％、98％或99％。優選地為氨基酸區域給出相似性或同一性程度，所述區域為參比氨基酸序列之全長的至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％或約100％。例如，如果參比氨基酸序列由200個氨基酸組成，優選地為至少約20、至少約40、至少約60、至少約80、至少約100、至少約120、至少約140、至少約160、至少約180或約200個氨基酸給出的相似性或同一性程度，優選連續的氨基酸。對于cldn6多肽變體，優選地為至少約100、至少約120、至少約140、至少約160、至少約180、至少約200、至少約210個氨基酸的區域給出相似性或同一性程度。在一些優選的實施方案中，為全長的參比氨基酸序列(例如，序列表中所給出的氨基酸序列)給出相似性或同一性程度。可用現有技術中已知的工具進行用于確定序列相似性(優選序列同一性)的比對，優選使用最好的序列比對，例如使用align，使用標準設置，優選emboss：：needle、matrix：blosum62、gapopen10.0、gapextend0.5。

“序列相似性”表示相同或存在保守性氨基酸替換的氨基酸百分比。兩個多肽或核酸序列之間的“序列同一性”表示序列之間相同的氨基酸或核苷酸百分比。

在最佳比對之后，獲得“百分同一性”，該百分比是純統計學的，并且這兩個序列之間的差異在其整個長度上隨機地分布。通過任選地比對它們之后，比較這些序列，常規地進行兩個核苷酸或氨基酸序列之間的序列比較，所述比較是通過區段或“比較窗”進行的，以鑒定和比較具有序列相似性的局部區域。除了手工進行之外，可通過smithandwaterman，1981，adsapp.math.2，482的局部同源性算法，通過neddlemanandwunsch，1970，j.mol.biol.48，443的局部同源性算法，通過pearsonandlipman，1988，proc.natlacad.sci.usa85，2444的相似性搜索法，或者通過使用這些算法的計算機程序(gap，bestfit，fasta，blastp，blastnandtfastainwisconsingeneticssoftwarepackage，geneticscomputergroup，575sciencedrive，madison，wis.)來產生對用于比較之序列的最佳比對。

通過測定被比較的兩個序列之間相同位置的數目來計算百分同一性，將該數目除以所比較的位置數并使結果乘以100以獲得這兩個序列之間的百分同一性。

例如，可根據所涉殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性質而進行“保守性替換”。例如：(a)非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；以及(d)帶負電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。替換通常可在組(a)～(d)之內進行。此外，根據甘氨酸和脯氨酸破壞α-螺旋的能力，它們可以彼此替換。可在以下組之間進行一些優選的替換：(i)s和t；(ii)p和g；以及(iii)a、v、l和i。鑒于已知的遺傳代碼以及重組和合成dna技術，技術人員可很容易地構建編碼保守性氨基酸變體的dna。

本發明包括這樣的抗體，其中在fc區已進行修改以改變所述抗體的功能或藥物代謝動力學特性。這樣的改變可導致c1q結合以及cdc或者fcγr結合以及adcc的降低或升高。可例如在重鏈恒定區的一個或更多個氨基酸殘基中進行替換，因而，與修飾的抗體相比，導致效應功能的改變，同時保持與抗原結合的能力，參見us5,624,821和us5,648,260。

可通過修飾ig恒定結構域或ig樣恒定結構域的補救受體(salvagerecptor)表位來提高抗體的體內半衰期，以使分子不包含完整的ch2結構域或完整的igfc區，參見us6,121,022和us6,194,551。還可通過在fc區中進行突變來升高體內半衰期，所述突變例如通過在位置252處以蘇氨酸替換亮氨酸，通過在位置254處以蘇氨酸替換絲氨酸，或者通過在位置256處以蘇氨酸替換苯丙氨酸，參見us6,277,375。

此外，可修飾抗體的糖基化模式以改變抗體的效應功能。例如，可在轉染瘤中表達所述抗體，所述轉染瘤在fc區的位置297處不添加通常與asn連接的巖藻糖單位以增強fc區對fc受體的親和力，這反過來會導致nk細胞存在下升高的抗體adcc，參見shield等(2002)jbc，277：26733。此外，可進行半乳糖基化修飾以修飾cdc。

或者，在另一個實施方案中，可沿著抗cldn6抗體的全部或部分編碼序列隨機引入突變(例如通過飽和誘變)，并且可篩選所產生的經修飾的抗cldn6抗體的結合活性。

根據本發明，術語“細胞”或“宿主細胞”優選地表示完整細胞，即具有完整膜的未釋放其正常的細胞內成分(例如，酶、細胞器或遺傳物質)的細胞。完整細胞優選地是活細胞(viablecell)，即能夠進行正常代謝功能的活細胞(livingcell)。優選地，根據本發明，所述術語表示可用外源性核酸轉化或轉染的任何細胞。根據本發明，術語”細胞“包括原核細胞(例如，大腸桿菌(e.coli))或真核細胞(例如，樹突細胞、b細胞、cho細胞、cos細胞、k562細胞、hek293細胞、hela細胞、酵母細胞和昆蟲細胞)。所述外源性核酸可見于細胞內部(i)這樣的自由分散，(ii)并入重組載體，或者(iii)整合進入宿主基因組或線粒體dna。特別優選哺乳動物的細胞，例如來自人、小鼠、倉鼠、豬、山羊和靈長類的細胞。所述細胞可以源自很多組織類型，并且包括原代細胞和細胞系。具體的實例包括角質形成細胞、外周血白細胞、骨髓干細胞和胚胎干細胞。在另一些實施方案中，所述細胞是抗原呈遞細胞，特別是樹突細胞、單核細胞或巨噬細胞。本文中使用的術語“宿主細胞”優選意指其中已引入重組表達載體的細胞。

包含核酸分子的細胞優選地表達所述核酸所編碼的肽或蛋白質。

術語“轉基因動物”是指具有包含一個或更多個轉基因(優選重鏈和/或輕鏈轉基因)或轉染色體(transchromosome)(整合或不整合到動物的天然基因組dna中)的基因組的動物，并且其優選能夠表達所述轉基因。例如，轉基因小鼠可具有人輕鏈轉基因以及人重鏈轉基因或人重鏈轉染色體，以使當用cldn6抗原和/或表達cldn6的細胞免疫時，所述小鼠產生人抗-cldn6抗體。人重鏈轉基因可被整合到小鼠的染色體dna中(如轉基因小鼠(例如，humab小鼠(例如，hco7或hcol2小鼠))中的情況那樣)，或者可以染色體外維持人重鏈轉基因(如wo02/43478中描述的轉染色體(例如，km)小鼠中的情況那樣)。通過進行v-d-j重組和同種型轉換，這樣的轉基因和轉染色體小鼠可以以能夠產生多同種型的抗cldn6的人單克隆抗體(例如，igg、iga和/或ige)。

本文中使用的“降低”或“抑制”意為引起總體降低的能力，優選5％或更高、10％或更高、20％或更高、更優選50％或更高并且最優選75％或更高水平的降低，例如細胞增殖水平的降低。術語“抑制”或類似的詞語包括完全或基本完全的抑制，即降低至0或基本降低至0。

術語例如“升高”或“增強”優選地表示升高或增強約至少10％、優選至少20％、優選至少30％、更優選至少40％、更優選至少50％、甚至更優選至少80％并且最優選至少100％。這些術語還可表示這樣的情況，其中在0時間沒有可檢出的某些化合物或病癥的信號，而在0時間之后的特定時間點有可檢出的某些化合物或病癥的信號。

術語“免疫等效”意為例如對于免疫作用的類型(例如誘導體液和/或細胞免疫應答)、所誘導的免疫反應的強度和/或持續時間或者所誘導的免疫反應的特異性而言，免疫等效分子(例如免疫等效氨基酸序列)表現出相同或基本相同的免疫特性和/或發揮相同或基本相同的免疫作用。在本發明的情況中，術語“免疫等效”優選地是相對于免疫的肽或肽變體的免疫作用或特性而使用的。特定的免疫特性是與抗體結合和(在適當情況下)產生免疫應答(優選地通過刺激抗體的產生)的能力。例如，如果所述氨基酸序列在暴露于對象的免疫系統時誘導免疫反應(優選抗體，其具有與參比氨基酸序列(例如，所述參比氨基酸序列形成cldn6的一部分)反應的特異性)，則所述氨基酸序列與參比氨基酸序列免疫等效。

在本文的情況中，術語“免疫效應功能”包括免疫系統的組分所介導的任何功能，其導致抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤發生，包括抑制腫瘤的播散和轉移。優選地，免疫效應功能導致殺傷腫瘤細胞。優選地，本發明的情況中的免疫效應功能是抗體介導的效應功能。這樣的功能包括補體依賴的細胞毒作用(cdc)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(adcc)、在帶有腫瘤相關抗原的細胞中誘導凋亡(例如，通過抗體與表面抗原的結合)和/或抑制帶有腫瘤相關抗原之細胞的增殖，優選adcc和/或cdc。因此，能夠介導一種或更多種免疫效應功能的抗體優選地能夠通過誘導cdc介導的裂解、adcc介導的裂解、凋亡、同型黏著和/或吞噬作用(優選通過誘導cdc介導的裂解和/或adcc介導的裂解)介導對細胞的殺傷。抗體還可簡單地通過與腫瘤細胞表面上的腫瘤相關抗原結合而發揮作用。例如，抗體可僅通過與腫瘤細胞表面上的腫瘤相關抗原結合而阻斷腫瘤相關抗原的功能或誘導凋亡。

具體實施方式

mab作用的機制

盡管以下提供對作為本發明抗體治療效果之基礎的機制的考慮，但不認為這是以任何方式限制本發明。

本文中描述的抗體可與免疫系統的組分相互作用，優選通過adcc或cdc相互作用。本發明的抗體還可用于使有效負載(例如，放射性同位素、藥物或毒素)靶向以直接殺傷腫瘤細胞或可與常規化療劑協同使用，通過補充作用機制(可包括抗腫瘤免疫應答，其可因化療劑對t淋巴細胞的毒性副作用而被破壞)攻擊腫瘤。然而，本發明的抗體還可通過簡單地與細胞表面的cldn6結合(因而例如阻斷細胞的增殖)而發揮作用。

抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用

adcc描述本文中描述的效應細胞(特別是淋巴細胞)的細胞殺傷能力，這優選地要求靶細胞被抗體所標記。

當抗體與腫瘤細胞上的抗原結合并且抗體fc結構域占用免疫效應細胞表面上的fc受體(fcr)時，adcc優選地發生。已鑒定多個家族的fc受體，并且特定細胞群特征性地表達確定的fc受體。adcc可被視為直接誘導不同程度的即時腫瘤破壞的機制，其導致抗原呈遞以及腫瘤指導的t細胞應答的誘導。優選地，體內誘導adcc將導致腫瘤指導的t細胞應答和宿主源性抗體應答。

補體依賴的細胞毒作用

cdc是另一種抗體指導的細胞殺傷方法。igm是補體激活的最有效同種型。通過經典的補體激活途徑，igg1和igg3也均非常有效地指導cdc。優選地，在該級聯中，抗原-抗體復合物的形成導致所參與的抗體分子(例如，igg分子)的ch2結構域上暴露多個緊鄰的c1q結合位點(c1q是補體c1的三個亞組分之一)。優選地，這些暴露的c1q結合位點將之前低親和力的c1q-igg相互作用轉變為高親和力的相互作用，這觸發與一系列其他補體蛋白相關的事件級聯，并導致蛋白水解釋放效應細胞趨化/激活劑c3a和c5a。優選地，補體級聯在膜攻擊復合物形成后結束，所述膜攻擊復合物在細胞膜中產生孔，其促進水和溶質自由進出所述細胞。

抗體的產生

可通過多種技術產生本發明的抗體，所述技術包括常規的單克隆抗體法，例如kohlerandmilstein，nature256：495(1975)的標準體細胞雜交技術。盡管優選體細胞雜交法，原則上可采用用于產生單克隆抗體的其他技術，例如病毒或癌基因轉化b淋巴細胞或使用抗體基因文庫的噬菌體展示技術。

用于制備分泌單克隆抗體之雜交瘤的優選動物系統是鼠系統。小鼠中的雜交瘤生產是非常完善的方法。分離用于融合的經免疫脾細胞的免疫方案和技術是現有技術中已知的。融合伴侶(例如，鼠骨髓瘤細胞)和融合方法也是已知的。

用于制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的其他優選動物系統是大鼠和兔系統(例如描述于spieker-polet等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.92：9348(1995)，還參見rossi等，am.j.clin.pathol.124：295(2005))。

在另一個優選的實施方案中，可使用帶有部分人免疫系統(而非小鼠系統)的轉基因或轉染色體小鼠來生成抗cldn6的人單克隆抗體。這些轉基因的和轉染色體的小鼠包括分別稱為humab小鼠和km小鼠的小鼠，并且其在本文中統稱為“轉基因小鼠”。可按照wo2004035607中對cd20的詳細描述來在這樣的轉基因小鼠中產生人抗體。

用于生成單克隆抗體的另一個策略是從所定義策略的產生抗體之淋巴細胞中直接分離編碼抗體的基因，例如參見babcock等，1996；anovelstrategyforgeneratingmonoclonalantibodiesfromsingle，isolatedlymphocytesproducingantibodiesofdefinedstrategy。對于重組抗體工程的細節還參見welschofandkraus，recombinantantibodesforcancertherapyisbn-0-89603-918-8和bennyk.c.loantibodyengineeringisbn1-58829-092-1。

免疫

如所描述的那樣可用載劑綴合的源自cldn6序列的肽(其是重組表達的cldn6抗原或其片段和/或表達cldn6或其片段之細胞的富集的制備物)免疫接種小鼠以生成抗cldn6抗體。或者，可用dna編碼的全長人cldn6或其片段免疫接種小鼠。在使用純化的或富集的cldn6抗原制備物免疫接種不產生抗體的情況中，還可用表達cldn6的細胞(例如，細胞系)免疫接種小鼠以促進免疫應答。

可在免疫方案的過程中監控免疫應答，其中通過尾靜脈或后眼眶取血來獲得血漿和血清樣品。具有足夠效價的抗cldn6免疫球蛋白的小鼠可用于融合。在處死和取出脾之前3～5天，可用表達cldn6的細胞腹膜內或靜脈內加強小鼠以升高分泌特定抗體之雜交瘤的比例。

生成產生單克隆抗體的雜交瘤

為生成產生抗cldn6單克隆抗體的雜交瘤，可分離獲自經免疫小鼠的淋巴結或脾的細胞，并使其與合適的永生化細胞系(例如，小鼠骨髓瘤細胞系)融合。隨后可從所產生的雜交瘤中篩選抗原特異性抗體的產生。隨后可通過elisa從各個孔篩選分泌抗體的雜交瘤。使用表達cldn6的細胞，通過免疫熒光和facs分析來鑒定對cldn6具有特異性的抗體。可再次接種分泌抗體的雜交瘤，再次篩選，并且如果其仍然是抗cldn6單克隆抗體陽性，則可通過有限稀釋進行亞克隆。可隨后體外培養穩定的亞克隆以在組織培養基中生成用于表征的抗體。

生成產生單克隆抗體的轉染瘤

還可使用例如現有技術(morrison，s.(1985)science229：1202)中公知的重組dna技術和基因轉染方法的組合以在宿主細胞轉染瘤中產生本發明的抗體。

例如，在一個實施方案中，可將目的基因(例如，抗體基因)連接到表達載體(例如，真核表達質粒(例如，wo87/04462、wo89/01036和ep338841中公開的gs基因表達系統或現有技術中公知的其他表達系統所使用的真核表達質粒))中。可將具有所克隆的抗體基因的純化質粒引入真核宿主細胞，例如cho細胞、ns/0細胞、hek293t細胞或hek293細胞或者其他真核細胞，例如植物來源的細胞、真菌或酵母細胞。用于引入這些基因的方法可以是現有技術中所描述的方法，例如電穿孔、lipofectine、lipofectamine等。將這些抗體基因引入宿主細胞之后，可鑒定和選擇表達所述抗體的細胞。這些細胞代表轉染瘤，隨后可放大其表達水平并提高規模以產生抗體。可從這些培養上清液和/或細胞中分離和純化重組抗體。

或者，可在其他表達系統(包括原核細胞(例如微生物(例如大腸桿菌(e.coli)))中表達所克隆的抗體基因。此外，可在轉基因的非人動物中產生抗體，例如在來自綿羊和兔的奶中，或在來自母雞的卵中，或在轉基因植物中產生；參見例如verma，r.，等(1998)j.immunol.meth.216：165-181；pollock，等(1999)j.immunol.meth.231：147-157；和fischer，r.，等(1999)biol.chem.380：825-839。

使用部分抗體序列來表達完整抗體(即，人源化和嵌合化)。

a)嵌合化

當用毒素或放射性同位素標記后，鼠單克隆抗體可在人中被用作治療性抗體。非標記的鼠抗體在人中是高度免疫原性的，當重復應用后導致治療作用的降低。主要的免疫原性是通過重鏈恒定區介導的。如果使各個抗體嵌合化或人源化，可降低或完全避免鼠抗體在人中的免疫原性。嵌合抗體是其中的不同部分來自不同動物物種的抗體，例如具有來自鼠抗體可變區和人免疫球蛋白恒定區的抗體。抗體的嵌合化是通過將鼠抗體重鏈和輕鏈的可變區與人重鏈和輕鏈恒定區相連接而實現的(例如，kraus等在methodsinmolecularbiologyseries，recombinantantibodiesforcancertherapyisbn-0-89603-918-8中所描述的那樣)。在一個優選的實施方案中，嵌合抗體是通過將人κ-輕鏈恒定區與鼠輕鏈可變區相連接而生成的。在另一個優選的實施方案中，可通過將人λ-輕鏈恒定區與鼠輕鏈可變區相連接而生成嵌合抗體。優選的用于生成嵌合抗體的重鏈恒定區是igg1、igg3和igg4。其他優選的用于生成嵌合抗體的重鏈恒定區是igg2、iga、igd和igm。

b)人源化

抗體主要通過位于6個重鏈和輕鏈互補決定區(cdr)中的氨基酸殘基與目標抗原相互作用。為此，在各個抗體之間，cdr中的氨基酸序列比cdr外的序列更多樣化。因為cdr序列負責多數抗體-抗原相互作用，通過構建包含從具有不同特性的不同抗體移植到框架序列上的來自特定天然抗體cdr序列的表達載體，可表達模擬特定天然抗體之特性的重組抗體(參見例如riechmann，l.等(1998)nature332：323-327；jones，p.等(1986)nature321：522-525；和queen，c.等(1989)proc.natl.acad.sci.u.s.a.86：10029-10033)。這樣的框架序列可獲自包含種系抗體基因序列的公共dna數據庫。這些種系序列會不同于成熟的抗體基因序列，因為它們不會包含完整組裝的可變區基因，其是通過b細胞成熟過程中的v(d)j連接而形成的。在每個均勻地分布的可變區，種系基因序列還會不同于高親和力的二級全套抗體的序列。例如，體細胞突變在框架區1的氨基末端部分和在框架區4的羧基末端部分中相對罕見。此外，很多體細胞突變不明顯地改變抗體的結合特性。為此，并不必需獲得具體抗體的整個dna序列以重新產生具有與原抗體相似結合特性的完整重組抗體(見wo99/45962)。跨越cdr區的部分重鏈和輕鏈序列通常足以用于該目的。所述部分序列被用于測定哪個種系可變區段和連接基因區段貢獻于重組的抗體可變基因。隨后將種系序列用于填充可變區的缺失部分。在蛋白質成熟的過程中切除重鏈和輕鏈前導序列，其并不貢獻于最終抗體的特性。為了添加丟失的序列，可通過連接或pcr擴增來將被克隆的cdna序列與合成的寡核苷酸組合。或者，可作為一組短的、重疊的、寡核苷酸來合成整個可變區，并通過pcr擴增來組合以產生整個合成的可變區克隆。該過程具有某些優勢，例如清除或包含特定的限制位點，或者優化特定的密碼子。

使用來自雜交瘤的重鏈和輕鏈核苷酸序列的轉錄物來設計重疊組的合成寡核苷酸以產生具有與天然序列相同氨基酸編碼能力的合成v序列。合成的重鏈和κ鏈序列可以如下三種方式不同于天然序列：重復的核苷酸堿基串被中斷以促進寡核苷酸合成和pcr擴增；根據kozak規則(kozak，1991，j.biol.chem.266：19867-19870)并入最佳的翻譯起始位點；以及在翻譯起始位點的上游設計hindiii位點。

對于重鏈和輕鏈可變區，優化的編碼和對應的非編碼鏈序列大約在對應的非編碼寡核苷酸的中點處被分解成30～50個核苷酸。因此，對于每條鏈，所述寡核苷酸可被組裝成為跨越150～400個核苷酸區段的重疊雙鏈組。隨后將匯集池(pool)用作模板以產生150～400個核苷酸的pcr擴增產物。一般來說，單個可變區核苷酸組將被分解成兩個匯集池，其被分別擴增以生成兩個重疊的pcr產物。隨后通過pcr擴增將這些重疊的產物組合以形成完整的可變區。還可在pcr擴增中理想地包括重鏈或輕鏈恒定區的重疊片段以生成很容易被克隆到表達載體構建體中的片段。

隨后將所重建的嵌合化的或人源化的重鏈和輕鏈可變區與克隆的啟動子、前導、翻譯起始、恒定區、3’非翻譯、聚腺嘌呤和轉錄終止序列組合以形成表達載體構建體。重鏈和輕鏈表達構建體可組合到單個載體中，共轉染、先后轉染或分別轉染到宿主細胞中，隨后使所述宿主細胞融合形成表達這兩個鏈的宿主細胞。描述了用于構建人iggκ表達載體的質粒。可這樣構建所述質粒，以使pcr擴增的v重鏈和vκ輕鏈cdna序列可被用于重新構建完整的重鏈和輕鏈小基因(minigene)。這些質粒可被用于完整地表達人或嵌合igg1，κ或igg4，κ抗體。可構建類似的質粒用于表達其他重鏈同種型，或用于表達包含λ輕鏈的抗體。

因此，在本發明的另一方面中，使用本發明抗cldn6抗體的結構特征以產生結構相關的人源化抗cldn6抗體，其保持至少一種本發明抗體的功能特性(例如，與cldn6結合)。更具體地說，小鼠單克隆抗體的一個或更多個cdr區可與已知的人框架區和cdr重組地組合以產生本發明的其他重組設計的人源化抗cldn6抗體。

與表達抗原之細胞的結合

使用標準的結合測定(例如，實施例中列出的測定(例如，elisa、western印跡、免疫熒光和流式細胞術分析))，可測定抗體與cldn6結合的能力。

分離和表征抗體

為純化抗cldn6抗體，可將所選擇的雜交瘤培養于兩升的旋轉瓶(spinner-flask)中用于單克隆抗體的純化。或者，可在基于透析的生物反應器中產生抗cldn6抗體。可過濾上清液，(如果必要的話)濃縮，隨后用蛋白質g-瓊脂糖凝膠(sepharose)或蛋白質a-瓊脂糖凝膠進行親和層析。可通過凝膠電泳和高效液相色譜驗證被洗脫的igg以確保純度。緩沖溶液可更換為pbs，并且可使用1.43的消光系數通過od280測定濃度。可將單克隆抗體分裝并儲存于-80℃。

為了測定所選擇的抗cldn6單克隆抗體是否與獨特的表位結合，可使用位點定向誘變或多位點定向誘變。

同種型測定

為測定純化抗體的同種型，可用多種商業化試劑盒(例如，zymed，rochediagnostics)進行同種型elisa。可用抗小鼠ig包被微滴定板的孔。封閉之后，使所述板與單克隆抗體或純化的同種型對照在環境溫度下反應兩小時。隨后，可使所述孔與小鼠igg1、igg2a、igg2b或igg3、iga或小鼠igm特異性的過氧化物酶綴合的探針反應。清洗之后，可用abts底物(1mg/ml)顯色，并分析405～650的od。或者，可按照制造商的描述使用isostrip小鼠單克隆抗體同種型試劑盒(mousemonoclonalantibodyisotypingkit)(roche，cat.no.1493027)。

流式細胞術分析

為了證明經免疫小鼠的血清中存在抗cldn6抗體或者單克隆抗體與表達cldn6的活細胞相結合，可使用流式細胞術。可將天然或轉染后表達cldn6的細胞系和缺乏cldn6表達的陰性對照(在標準生長條件下生長)與多種濃度的雜交瘤上清液中或含有1％fbs的pbs中的單克隆抗體混合，并可在4℃下孵育30分鐘。清洗之后，可在與一抗染色相同的條件下使apc或alexa647標記的igg抗體與結合了cldn6的單克隆抗體結合。利用光和側向散射特性對單種活細胞進行圈門，可用facs儀通過流式細胞術分析樣品。為了在單次測量中從非特異性的結合物中區分cldn6特異性的單克隆抗體，可應用共轉染的方法。瞬時轉染編碼cldn6的質粒，并可按照上文中的描述對熒光標志物進行染色。與抗體染色的細胞相比，可在不同的熒光通道中檢測經轉染的細胞。因為大多數經轉染的細胞表達這兩種轉基因，cldn6特異性的單克隆抗體優先與表達熒光標志物的細胞結合，而非特異性抗體以與非轉染細胞相當的比率結合。除了流式細胞術測定之外或替代該測定，可使用應用熒光顯微鏡的替代測定。可按照上文的描述準確地對細胞進行染色，并通過熒光顯微鏡檢測。

免疫熒光顯微鏡檢查

為了證明經免疫小鼠的血清中存在抗cldn6抗體或單克隆抗體與表達cldn6的活細胞結合，可使用免疫熒光顯微鏡分析。例如，在標準生長條件下，在補充有10％胎牛血清(fetalcalfserum，fcs)、2mml-谷氨酰胺、100iu/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dmem/f12培養基中，使自然地或轉染之后表達cldn6的細胞系和缺乏cldn6表達的陰性對照生長于腔式載玻片(chamberslide)中。可隨后將細胞與甲醇或多聚甲醛固定，或者不處理。隨后，可使細胞與抗cldn6的單克隆抗體在25℃下反應30分鐘。清洗之后，可使細胞與alexa555標記的抗小鼠igg二抗(分子探針)在相同的條件下反應。可隨后通過熒光顯微鏡檢查細胞。

當用甲醇固定或用多聚甲醛固定并用tritonx-100透化細胞之后，可觀察細胞中的總cldn6水平。可在活細胞和未透化的多聚甲醛固定的細胞中檢測cldn6的表面定位。通過用緊密連接標志物(例如zo-1)共染色，可分析cldn6與緊密連接的其他靶向。此外，可檢測抗體結合的作用和cldn6在細胞膜中的定位。

western印跡

還可通過western印跡測試抗cldn6igg與cldn6抗原的反應性。簡單地說，可制備來自表達cldn6之細胞的細胞提取物和合適的陰性對照，并進行十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate，sds)聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳之后，所分離的抗原將被轉移至硝酸纖維素膜，封閉，用要測試的單克隆抗體探查。可使用抗小鼠igg過氧化物酶檢測igg結合，并用ecl底物顯色。

免疫組織化學

可通過以技術人員公知的方式(例如，使用來自非癌組織或癌組織樣品的多聚甲醛或丙酮固定的冰凍切片或用多聚甲醛固定的石蠟包埋的組織切片，所述樣品獲自常規外科手術過程中的患者或者獲自用自然地或轉染之后表達cldn6之細胞系接種的攜帶異種移植腫瘤的小鼠)進行免疫組織化學來進一步測試抗cldn6小鼠igg與cldn6抗原的反應性。對于免疫染色，可孵育與cldn6反應的抗體，隨后根據供應商的使用說明用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠或山羊抗兔抗體(dako)孵育。

抗體的體外吞噬和細胞殺傷活性

除了與cldn6特異性地結合，可測試抗cldn6抗體介導吞噬和殺傷表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞的能力。在體內模型中篩選之前，單克隆抗體體外活性的測試將提供初始篩選。

抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(adcc)：

簡單地說，可通過ficollhypaque密度離心純化來自健康供體的多形核細胞(polymorphonuclearcell，pmn)、nk細胞、單核細胞、單個核細胞或其他效應細胞，隨后裂解所污染的紅細胞。可將經清洗的效應細胞懸于補充有10％熱滅活的胎牛血清或者作為替代地補充有5％熱滅活的人血清的prmi中，以多種效應細胞對靶細胞的比例與用⁵¹cr標記的表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的靶細胞混合。或者，可以用熒光增強的配體(batda)標記靶細胞。可通過熒光計測量從死細胞釋放的銪與增強的配體的高度熒光的螯合物。另一種作為替代的技術可利用螢光素酶轉染靶細胞。所添加的熒光黃(luciferyellow)隨后可僅被活細胞氧化。可隨后以多種濃度添加純化的抗cldn6igg。可使用無關的人igg作為陰性對照。測定可在37℃下進行4至20小時，這取決于所使用的效應細胞。可通過測量培養物上清液中的⁵¹cr釋放或eutda螯合物的存在來測定樣品的細胞溶解。或者，熒光黃氧化所產生的發光可以是活細胞的量度。

還可在多種組合中測試抗cldn6單克隆抗體以確定細胞溶解是否被多種單克隆抗體所加強。

補體依賴的細胞毒作用(cdc)：

使用多種已知的技術可測試單克隆的抗cldn6抗體介導cdc的能力。例如，可以以技術人員已知的方式從血液中獲得用于補體的血清。為了測定mab的cdc活性，可使用不同的方法。例如可測量⁵¹cr釋放或可使用碘化丙啶(propidiumiodide，pi)排除測定來評價升高的膜通透性。簡單地說，可清洗靶細胞，并且可用多種濃度的mab在室溫下或在37℃下孵育5×10⁵/ml靶細胞10～30分鐘。可隨后添加血清或血漿至終濃度為20％(v/v)，并在37℃下孵育細胞20～30分鐘。可將來自每個樣品的所有細胞添加至facs管中的pi溶液中。隨后可通過使用facsarray的流式細胞術分析立即分析該混合物。

在作為替代的測定中，可在黏附的細胞上測定cdc的誘導。在該測定的一個實施方案中，在測定前24小時，在組織培養平底微滴定板中以3×10⁴/孔的密度接種細胞。次日，除去生長培養基，并以三個重復用抗體孵育所述細胞。用生長培養基或含有0.2％皂苷的生長培養基孵育對照細胞用于分別測定背景裂解和最大裂解。在室溫下孵育20分鐘之后，除去上清液，并向細胞中添加dmem(預熱至37℃)中的20％(v/v)人血漿或血清，并在37℃下再孵育20分鐘。將來自每個樣品的所有細胞添加至碘化丙啶溶液(10μg/ml)中。隨后，用含有2.5μg/ml溴化乙錠的pbs替換上清液，并使用tecansatire在600nm測量以520nm激發后的熒光發射。按以下計算比裂解(specificlysis)的百分比：％比裂解＝(熒光樣品-熒光背景)/(熒光最大裂解-熒光背景)×100。

單克隆抗體抑制細胞增殖

為測試啟動凋亡的能力，可例如在37℃下將單克隆的抗cldn6抗體與cldn6陽性腫瘤細胞或轉染了cldn6的腫瘤細胞一起孵育約20小時。可收獲細胞，在膜聯蛋白-v(annexin-v)結合緩沖液(bdbiosciences)中清洗，與fitc或apc綴合的膜聯蛋白v(bdbiosciences)一起在黑暗中孵育15分鐘。將來自每個樣品的所有細胞添加至facs管中的pi(10μg/ml于pbs中)溶液中，立即通過流式細胞術(見上文)進行評價。或者，可用可商購的試劑盒檢測單克隆抗體對細胞增殖的總體抑制。delfia細胞增殖試劑盒(perkin-elmer，cat.no.ad0200)是基于對微板中增殖細胞的dna合成過程中5-溴-2′-脫氧尿苷(5-bromo-2′-deoxyuridine，brdu)并入之測量的非同位素免疫測定。使用銪標記的單克隆抗體檢測所并入的brdu。為允許抗體檢測，使用固定液(fixsolution)固定細胞并使dna變性。洗掉未結合的抗體，并向從標記的抗體解離到溶液中的銪離子中添加delfia誘導劑，其中它們與delfia誘導劑的組分形成高度熒光的螯合物。所測得的熒光(在檢測中應用時間分辨熒光測定)與每個孔的細胞中dna的合成成比例。

臨床前研究

可在體內模型中(例如，在以(可能在轉染之后)表達cldn6的細胞系接種的攜帶異種移植腫瘤的免疫缺陷的小鼠中)測試與cldn6結合的單克隆抗體以確定其在控制表達cldn6之腫瘤細胞的生長中的效力。

在將表達cldn6之腫瘤細胞異種移植到免疫受損的小鼠或其他動物中之后可使用本發明的抗體進行體內研究。可向無腫瘤小鼠施用抗體，隨后注射腫瘤細胞以測量抗體預防腫瘤形成或腫瘤相關癥狀的作用。可向荷瘤小鼠施用抗體以確定每種抗體降低腫瘤生長、轉移或腫瘤相關癥狀的治療效果。抗體應用可與其他物質(例如，抑制細胞的藥物、生長因子抑制劑、細胞周期阻斷劑、血管發生抑制劑或其他抗體)的應用相組合以測定組合的協同效力和潛在毒性。為分析本發明抗體所介導的毒性副作用，可用抗體或對照試劑接種動物，并徹底地研究可能與cldn6抗體治療相關的癥狀。體內應用cldn6抗體的可能的副作用特別地包括表達cldn6之組織(包括胎盤)中的毒性。在人和其他物種(例如，小鼠)中識別cldn6的抗體特別地可用于預測在人中應用單克隆cldn6抗體所介導的潛在副作用。

表位作圖

可按照“epitopemappingprotocols(methodsinmolecularbiology)byglenne.morrisisbn-089603-375-9和“epitopemapping：apracticalapproach”practicalapproachseries，248byolwynm.r.westwood，frankc.hay中的詳細描述來進行本發明抗體所識別表位的作圖。

i.與cldn6結合的雙特異性/多特異性分子

在本發明的另一個實施方案中，抗cldn6抗體可被衍生化或與其他功能分子(例如，其他肽或蛋白質(例如，fab′片段))相連接以生成與多個結合位點或目標表位結合的雙特異性或多特異性分子。例如，本發明的抗體可與一個或更多個其他結合分子(例如，其他抗體、肽或結合模擬物)功能性地連接(例如，通過化學偶連、基因融合、非共價締合等)。

因此，本發明包括雙特異性和多特異性分子，其包含至少一個對cldn6的第一結合特異性和對第二目標表位的第二結合特異性。在本發明的一個具體實施方案中，所述第二目標表位是fc受體(例如，人fc-γri(cd64)或人fc-α受體(cd89)，或者t細胞受體(例如，cd3)。因此，本發明包括能夠與表達fc-γr、fc-αr或fc-εr之效應細胞(例如，單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(pmn))以及與表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之靶細胞相結合的雙特異性和多特異性分子。這些雙特異性和多特異性分子可將表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞靶向效應細胞，并且可觸發fc受體介導的效應細胞活性，例如吞噬表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞、抗體依賴性細胞的細胞毒作用(adcc)、細胞因子釋放或生成超氧陰離子。

本發明的雙特異性和多特異性分子還可包括除了抗fc結合特異性和抗cldn6結合特異性之外的第三結合特異性。在一個實施方案中，所述第三結合特異性是抗增強因子(enhancementfactor，ef)部分，例如與參與細胞毒活性并因而升高對靶細胞的免疫應答之表面蛋白質相結合的分子。“抗增強因子部分”可以是抗體、功能性抗體片段或與給定分子(例如，抗原或受體)相結合的配體，并因而導致增強對fc受體或靶細胞抗原的結合決定簇作用。“抗增強因子部分”可與fc受體或靶細胞抗原結合。或者，所述抗增強因子部分可與這樣的實體結合，所述實體不同于以第一和第二結合特異性結合的實體。例如，所述抗增強子因子部分可與細胞毒t細胞(例如，通過cd2、cd3、cd8、cd28、cd4、cd40、icam-1或導致升高對靶細胞之免疫應答的其他免疫細胞)相結合。

在一個實施方案中，本發明的雙特異性和多特異性分子包含作為結合特異性的至少一個抗體(包括例如fab、fab′、f(ab′)2、fv或單鏈fv)。所述抗體還可以是輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段(例如，ladner等，us4,946,778中描述的單鏈構建體或fv)。所述抗體還可以是us2003/0118592和us2003/0133939中公開的結合結構域免疫球蛋白融合蛋白質。

在一個實施方案中，本發明的雙特異性和多特異性分子包含對存在于效應細胞表面上的fc-γr或fc-αr的結合特異性，以及對靶細胞抗原(例如，cldn6)的第二結合特異性。

在一個實施方案中，通過單克隆抗體提供對fc受體的結合特異性，所述結合不被人免疫球蛋白g(igg)所阻斷。本文中使用的術語“igg受體”是指位于1號染色體上的八個γ-鏈基因中的任一個。這些基因編碼總共12個跨膜或可溶的受體同種型，其分為三個fc-γ受體類別：fc-γri(cd64)、fc-γrii(cd32)和fc-γriii(cd16)。在一個優選的實施方案中，所述fc-γ受體是人高親和力fc-γri。

在另一些優選的實施方案中，通過與人iga受體(例如，fc-α受體(fc-αri(cd89)))結合的抗體提供對fc受體的結合特異性，所述結合優選地不被人免疫球蛋白a(iga)所阻斷。術語“iga受體”意在包括位于19號染色體上的一個α-基因(fc-αri)的基因產物。已知該基因編碼多種55至110kda的選擇性剪接的膜同種型。fc-αri(cd89)組成性地表達在單核細胞/巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞上，但不表達在非效應細胞群上。fc-αri對iga1和iga2都具有中度親和力，其在暴露于細胞因子(例如，g-csf或gm-csf)后升高(morton，h.c.等(1996)criticalreviewsinimmunology16：423-440)。已描述了四種fc-αri特異性的單克隆抗體(確認為a3、a59、a62和a77)，其在iga配體結合結構域以外結合fc-αri(monteiro，r.c.等(1992)j.immunol.148：1764)。

在另一個實施方案中，所述雙特異性分子是包含兩個根據本發明的具有互補功能活性的單克隆抗體，例如，一個抗體主要通過誘導cdc發揮作用，而另一個抗體主要通過誘導凋亡發揮作用。

本文中使用的“效應細胞特異性抗體”是指與效應細胞的fc受體結合的抗體或功能性抗體片段。用于本發明的優選的抗體在不被內源性免疫球蛋白所結合的位點與效應細胞的fc受體結合。

本文中使用的術語“效應細胞”是指參與免疫應答之效應期(而不是免疫應答的識別和活化期)的免疫細胞。示例性的免疫細胞包括骨髓或淋巴來源的細胞，例如淋巴細胞(例如，b細胞和t細胞(包括細胞毒t細胞(cytolytictcell，ctl))、殺傷細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、多形核細胞、粒細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞。一些效應細胞表達特定的fc受體并且執行特定的免疫功能。在一些優選的實施方案中，效應細胞能夠誘導抗體依賴性細胞的細胞毒作用(adcc)，例如嗜中性粒細胞能夠誘導adcc。例如，表達fcr的單核細胞、巨噬細胞參與對靶細胞的特異性殺傷并且將抗原呈遞至免疫系統的其他組分，或者與呈遞抗原的細胞結合。在另一些實施方案中，效應細胞可吞噬靶抗原、靶細胞或微生物。可通過體液因子(例如細胞因子)調節效應細胞上特定fcr的表達。例如，已發現干擾素γ(ifn-γ)上調fc-γri的表達。這種增強的表達升高荷有fc-γri之細胞對靶標的細胞毒活性。效應細胞可吞噬靶抗原或靶細胞或使其溶解。

“靶細胞”應當意為對象(例如，人或動物)中可被本發明抗體所靶向的任何不合需要的細胞。在一些優選的實施方案中，所述靶細胞是表達或過表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞。表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞通常包括腫瘤細胞。

ii.免疫綴合物

在另一個方面中，本發明以抗cldn6抗體與治療部分或治療劑(例如，細胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性同位素)綴合為特征。這樣的綴合物在本文中稱為“免疫綴合物”。包含一個或更多個毒素的免疫綴合物被稱為“免疫毒素”。細胞毒素或細胞毒劑包括對細胞有害并且特別是殺傷細胞的任何藥劑。實例包括泰素(taxol)、松胞菌素b(cytochalasinb)、短桿菌肽d(gramicidind)、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、多柔比星、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素d、1-去氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素，及其類似物或同系物。

用于形成本發明免疫綴合物的合適治療劑包括但不限于抗代謝物(例如，甲氨蝶呤、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉濱、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪)、烷化劑(例如，氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、環磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈佐星、絲裂霉素c和順式-二氯二氨鉑(ii)(ddp)順鉑)、蒽環類(例如，柔紅霉素(以前稱為道諾霉素)和多柔比星)、抗生素類(例如，更生霉素(以前稱為放線菌素)、博來霉素、光神霉素和安曲霉素(anthramycin，amc))和抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春堿)。在一個優選的實施方案中，所述治療劑是細胞毒劑或放射毒劑。在另一個實施方案中，所述治療劑是免疫抑制劑。在另一個實施方案中，所述治療劑是gm-csf。在一個優選的實施方案中，所述治療劑是多柔比星、順鉑、硫酸博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環磷酰胺或蓖麻毒蛋白a(ricina)。

本發明的抗體還可與放射性同位素(例如，碘-131、釔-90或銦-111)綴合以生成用于治療cldn6相關疾病(例如，癌癥)的細胞毒性的放射性藥品。本發明的抗體綴合物可用于修飾給定的生物應答，并且藥物部分不被解釋為限于經典的化療劑。例如，所述藥物部分可以是具有所需生物活性的蛋白質或多肽。這樣的蛋白質可包括例如酶活性的毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白(abrin)、蓖麻毒蛋白a、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質，例如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或者生物應答調節劑，例如淋巴因子、白介素-1(“il-1”)、白介素-2(“il-2”)、白介素-6(“il-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“gm-csf”)、粒細胞集落刺激因子(“g-csf”)或其他生長因子。

用于將這樣的治療部分與抗體綴合的技術是公知的，參見例如arnon等，″monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy″，inmonoclonalantibodiesandcancertherapy，reisfeld等(eds.)，pp.243-56(alanr.liss，inc.1985)；hellstrom等，″antibodiesfordrugdelivery″，incontrolleddrugdelivery(2nded.)，robinson等(eds.)，pp.623-53(marceldekker，inc.1987)；thorpe，″antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy：areview″，inmonoclonalantibodies′84：biologicalandclinicalapplications，pincheraetal.(eds.)，pp.475-506(1985)；″analysis，results，andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy″，inmonoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy，baldwin等(eds.)，pp.303-16(academicpress1985)，和thorpe等，″thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody-toxinconjugates"，immunol.rev.，62：119-58(1982)。

在另一個實施方案中，將根據本發明的抗體與接頭-螯合劑(linker-chelator)(例如，替伊莫單抗(tiuxetan))相連接，這使得抗體與放射性同位素綴合。

iii.藥物組合物

在另一個方面中，本發明提供含有本發明抗體之一或之組合的組合物(例如，藥物組合物)。可用可藥用載劑或稀釋劑以及根據常規技術(例如，remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第19版，gennaro編，mackpublishingco.，easton，pa，1995中所公開的技術)的任何其他已知輔料或賦形劑配制所述藥物組合物。在一個實施方案中，所述組合物包含以不同機制發揮作用的本發明的多種(例如，兩種或更多種)分離的抗體的組合，例如，主要通過誘導cdc而發揮作用的一種抗體與主要通過誘導凋亡而發揮作用的另一種抗體的組合。

還可在組合治療中(即與其他藥劑組合)施用本發明的藥物組合物。例如，所述組合治療可包括具有至少一種抗炎劑或至少一種免疫抑制劑的本發明組合物。在一個實施方案中，這樣的治療劑包括一種或更多種抗炎劑，例如甾體藥物或nsaid(非甾體抗炎藥)。優選的藥劑包括例如阿司匹林和其他水楊酸鹽/酯、cox-2抑制劑(例如，羅非昔布(萬絡(vioxx))和塞來昔布(西樂葆(celebrex)))、nsaid例如布洛芬(美林(motrin)、艾德維爾(advil))、非諾洛芬(禮來痛保(nalfon))、萘普生(消痛靈(naprosyn))、舒林酸(奇諾力(clinoril))、雙氯芬酸(扶他林(voltaren))、吡羅昔康(費啶(feldene))、酮洛芬(奧魯地(orudis))、二氟尼柳(二氟尼柳(dolobid))、萘丁美酮(瑞力芬(relafen))、依托度酸(羅丁(lodine))、奧沙普秦(丙嗪(daypro))和吲哚美辛(消炎痛(indocin))。

在另一個實施方案中，這樣的治療劑包括引起調節性t細胞的耗盡或功能失活的藥劑，例如低劑量的環磷酰胺(cyclophosphamid)、抗ctla4抗體、抗il2或抗il2受體的抗體。

在另一個實施方案中，這樣的治療劑包括一種或更多種化療劑，例如泰素衍生物、泰素帝、吉西他濱、5-氟尿嘧啶、多柔比星(阿霉素)、順鉑(普雷蒂諾(platinol))、環磷酰胺(cytoxan、procytox、neosar)。在另一個實施方案中，可以與化療劑組合施用本發明的抗體，所述化療劑在患有癌癥(例如，本文中描述的癌癥類型)的患者中優選地表現出治療效果。

在另一個實施方案中，可與放射治療和/或自體外周干細胞或骨髓移植聯合施用本發明的抗體。

本文中使用的“可藥用載劑”包括生理學上相容的任何和全部溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。優選地，所述載劑適合靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如，通過注射或輸注)。根據施用途徑，活性化合物(例如，抗體、雙特異性和多特異性分子)可被包被于這樣的材料中，所述材料保護所述化合物免受酸和可失活所述化合物之其他天然條件的作用。

“可藥用鹽”是指保持母體化合物的所需生物活性且不賦予任何不期望的毒理學作用(參見例如berge，s.m，等(1977)j.pharm.sci.66：1-19)的鹽。

所述鹽的實例包括酸加成鹽(acidadditionsalt)和堿加成鹽(baseadditionsalt)。酸加成鹽包括源自無毒性無機酸的鹽，所述無機酸例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等，以及源自無毒有機酸的鹽，所述有機酸例如脂肪族單羧酸和二羧酸、苯基取代的烷酸、羥基烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等。堿加成鹽包括源自堿土金屬(例如，鈉、鉀、鎂、鈣等)，以及來自無毒性的有機胺(例如，n，n′-二芐基乙二胺、n-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等)的鹽。

可通過現有技術中已知的多種方法施用本發明的組合物。技術人員會理解，施用途徑和/或方式會根據期望的結果而不同。可與載劑制備活性化合物，所述載劑會保護所述化合物免于迅速釋放，例如控釋制劑(包括植入劑、經皮貼劑和微膠囊遞送系統)。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備這種制劑的方法是本領域技術人員廣泛知曉的。參見例如sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems，j.r.robinson編，marceldekker，inc.，newyork，1978。

為了以某些施用途徑施用本發明的化合物，有必要用防止其失活的材料包被所述化合物或與所述化合物共施用。例如，可在合適的載劑(例如，脂質體或稀釋劑)中向對象施用所述化合物。可藥用稀釋劑包括鹽水和水緩沖溶液。脂質體包括水包油包水型cgf乳劑，以及常規脂質體(strejan等(1984)j.neuroimmunol.7：27)。

可藥用載劑包括無菌水溶液或分散體以及用于臨時制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。使用這樣的介質和藥劑用于藥物活性物質是現有技術中已知的。除非常規介質或藥劑與活性化合物不相容，均考慮將其用于本發明的藥物組合物中。還可將補充的活性化合物并入所述組合物中。

治療組合物通常必須是無菌的，并且在制造和儲存條件下是穩定的。可作為溶液、微乳劑、脂質體或適于高藥物濃度的其他有序結構來配制所述組合物。所述載劑可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適混合物的溶劑或分散介質。可例如通過使用包衣(例如，卵磷脂)，通過維持所需的顆粒大小(在分散體的情況中)以及通過使用表面活性劑來維持合適的流動性。在很多情況下，所述組合物中會優選地包含等滲劑(例如，糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇或氯化鈉)。可通過在所述組合物中包含延緩吸收的試劑(例如，單硬脂酸鹽和明膠)來實現可注射組合物的延長吸收。

可通過以所需的量將活性化合物并入合適的溶劑(其具有上文中所列舉成分之一或之組合)來按需要制備無菌可注射溶液，隨后無菌微孔過濾。

一般來說，通過將活性化合物并入無菌載劑來制備分散體，所述載劑含有基本分散介質和所需的上文中所列舉的其他成分。在無菌粉末用于制備無菌可注射溶液的情況下，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，這產生來自其之前經無菌過濾之溶液的活性成分加任何附加的期望成分的粉末。

調節劑量方案以提供最佳的期望應答(例如，治療性應答)。例如，可施用單次推注，可隨時間施用多個分開的劑量，或可按照治療情況之緊急程度所指示的那樣成比例地降低或升高劑量。以劑量單位形式配制胃腸外組合物對于方便施用和劑量均勻度來說是尤其有利的。本文中使用的劑量單位形式是指適合作為單一劑量用于要治療之對象的物理上離散的單位；每個單位含有與期望藥物載劑聯合的經計算產生期望治療效果的預先確定量的活性化合物。

可藥用抗氧化劑的實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚(butylatedhydroxyanisole，bha)、丁羥甲苯(butylatedhydroxytoluene，bht)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

對于治療性組合物，本發明的制劑包括合適的用于經口、經鼻、表面(包括口腔和舌下)、經直腸、經陰道和/或腸胃外施用的組合物。所述制劑可方便地以單位劑型存在并且可通過藥學領域中已知的任何方法來制備。可與載劑材料組合以產生單個劑型的活性成分的量會根據要治療的對象和具體的施用方式而不同。可與載劑材料組合以產生單個劑型的活性成分的量通常會是產生治療作用的組合物的量。

適于經陰道施用的本發明的制劑還包括以下含有現有技術中已知的合適載劑的制劑：子宮托(pessary)、塞子(tampon)、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑、噴霧劑。本發明組合物的用于表面或經皮施用的劑型包括散劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、溶液劑、貼劑和吸入劑。可在無菌條件下將活性化合物與可藥用載劑以及與可能需要的任何防腐劑、緩沖劑或拋射劑混合。

本文中使用的詞語“腸胃外施用”和“腸胃外地使用”意為不同于腸胃和表面施用的施用方式，通常通過注射施用，所述注射包括但不限于靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。

可用于本發明藥物組合物的合適的水或非水載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油(例如，橄欖油)和可注射的有機酯(例如，油酸乙酯)。可例如通過使用包衣材料(例如，卵磷脂)，通過維持所需的顆粒大小(在分散體的情況中)以及通過使用表面活性劑來維持合適的流動性。

這些組合物還可含有輔料，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可通過滅菌過程以及通過包含多種抗菌和抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚山梨酸等)來確保防止微生物的存在。還可在所述組合物中理想地包含等滲劑，例如糖、氯化鈉等。此外，可通過包含延緩吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)來產生可注射藥物形式的延長吸收。

不管選擇何種施用途徑，通過本領域技術人員已知的常規方法，可將可以以合適的水化形式使用的本發明化合物和/或本發明組合物配制成可藥用劑型。

本發明組合物中活性成分的實際劑量水平可以不同，以獲得對于具體患者、組合物和施用方式來說有效達到期望治療應答而對所述患者沒有毒性之量的活性成分。所選擇的劑量水平將取決于多種藥物代謝動力學因素，包括所使用的本發明具體組合物的活性，施用途徑，施用時間，所使用的具體化合物的排泄速率，治療的持續時間，與所使用的具體組合物組合使用其他藥物、化合物和/或物質，年齡，性別，體重，狀況，一般健康和被治療患者之前的病史，以及醫學領域中公知的類似因素。

具有本領域普通技能的醫生或獸醫可很容易地確定所需的藥物組合物的有效量并開處方。例如，醫生或獸醫可使所述藥物組合物中使用的本發明化合物的劑量始于低于達到期望治療作用所需要的水平，并逐漸升高劑量，直至達到期望的作用。一般來說，本發明組合物的合適日劑量會是這樣的化合物量，其是有效產生治療作用的最低劑量。這樣的有效劑量通常會取決于上文中所描述的因素。所述施用優選地是靜脈內、肌內、腹膜內或皮下施用，優選地向臨近靶標的位置施用。如果期望的話，可在整日中，以合適的間隔，作為2、3、4、5、6或更多個亞劑量，任選地以單位劑型，分別施用治療性組合物的有效日劑量。雖然可單獨施用本發明的化合物，優選地作為藥物制劑(組合物)施用所述化合物。

在一個實施方案中，可通過輸注(優選長時間(例如，超過24小時)緩慢連續輸注)施用本發明的抗體，以降低毒性的副作用。還可以通過在2至24小時(例如，2至12小時)的時間段內連續輸注來進行所述施用。可按需要重復這樣的方案一次或更多次，例如6個月或12個月之后。施用后可通過使用靶向抗cldn6抗體的抗特應抗體(anti-idiotypicantibody)在生物樣品中測量循環單克隆抗cldn6抗體的量來確定或調節劑量。

在另一個實施方案中，通過維持治療(例如，每周1次，為期6個月或更長)施用所述抗體。

在另一個實施方案中，可通過這樣的方案施用根據本發明的抗體，所述方案包括一次輸注抗cldn6抗體，隨后輸注與放射性同位素綴合的抗cldn6抗體。例如7至9天之后可重復所述方案。

在本發明的一個實施方案中，以脂質體配制本發明的治療性化合物。在一個更優選的實施方案中，所述脂質體包括靶向部分。在一個最優選的實施方案中，通過向臨近期望區域(例如，腫瘤的位置)的位置推注注射來遞送脂質體中的治療性化合物。所述組合物必須是易于注射器注射的某種程度上的流體。它在制造和儲存的條件下必須是穩定的，并且必須防止微生物(例如，細菌和真菌)的污染作用而保存。

在另一個實施方案中，可以這樣配制本發明的抗體以防止或降低其轉運通過胎盤。這可通過現有技術中已知的方法(例如，通過抗體的聚乙二醇化或通過使用f(ab)2′片段)來進行。還可參照″cunningham-rundlesc，zhuoz，griffithb，keenanj.(1992)biologicalactivitiesofpolyethylene-glycolimmunoglobulinconjugates.resistancetoenzymaticdegradation.j.immunol.methods，152：177-190；和參照″landorm.(1995)maternal-fetaltransferofimmunoglobulins，ann.allergyasthmaimmunol.74：279-283。

可通過客觀的腫瘤響應(其可以是完全的或部分的)來測量腫瘤治療的“治療有效劑量”。完全響應(completeresponse，cr)被定義為沒有疾病的臨床的、放射學的或其他證據。部分響應(partialresponse，pr)來自降低總腫瘤大小超過50％。進展的中位時間是表征客觀腫瘤響應之持久性的量度。

還可通過穩定腫瘤之進展的能力來測量腫瘤治療的“治療有效劑量”。可在預測在人腫瘤中之效力的動物模型系統中評價化合物抑制腫瘤的能力。或者，可通過技術人員已知的體外測定，通過檢測化合物抑制細胞生長的能力或檢測凋亡來評價化合物的這種特征。治療有效量的治療性化合物可降低腫瘤大小，或者以其他方式在對象中改善癥狀。本領域技術人員能夠根據這樣的因素測定所述量：對象的身材大小、對象癥狀的嚴重程度以及所選擇的具體組合物或施用途徑。

所述組合物必須是無菌的并且所述組合物是可通過注射器遞送之程度的流體。除了水，載劑可以是等滲緩沖鹽水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚丙二醇等)及其合適的混合物。可例如通過使用包衣(例如，卵磷脂)，通過維持所需的顆粒大小(在分散體的情況中)以及通過使用表面活性劑來維持合適的流動性。在很多情況下，在所述組合物中優選地包含等滲劑，例如糖、多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)和氯化鈉。可通過在所述組合物中包含延緩吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)來產生可注射組合物的長期吸收。

如上文中所描述的那樣，當由惰性稀釋劑或可吸收的可食用載劑合適地保護所述活性化合物時，可經口施用所述化合物。

iv.本發明的應用和方法

本發明的抗體(包括本文中描述的免疫綴合物、雙特異性/多特異性分子、組合物和其他衍生物)具有多種治療效用，涉及與表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞相關疾病的治療。例如，可向培養物中的細胞(例如，體外或離體)或向人對象(例如，體內)施用所述抗體以治療或預防多種疾病，例如本文中描述的那些疾病。優選的對象包括患有這樣疾病的人患者：所述疾病可通過殺傷患病的細胞(特別是以與正常細胞相比改變的cldn6表達模式和/或改變的cldn6與細胞表面締合模式為特征的細胞)而糾正或改善。

例如，在一個實施方案中，本發明的抗體可用于治療患有腫瘤發生性疾病(例如，以存在腫瘤細胞為特征的疾病，所述腫瘤細胞表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征)的對象。可被治療和/或預防的腫瘤發生性疾病的實例包括所有表達cldn6的癌和腫瘤實體，包括本文中描述的那些。

根據本發明描述的藥物組合物和治療方法還可用于免疫或接種以預防本文中描述的疾病。

在另一個實施方案中，本發明的抗體可用于檢測cldn6的水平或cldn6的具體形式，或者在其膜表面上含有cldn6之細胞的水平，所述水平可隨后與某些疾病或疾病癥狀(如上文所述)相聯系。或者，所述抗體可用于耗盡表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞的功能或與其相互作用，因而表明這些細胞是重要的疾病中介物。這可通過將樣品和對照樣品與抗cldn6抗體在允許所述抗體與cldn6之間形成復合物的條件下相接觸而實現。在所述樣品和對照樣品(即，參比樣品)中檢測和比較抗體與cldn6之間所形成的任何復合物。

可首先測試本發明的抗體與體外治療或診斷應用相關的結合活性。例如，可按照本文中的描述使用流式細胞術測定法來測試所述抗體。

本發明的抗體可用于體內或體外誘導一種或更多種以下生物活性：抑制表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞的生長和/或分化；殺傷表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征的細胞；在效應細胞存在下介導表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞的吞噬或adcc；在補體存在下介導表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞的吞噬或adcc；介導表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞的凋亡；誘導同型黏著；和/或結合cldn6之后誘導轉位到脂膜筏(lipidraft)中。

在一個具體的實施方案中，體內或體外使用所述抗體以治療、預防或診斷多種cldn6相關疾病。除此之外，cldn6相關疾病的實例還包括癌癥，例如本文中描述的癌癥。

如上文所述，可與一種或其他更多種的治療劑(例如，細胞毒劑、放射毒劑、抗血管發生劑或和免疫抑制劑)共施用本發明的抗cldn6抗體以降低針對本發明抗體之免疫應答的誘導。所述抗體可與所述治療劑(作為免疫復合物)相連接或者可與所述治療劑分別施用。在后一種情況(分別施用)下，可在所述治療劑之前、之后施用或與所述治療劑同時施用所述抗體，或者可與其他已知的治療(例如，抗癌治療(例如，放療))共施用所述抗體。除此之外，這樣的治療劑還包括抗腫瘤劑(如上文所列)。與化療劑共施用本發明的抗cldn6抗體提供通過不同機制運作而產生對腫瘤細胞之細胞毒作用的兩種抗癌劑。這樣的共施用可解決由于發生對藥物的抗性或腫瘤細胞抗原性的改變而引起的問題，其可導致它們不與所述抗體反應。

在補體存在下，還可使用具有補體結合位點(例如，igg1、igg2或igg3或者igm中與補體結合的部分)的本發明組合物(例如，抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫綴合物)。在一個實施方案中，用本發明的結合劑和合適的效應細胞離體處理包含靶細胞的細胞群可輔之以添加補體或含有補體的血清。通過與補體蛋白結合，可提高對以本發明的結合劑包被的靶細胞的吞噬。在另一個實施方案中，用本發明的組合物包被的靶細胞還可被補體所溶解。在另一個實施方案中，本發明的組合物不激活補體。

還可與補體一起施用本發明的組合物。因此，包含抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補體的組合物在本發明的范圍之內。這些組合物是有利的，在于所述補體與所述抗體、多特異性或雙特異性分子緊鄰。

或者，可分別施用本發明的抗體、多特異性或雙特異性分子以及補體或血清。本發明的組合物與靶細胞的結合可導致cldn6抗原-抗體復合物轉位到細胞膜的質膜筏中。所述轉位產生可有效激活和/或增強cdc的高密度的抗原-抗體復合物。

包含本發明抗體組合物(例如，抗體和免疫綴合物)以及使用說明的試劑盒也在本發明的范圍之內。所述試劑盒還可含有一種或更多種附加的試劑，例如免疫抑制試劑、細胞毒劑或放射毒劑，或者一種或更多種附加的本發明抗體(例如，具有補充活性的抗體)。

因此，可向用本發明抗體組合物治療的患者額外地施用(施用本發明的抗體之前、與其同時或之后)增強或擴大本發明抗體之治療作用的其他治療劑(例如，細胞毒劑或放射毒劑)。

在另一些實施方案中，可用(通過例如用細胞因子治療對象)調節(例如，增強或抑制)fc-γ或fc-α受體之表達或活性的藥劑額外地治療對象。優選地細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(g-csf)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、干擾素-γ(ifn-γ)和腫瘤壞死因子(tnf)。用于升高本文中描述的抗體和藥物組合物之治療效果的其他重要試劑是β-葡聚糖(β-glucan)，其是支鏈葡萄糖殘基的同多糖，并且是由多種植物和微生物(例如，細菌、藻類、真菌、酵母和谷物)產生的。還可使用生物所產生的β-葡聚糖片段。優選地，所述β-葡聚糖是β(1，3)葡萄糖的聚合物，其中主鏈葡萄糖單位的至少一些(例如，主鏈葡萄糖單位的3～6％)具有分支，例如β(1，6)分支。

在一個具體的實施方案中，本發明提供用于在樣品中檢測cldn6抗原之存在或者測量cldn6抗原之量的方法，其包括在允許所述抗體或其部分與cldn6之間形成復合物的條件下使所述樣品和對照樣品與特異性結合cldn6的抗體相接觸。隨后檢測復合物的形成，其中所述樣品與對照樣品相比，復合物形成之間的差異指示所述樣品中存在cldn6抗原。

在另一個實施方案中，本發明提供用于體內或體外檢測表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞的存在或對其量進行定量的方法。所述方法包括(i)向對象施用與可檢測標志物綴合的本發明組合物；和(ii)使所述對象暴露于用于檢測所述可檢測標志物的方法以鑒定含有表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞的區域。

上文中描述的方法可特別地用于診斷cldn6相關疾病和/或cldn6轉位相關疾病，例如癌疾病。優選地，樣品中cldn6的量高于對照樣品中cldn6的量指示所述樣品所來源的對象(特別是人)中存在cldn6相關疾病。

當用于上文中所描述的方法時，可為本文中描述的抗體提供發揮以下功能的標記物：(i)提供可檢測信號；(ii)與第二標記物相互作用以修飾所述第一或第二標記物所提供的可檢測信號，例如fret(熒光共振能力轉移，fluorescenceresonanceenergytransfer)；(iii)通過電荷、疏水性、形狀或其他物理參數影響遷移率(例如，電泳遷移率)，或者(iv)提供捕獲部分，例如親和力、抗體/抗原或離子絡合。適合作為標記物的結構例如熒光標記物、發光標記物、發色團標記物、放射性同位素標記物、同位素標記物，優選穩定的同位素標記物、同量異位素標記物(isobariclabel)、酶標記物、顆粒標記物(特別是金屬顆粒標記物、磁性顆粒標記物、聚合物顆粒標記物)、小有機分子(例如，生物素、受體的配體或結合分子(例如，細胞黏附蛋白或卵磷脂))、可通過使用結合劑檢測包含核酸和/或氨基酸殘基的標記物序列等。標記物非限制性地包括硫酸鋇、碘西他酸、碘番酸、胺碘苯丙酸鈣、泛影酸鈉、泛影葡胺、甲泛葡胺、酪泮酸鈉和放射診斷劑(包括正電子發射體，(例如氟-18和碳-11)、γ發射體(例如，碘-123、锝-99m、碘-131和銦-111)、核磁共振核素(例如，氟和釓))。

在另一個實施方案中，通過將化合物與抗體相連接，本發明的免疫綴合物可用于將化合物(例如，治療劑、標記物、細胞毒素、放射毒素、免疫抑制劑等)靶向具有與其表面締合之cldn6的細胞。因此，本發明還提供用于離體或體外定位表達cldn6并以cldn6與其細胞表面相締合為特征之細胞(例如，循環腫瘤細胞)的方法。

通過以下實施例進一步舉例說明本發明，所述實施例不被解釋為限制本發明的范圍。

實施例

本文中描述或以本身已知的和例如在sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，第2版(1989)coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.中所描述的方式實施本文中使用的技術和方法。除非具體指明，根據制造商的信息實施所有方法(包括試劑盒和試劑的使用)。

實施例1：使用實時rt-pcr在正常組織、癌性組織和細胞系中對cldn6表達進行定量

使用rneasyminikit(qiagen)從冷凍的組織標本和癌細胞系中提取總細胞rna，根據制造商的說明，以dt18寡核苷酸為引物用superscriptii(gibco/lifetech)逆轉錄。通過在30個循環的pcr中擴增p53轉錄物而測試所獲得的cdna的完整性。以hprt歸一化之后，使用δδct計算對cldn6的表達進行定量。

對于每種正常組織類型，測試來自三個個體的組織。在40個循環的rt-pcr之后，僅可在正常組織中檢測到痕量的cldn6轉錄物。輕度超過表達截斷值的唯一正常組織是胎盤。

與正常組織相反，我們發現來自卵巢癌(腺癌)、肺癌(nsclc，在腺癌中具有最高頻率和表達水平)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(基底細胞癌和鱗狀細胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(惡性多形性腺瘤)、肉瘤(滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、腎細胞癌(明細胞癌和乳頭狀癌)、子宮癌以及癌細胞系a2780(卵巢癌)、nih-ovcar3(卵巢癌)、hct-116(結腸癌)、efo-27(卵巢癌)、cpc-n(sclc)、nci-h552(nsclc)、snu-1(胃癌)、katoiii(胃癌)、yapc(胰腺癌)、ags(胃癌)、fu97(胃癌)、mkn7(胃癌)。

實施例2：使用western印跡分析對正常組織、癌性組織和細胞系中的cldn6表達進行定量

對于western印跡分析，使用從以laemmli裂解緩沖液裂解的細胞中提取的20μg總蛋白質。在還原性樣品緩沖液(roth)中稀釋提取物，進行sds-page，隨后電轉移到pvdf膜(pall)上。用與cldn6(arp)和β-肌動蛋白(abeam)反應的多克隆抗體進行免疫染色，隨后通過用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗(dako)檢測一抗。

對于每個正常的組織類型，測試來自多達5個個體的組織裂解液。在所分析的任何正常組織中未檢出cldn6蛋白表達。與正常組織相反，在來自卵巢癌和肺癌的樣品中檢出了高表達的cldn6蛋白。在nih-ovcar3(卵巢癌)、mkn7(胃癌)、ags(胃癌)、cpc-n(sclc)、hct-116(結腸癌)、fu97(胃癌)、nec8(睪丸胚胎性癌)、jar(胎盤絨毛膜癌)、jeg3(胎盤絨毛膜癌)、bewo(胎盤絨毛膜癌)和pa-1(卵巢畸胎瘤)中檢出cldn6表達。

實施例3：在正常組織和癌性組織中免疫組織化學(ihc)分析cldn6表達

在加熱板(hi1220，leica)上以58℃孵育石蠟包埋的組織切片(4μm)1小時。通過rt下在roticlear(roth)中孵育載玻片2×10分鐘而從切片中除去石蠟。隨后，使切片在梯度的醇(99％、2×96％、80％和70％，每次5分鐘)中脫水。通過在120℃(15psi(磅每平方英寸))下在10mm檸檬酸鹽緩沖液(ph6.0)+0.05％吐溫-20中煮沸載玻片15分鐘而進行抗原修復。煮沸載玻片之后直接在pbs中孵育5分鐘。在rt下，用meoh中的0.3％過氧化氫封閉內源性過氧化物酶活性15分鐘。為了避免非特異性結合，用pbs中的10％山羊血清在rt下封閉載玻片30分鐘。隨后，在4℃下用cldn6特異性的多克隆抗體(1μg/ml)(arp)過夜孵育載玻片。次日，在rt下用pbs清洗載玻片(3×5分鐘)，并在rt下用100μl二抗(powervision聚hrp-抗兔igg即用型(immunologic))孵育1小時。隨后，在rt下用pbs清洗載玻片(3×5分鐘)。通過使用來自vectorlaboratories(burlingame)的vectornovaredsubstratekitsk-4800進行最后的染色。在rt下用蘇木精復染切片90秒。用梯度的醇(70％、80％、2×96％和99％，每次5分鐘)脫水以及在二甲苯中孵育10分鐘之后，用x-trakit(meditehistotechnic)封片。

在來自肺、卵巢、胃、結腸、胰腺、肝、十二指腸或腎的正常組織中未檢出cldn6蛋白表達。與正常組織相反，在來自卵巢癌、肺癌、皮膚癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌(移行細胞癌)、子宮頸癌、睪丸癌、(精原細胞瘤)和子宮癌的組織切片上觀察到了強的或至少顯著的染色。在惡性表皮細胞群的質膜，染色顯著增強，而臨近的間質和非惡性上皮細胞是陰性的。這些結果表明cldn6蛋白質位于惡性細胞的質膜。

實施例4：生成抗cldn6的鼠抗體

a.生成編碼全長cldn6和cldn6片段的表達載體

通過化學合成(geneartag，germany)制備編碼全長cldn6(ncbi登記號np_067018.2，seqidno：2)的非天然的、密碼子優化的dna序列(seqidno：3)并將其克隆到pcdna3.1/myc-his載體(invitrogen，usa)中以產生載體p3953。插入終止密碼子使得cldn6蛋白的表達不與載體所編碼的myc-his標簽融合。使用可商購的抗cldn6抗體(arp，01-8865；r&dsystems，mab3656)，通過western印跡、流式細胞術和免疫熒光分析測試cldn6的表達。

此外，制備密碼子優化的dna序列(seqidno：4)并將其克隆到pcdna3.1/myc-his載體中以產生載體p3974，所述dna序列編碼與源自n端igκ前導序列的信號肽融合的cldn6的推定的細胞外結構域2(extracellulardomain2，ec2)片段(seqidno：6)，其后面有4個額外的氨基酸以確保正確的信號肽切割位點(seqidno：5)。免疫之前，使用可商購的抗myc抗體(cellsignaling，mab2276)，通過免疫熒光顯微術在瞬時轉染的且用多聚甲醛(pfa)固定的cho-k1細胞中確證ec2片段的表達。

b.生成穩定表達cldn6的細胞系

使用載體p3953，通過標準技術生成穩定表達cldn6的hek293和p3x63ag8u.1細胞系。

c.免疫

通過在第0、16和36天腹膜內注射，用25μgp3974質粒dna以及4μlpei-甘露糖(pei-man；invivo-jetpei^tm-man，來自polyplustransfection)(含有5％葡萄糖的h2o中的150mmpei-man)一起免疫接種balb/c小鼠。在第48和62天時，通過腹膜內注射轉染了p3953載體以穩定表達cldn6的p3x63ag8u.1骨髓瘤細胞免疫接種小鼠。在注射之前，以3000拉德(rad)輻照第62天所施用的細胞。在第20和70天之間，使用以編碼cldn6和gfp的核酸共轉染的cho-k1細胞，通過免疫熒光顯微術監控小鼠血清中抗cldn6抗體的存在。為此，轉染后24小時，在室溫(rt)下用1∶100稀釋的來自經免疫之小鼠的血清孵育pfa固定的或未固定的細胞45分鐘。清洗細胞，用alexa555標記的抗小鼠ig抗體(molecularprobes)孵育并進行熒光顯微術。

在獲自小鼠的血清樣品中檢測抗cldn6的特異性抗體，以其為基礎產生雜交瘤f3-6c3-h8；見圖2。

為生成單抗，在進行脾切除術之前4天，通過腹膜內注射2×10⁷個以p3953載體穩定轉染的hek293細胞加強具有可檢出的抗cldn6免疫應答的小鼠。

d.生成產生抗cldn6鼠單克隆抗體的雜交瘤

使用peg1500(roche，crl10783641001)，將從經免疫小鼠中分離的6×10⁷個脾細胞與3×10⁷個小鼠骨髓瘤細胞系p3x63ag8.653(atcc，crl1580)融合。在平底微量滴定板中以約5×10⁴個細胞/孔接種細胞，在含有10％經熱滅活的胎牛血清、1％雜交瘤融合和克隆添加劑(hybridomafusionandcloningsupplement，hfcs，roche，crl11363735)、10mmhepes、1mm丙酮酸鈉、4.5％葡萄糖、0.1mm2-巰基乙醇、1×青霉素/鏈霉素以及1×hat添加劑(invitrogen，crl21060)的prmi選擇培養基中培養約2周。10至14天之后，通過流式細胞術篩選每個孔的抗cldn6單克隆抗體。通過有限稀釋對分泌抗體的雜交瘤進行亞克隆，并再次測試抗cldn6的單克隆抗體。培養穩定的亞克隆以在組織培養基中生成少量用于表征的抗體。從來自保持母體細胞之反應性(通過流式細胞術測試)的每個雜交瘤中選擇至少一個克隆。為每個克隆生成9小瓶細胞的庫并將其儲存于液氮中。

實施例5：雜交瘤上清液和單克隆抗體的結合特征

a.通過(i)western印跡和(ii)流式細胞術分析對瞬時轉染的hek293t細胞進行質量控制

(i)分別用編碼cldn3、cldn4、cldn6和cldn9的核酸轉染hek293t細胞或者進行模擬轉染。通過western印跡測定hek293t細胞中cldn3、cldn4、cldn6和cldn9的表達。為此，轉染后24小時收獲細胞，進行裂解。對裂解液進行sds-page，印跡到硝酸纖維素膜上，在變性條件下，用與相應的密蛋白c端特異性結合的抗-cldn3(a)(invitrogen，34-1700)、抗-cldn4(a)(zymed，32-9400)、抗-cdln6(a)(arp，01-8865)或抗-cldn9(a)(santacruz，sc-17672)抗體染色。用過氧化物酶標記的二抗孵育并用ecl試劑顯色之后，使用las-3000顯像儀(fuji)進行可視化。僅在轉染的細胞中(但未在對照細胞中)分別觀察到了cldn3、cldn4、cldn6和cldn9之預期分子量的帶(圖3)，表明hek293t細胞不內源性地表達所研究的任何密蛋白，因而是用于測定cldn6抗體的交叉反應性的合適工具。

(ii)使用識別天然表位的抗cldn抗體(小鼠抗cldn3igg2a(r&d，mab4620)、小鼠抗cldn4igg2a(r&d，mab4219)、小鼠抗cldn6igg2b(r&d，mab3656))，通過流式細胞術進一步分析(i)的hek293t細胞。以獲自sigma的產品編號為m9144和m8894的抗體充當同種型對照。分別使用以編碼cldn3、cldn4、cldn6和cldn9的核酸瞬時轉染的hek293t細胞分析這些抗cldn抗體的特異性。抗cldn4抗體表現出與cldn3、cldn6和cldn9的交叉反應性。抗cldn3抗體與cldn3特異性地結合(圖4)。

b.使用流式細胞術測定根據本發明產生的單克隆抗體的特異性

用編碼不同cldn蛋白的載體和編碼熒光標志物的載體共轉染hek293t細胞。轉染后24小時，使用0.05％胰蛋白酶/edta溶液收獲細胞，用facs緩沖液(含有2％fcs和0.1％疊氮化鈉的pbs)清洗。以2×10⁵個細胞/孔將細胞轉移到u-底微滴定板中，在4℃下用雜交瘤上清液孵育60分鐘。用facs緩沖液清洗三次之后，用別藻藍蛋白(allophycocyanin，apc)綴合的抗小鼠igg1+2a+2b+3特異性的二抗(dianova，115-135-164)孵育細胞。隨后，將細胞清洗兩次，使用bdfacsarray通過流式細胞術對結合進行評價(圖5)。以熒光標志物的表達為橫軸，相對于縱軸上的抗體結合進行作圖。以可商購的小鼠抗cldn6igg2b抗體(r&d，mab3656)充當陽性對照，并且以可獲自sigma的產品編號為m8894的抗體充當同種型對照。

來自單克隆的雜交瘤亞克隆f3-6c3-h2、f3-6c3-h8、f3-6c3-h9、f3-6c3-d8和f3-6c3-g4(都源自雜交瘤f3-6c3)的上清液中的抗體是cldn6特異性的，并且不與cldn9、cldn3和cldn4結合。圖5a示例性地顯示單克隆雜交瘤亞克隆f3-6c3-h8的結果。來自單克隆雜交瘤亞克隆f3-6c3-h8上清液中的抗體還與用cldn6的(i143v)-snp變體轉染的細胞結合。來自單克隆雜交瘤亞克隆f4-4f7-f2之上清液中的抗體與cldn6和cldn9都結合(圖5a)。來自單克隆雜交瘤亞克隆f3-7b3-b4之上清液中的抗體與cldn6、cldn3和cldn9結合(圖5b)。來自單克隆雜交瘤亞克隆f3-3f7-a5之上清液中的抗體與cldn6、cldn4和cldn9結合(圖5b)。

實施例6：生成和測試抗cldn6的單克隆抗體

a.生成編碼cldn6的細胞外結構域1的表達載體

制備密碼子優化的dna序列(seqidno：12)并將其克隆到pcdna3.1/myc-his載體中以產生載體p3973，所述dna序列編碼與源自n端igκ前導序列的信號肽融合的cldn6的推定的細胞外結構域1(extracellulardomain1，ec1)片段(seqidno：7)，其后面有4個額外的氨基酸以確保正確的信號肽切割位點(seqidno：13)。免疫之前，使用可商購的抗myc抗體(cellsignaling，mab2276)，通過免疫熒光顯微術在瞬時轉染的且用多聚甲醛(pfa)固定的cho-k1細胞中確證ec1片段的表達。

b.免疫

通過在第0和14天腹膜內注射，用25μgp3973質粒dna以及4μlpei-甘露糖(pei-man；invivo-jetpei^tm-man，來自polyplustransfection)(含有5％葡萄糖的水中的150mmpei-man)一起免疫接種balb/c小鼠。第28和44天，用klh綴合的肽seqidno：14和seqidno：15(在pbs中各自100μg，jptpeptidetechnologiesgmbh，germany)和hplc純化的pto-cpg-odn(25μg于pbs中；5′-tccatgacgttcctgacgtt；eurofinsmwgoperon，germany)一起皮下免疫接種小鼠。第64、77和97天，用2×10⁷個以p3953載體轉染的p3x63ag8u.1骨髓瘤細胞腹膜內注射免疫接種小鼠。施用之前，用絲裂霉素c(2.5μg/ml，sigma-aldrich，m4287)處理細胞。第64和97天，與hplc純化的pto-cpg-odn(50μg于pbs中)一起施用細胞，第77天，將與不完全弗氏佐劑(incompletefreund′sadjuvant)一起施用。

為生成單克隆抗體，在進行脾切除術之前4天，通過腹膜內注射2×10⁷個以p3953載體穩定轉染的hek293細胞加強具有可檢出的抗cldn6免疫應答的小鼠。

c.測試抗cldn6的單克隆抗體

流式細胞術

為測試單克隆抗體與cldn6及其同源物的結合，用相應的編碼密蛋白的質粒瞬時轉染hek293t細胞，并通過流式細胞術分析表達。為了區分轉染的和非轉染的細胞，用熒光標記物作為報道分子共轉染hek293t細胞。轉染24小時之后，用0.05％胰蛋白酶/edta收獲細胞，用facs緩沖液(含有2％fcs和0.1％疊氮化鈉的pbs)清洗，以2×10⁶個細胞/ml的濃度懸于facs緩沖液中。在4℃下，將100μl細胞懸液與指定濃度的合適抗體一起孵育30分鐘。使用交叉反應的抗體檢測cldn6和cldn9表達。可商購的小鼠抗密蛋白抗體抗cldn3(r&d，mab4620)和抗cldn4(r&d，mab4219)充當陽性對照，而小鼠igg2a(sigma，m9144)和igg2b(sigma，m8894)分別充當同種型對照。用facs緩沖液清洗細胞三次，并將其與apc綴合的抗小鼠igg1+2a+2b+3a特異性的二抗(dianova，115-135-164)一起在4℃下孵育30分鐘。清洗細胞兩次，重懸于facs緩沖液中。使用bdfacsarray通過流式細胞術分析結合。以熒光標志物的表達為橫軸，相對于縱軸上的抗體結合進行作圖。

cdc

向與抗cldn6抗體一起孵育的靶細胞中添加人補體之后，通過測量未裂解細胞中細胞內atp的含量測定補體依賴性的細胞毒作用(cdc)。作為非常靈敏的分析方法，使用螢光素酶的發光反應測量atp。

用0.05％胰蛋白酶/edta收獲穩定轉染cldn6的cho-k1細胞(cho-k1-cldn6)，用x-vivo15培養基(lonza，be04-418q)清洗兩次，以1×10⁷個細胞/ml的濃度懸于x-vivo15培養基中。將250μl的細胞懸液轉移到0.4cm電穿孔小槽(electroporationcuvette)中并將其與7μg體外轉錄的編碼螢光素酶的rna(螢光素酶ivtrna)混合。使用genepulserxcell(biorad)以200v和300μf電穿孔細胞。電穿孔之后，將細胞懸于2.4ml預熱的含有10％(v/v)fcs、1％(v/v)青霉素/鏈霉素和1.5mg/mlg418的具有glutamax-i的d-mem/f12(1∶1)培養基(invitrogen，31331-093)中。將50μl/孔細胞懸液接種進入白色96孔pp板中，在37℃和7.5％co2下孵育。電穿孔之后24小時，以指定濃度向細胞中添加50μl60％rpmi(含有20mmhepes)和40％人血清(獲自6位健康供體的混合血清)中的單克隆鼠抗cldn6抗體。向總裂解對照中添加每孔10μlpbs中的8％(v/v)tritonx-100，而向最大活細胞對照和向實際樣品中添加每孔10μl的pbs。在37℃和7.5％co2下孵育80分鐘之后，每孔添加50μl熒光素混合物(ddh2o中的3.84mg/mld-熒光素、0.64u/mlatp酶和160mmhepes)。在rt下，將板在黑暗中孵育45分鐘。使用發光計(infinitem200，tecan)測量發光。以積分數字相對光單位(relativelightunit，rlu)給出結果。

以200v和400μf電穿孔nec8細胞，在含有10％(v/v)fcs的具有glutamax-i的rpmi1640培養基(invitrogen，61870)中培養。

按以下計算比裂解：

最大活細胞：10μlpbs，沒有抗體

總裂解：10μlpbs中的8％(v/v)tritonx-100，沒有抗體

早期治療

對于早期抗體治療，將200μlpbs中的2×10⁷個nec8細胞皮下接種進入無胸腺的nude-foxn1^nu小鼠的脅部。每個實驗組由10只6～8周齡的雌性小鼠組成。接種之后3天，每周兩次交替靜脈內和腹膜內注射應用200μg純化的鼠單克隆抗體mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a46天。以pbs治療的實驗組充當陰性對照。每兩周監測一次腫瘤體積(tv＝(長度×寬度²)/2)。以mm³表示tv，允許構建隨時間的腫瘤生長曲線。當腫瘤達到大于1500mm³的體積時，殺死小鼠。

d.結果

鼠單克隆抗體mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a顯示與人cldn6和cldn6snp(單核苷酸多態性)變體i143v的強結合，但未觀察到與cldn3、4和9的結合(圖6)。

mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a表現出非常低的ec50值(ec50200～500ng/ml)，并且在低濃度下達到飽和結合(圖7)。

mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a在低濃度下表現出劑量依賴性cdc活性和誘導的cdc(圖8)。抗cldn6抗體mumab65a和66b以劑量依賴的方式誘導對nec8細胞的cdc(圖9)。通過使用nec8lvts254細胞(cldn6敲低)證明mumab65a和66b的靶標特異性。

此外，在移植了nec8細胞的小鼠中，mumab59a、60a、61d、64a、65a、66b和67a顯示出腫瘤生長抑制(圖10)。

實施例7：生成和測試抗cldn6的嵌合單克隆抗體

a.生成小鼠/人嵌合單克隆抗體

對于嵌合化，使用列在下表中的引物，通過pcr擴增包含前導序列的鼠重鏈和輕鏈可變區。通過apai限制位點(5′-gggccc-3′)將鼠重鏈與表達載體所編碼的人fcγ1鏈的n端部分融合。使用bsiwi限制位點將包含前導序列的鼠κ鏈的可變結構域克隆到恒定區之前。通過測序核實載體中恒定區的正確方向(即，適合載體的啟動子向前進行)。由于apai限制位點的位置，為此，除了apai位點的序列，包含前導序列之可變區的任何擴增需要包括人γ-1恒定區序列的前11個核苷酸。人γ-1重鏈恒定區的核苷酸序列示于seqidno：24，如此表達的人γ-1恒定區示于seqidno：25。編碼κ輕鏈恒定部分的核苷酸序列示于seqidno：26，相應的氨基酸序列示于seqidno：27。

表1：用于抗體克隆的小鼠雜交瘤細胞系

通過在相應的鼠抗體名稱前添加前綴“chim”來命名嵌合單克隆抗體，例如chimab64a。

根據matz等(nucleicacidsresearch，1999，v0l.27，no.6)中描述的“越軌pcr(step-outpcr)”方法進行對包含前導序列的鼠輕鏈和重鏈可變區的擴增。為此，通過本領域技術人員已知的標準方法從單克隆雜交瘤細胞系(見表1)中制備總rna，例如使用rneasyminikit(qiagen)來制備。根據也在matz等(nucleicacidsresearch，1999，vol.27，no.6，1558)中描述的“模板開關”法制備單鏈cdna。在cdna鏈聚合的過程中，除了(dt)30寡聚物(seqidno：28)之外，dna/rna雜合寡聚物(seqidno：29)充當用于模板開關的5′接合體(adaptor)。在該接合體寡聚物中，最后3個核苷酸是核糖核苷酸而不是脫氧核糖核苷酸。隨后的“越軌pcr”使用靶向小鼠κ鏈恒定區或γ鏈2a亞類恒定區(分別為seqidno：30和31)的反義寡聚物。之前用isostrip(roche)對雜交瘤細胞系所產生的鼠單克隆抗體的igg亞類進行免疫分析，并據此選擇合適的反義寡聚物(見表1)。包含兩種寡聚物(列在seqidno：32和33中)的引物混合物在所述“越軌pcr”中充當有義寡聚物。

隨后通過pcr擴增所鑒定的包含前導序列的鼠可變區，略去5′utr和3′小鼠恒定區，向末端添加限制位點，這允許亞克隆到所制備的帶有人恒定區的載體中。此外，所述有義寡聚物提供共有的kozak序列(5′-gccgccacc-3′)，并且除了apai限制位點之外，用于重鏈可變區的反義寡聚物還包括人γ-1恒定區的前11個核苷酸(見表1，seqidno：17至23)。使用hindiii和bsiwi限制酶克隆包含前導序列的κ輕鏈可變區，γ重鏈可變區要求hindiii和apai限制酶。

擴增其他包含前導序列的鼠輕鏈和重鏈可變區，并根據上述公開的方案生成其他抗cldn6嵌合單克隆抗體。

b.產生嵌合單克隆抗cldn6抗體

在以編碼相應抗體的輕鏈和重鏈的質粒dna轉染的hek293t細胞(atcccrl-11268)中瞬時表達嵌合單克隆抗體。轉染之前24小時，將8×10⁷個細胞接種到145mm細胞培養板上，并在25mlhek293t培養基(dmem/f12+glutamax-i、10％fcs、1％青霉素/鏈霉素)中培養。將20μg質粒dna溶于每個細胞培養板的5ml沒有添加物的hek293t培養基中。添加75μl線性聚乙烯亞胺(polyethylenimine，pei)(1mg/ml)(polyscience，23966)之后，在rt下孵育(dna∶pei)-混合物15分鐘。隨后，向細胞中逐滴添加轉染混合物。轉染后24小時，用含有1％青霉素/鏈霉素的pro293a培養基(lonza，be12-764q)替換hek293t培養基。為了最佳的表達，在37℃和7.5％co2下再培養轉染的細胞96至120小時。收獲上清液，使用蛋白a柱通過fplc純化嵌合的抗體。測定抗體的濃度，通過sds-page測試品質。

c.測試抗cldn6的嵌合單克隆抗體

流式細胞術

通過流式細胞術分析以測試cldn6特異性的嵌合單克隆抗體與分別用cldn3、4、6或9穩定轉染的hek293細胞以及內源性表達cldn6的腫瘤細胞系結合的特異性和親和力。因此，用0.05％胰蛋白酶/edta收獲細胞，用facs緩沖液(含有2％fcs和0.1％疊氮化鈉的pbs)清洗，以2×10⁶個細胞/ml的濃度懸于facs緩沖液中。在4℃下，將100μl細胞懸液與指定濃度的合適抗體一起孵育60分鐘。使用嵌合的交叉反應的抗體(chimab5f2d2)檢測cldn6和cldn9表達。可商購的小鼠抗密蛋白抗體抗cldn3(r&d，mab4620)和抗cldn4(r&d，mab4219)抗體充當陽性對照，而人igg1-κ(sigma，i5154)充當陰性對照。用facs緩沖液清洗細胞三次，并將其分別與apc綴合的山羊抗人iggfc-γ(dianova，109-136-170)或apc綴合的抗小鼠igg1+2a+2b+3a(dianova，115-135-164)特異性的二抗在4℃下一起孵育30分鐘。清洗細胞兩次，重懸于facs緩沖液中。使用bdfacsarray通過流式細胞術分析結合。

cdc

向與抗cldn6抗體一起孵育的靶細胞中添加人補體之后，通過測量未裂解細胞中細胞內atp的含量測定補體依賴的細胞毒作用(cdc)。作為非常靈敏的分析方法，使用螢光素酶的生物發光反應測量atp。

在該測定中，使用均以螢光素酶表達構建體穩定轉導的nec8野生型細胞(cldn6陽性)和nec8cldn6敲低的細胞(cldn6陰性)。用0.05％胰蛋白酶/edta收獲細胞，并將其在含有10％(v/v)fcs的具有glutamax-i的rpmi培養基(invitrogen，61870-010)中調節至2×10⁵個細胞/ml的濃度。將1×10⁴個細胞接種到白色96孔pp板中，在37℃和5％co2下孵育24小時。孵育之后，以指定濃度向細胞中添加50μl60％rpmi(含有20mmhepes)中的單克隆嵌合抗cldn6抗體和40％人血清(獲自6位健康供體的混合血清)。向總裂解對照中添加每孔10μlpbs中的8％(v/v)tritonx-100，而向最大活細胞對照和向實際樣品中添加每孔10μl的pbs。在37℃和5％co2下孵育80分鐘之后，每孔添加50μl熒光素混合物(ddh2o中的3.84mg/mld-熒光素、0.64u/mlatp酶和160mmhepes)。在rt下，將板在黑暗中孵育45分鐘。使用發光計(infinitem200，tecan)測量生物發光。以積分數字相對光單位(rlu)給出結果。

按以下計算比裂解：

最大活細胞：10μlpbs，沒有抗體

總裂解：10μlpbs中的8％(v/v)tritonx-100，沒有抗體

adcc

向與抗cldn6抗體一起孵育的靶細胞中添加人pbmc之后，通過測量未裂解細胞中細胞內atp的含量測定抗體依賴性細胞的細胞毒作用(adcc)。作為非常靈敏的分析方法，使用螢光素酶的生物發光反應測量atp。

在該測定中，使用均以螢光素酶表達構建體穩定轉導的nec-8野生型細胞(cldn6陽性)和nec-8cldn6敲低的細胞(cldn6陰性)。用0.05％胰蛋白酶/edta收獲細胞，并將其在含有10％(v/v)fcs和20mmhepes的具有glutamax-i的rpmi培養基(invitrogen，61870-010)中調節至2×10⁵個細胞/ml的濃度。將1×10⁴個細胞接種到白色96孔pp板中，在37℃和5％co2下孵育4小時。

使用ficollhypaque(gehealthcare，17144003)，通過密度梯度離心，從人供體血液樣品中分離pbmc。分離含有分裂間期之pbmc，用pbs/edta(2mm)清洗細胞兩次。將1×10⁸個pbmc接種到50ml含有5％熱滅活人血清(lonza，us14-402e)的x-vivo15培養基(lonza，be04-418q)中，在37℃和5％co2下孵育2小時。

接種靶細胞(nec-8)之后4小時，以指定的濃度向細胞中添加25μlpbs中的單克隆嵌合抗cldn6抗體。收獲2小時內從黏附的單核細胞中分離出的非黏附的pbmc，在x-vivo15培養基中調節至8×10⁶個細胞/ml。向靶細胞和單克隆嵌合抗cldn6抗體中添加25μl該細胞懸液。在37℃和5％co2下孵育板24小時。

孵育24小時之后，向總裂解對照中添加每孔10μlpbs中的8％(v/v)tritonx-100，而向最大活細胞對照和向實際樣品中添加每孔10μl的pbs。每孔添加50μl熒光素混合物(ddh2o中的3.84mg/mld-熒光素、0.64u/mlatp酶和160mmhepes)。在rt下，將板在黑暗中孵育30分鐘。使用發光計(infinitem200，tecan)測量生物發光。以積分數字相對光單位(rlu)給出結果。

按以下計算比裂解：

最大活細胞：10μlpbs，沒有抗體

總裂解：10μlpbs中的8％(v/v)tritonx-100，沒有抗體

d.結果

抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab61d、64a、67a和89a顯示出與人cldn6的強結合，但未觀察到與cldn3、4和9的結合(圖11)。

對于與穩定表達于hek293細胞表面上的人cldn6的結合，抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a和89a表現出非常低的ec50值(ec50450～600ng/ml)，并且在低濃度達到飽和結合。chimab67a和61d分別顯示出低的(ec501000ng/mi)和中等的(ec502300ng/ml)的ec50值(圖12)。

對于與內源性地表達于nec8細胞中的cldn6的結合，抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a和89a表現出非常低的ec50值(ec50600～650ng/ml)，并且在低濃度達到飽和結合，而chimab61d和67a分別顯示出中等的(ec501700ng/ml)和高的(ec506100ng/ml)ec50值(圖13)。

對于與內源性地表達于ov90細胞中的cldn6的結合，抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a和89a表現出非常低的ec50值(ec50550～600ng/ml)，并且在低濃度達到飽和結合。chimab61d和67a分別顯示出中等的ec50值(分別為ec501500ng/ml和ec502300ng/ml)(圖14)。

抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab61d、64a、67a和89a以劑量依賴性方式表現出對nec-8細胞的cdc活性(圖15)。

抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab61d、64a、67a和89a表現出對nec-8細胞的劑量依賴性的adcc活性，并且甚至在低抗體濃度下誘導adcc(圖16)。

這些結果清楚地顯示這些抗cldn6的嵌合單克隆抗體的特異性。

實施例8：使用抗cldn6單克隆抗體的治療

早期治療

對于早期抗體治療，將200μlrpmi培養基(gibco)中的2×10⁷個nec8細胞皮下接種進入無胸腺的nude-foxn1^nu小鼠的脅部。每個實驗組由10只6～8周齡的雌性小鼠組成。接種腫瘤細胞之后3天，每周兩次交替靜脈內和腹膜內注射應用200μg純化的鼠單克隆抗體mumab89a七周。以pbs治療的實驗組充當陰性對照。每兩周監測一次腫瘤體積(tv＝(長度×寬度²)/2)。以mm³表示tv，允許構建隨時間的腫瘤生長曲線。當腫瘤達到大于1500mm³的體積時，處死小鼠。

晚期治療

對于晚期異種移植腫瘤的抗體治療，將200μlrpmi培養基(gibco)中的2×10⁷個nec8細胞皮下接種進入6～8周齡雌性無胸腺的nude-foxn1^nu小鼠的脅部。每兩周監測一次腫瘤體積(tv＝(長度×寬度²)/2)。以mm³表示tv，允許構建隨時間的腫瘤生長曲線。接種腫瘤15至17天之后，將小鼠分成具有高于80mm³的均勻腫瘤大小的每組8只動物的治療組。每周兩次交替靜脈內和腹膜內注射應用200μg純化的鼠單克隆抗體mumab61d、64a、67a和89a五周。用pbs和非特異性抗體治療的實驗組充當陰性對照。當腫瘤達到大于1500mm³的體積時，處死小鼠。

在使用植入了腫瘤細胞系nec8之小鼠的早期治療異種移植模型中，用鼠單克隆抗體mumab61d、64a和67a治療小鼠，甚至在停止免疫治療之后都沒有顯示出任何腫瘤生長(圖17)。

在使用植入了腫瘤細胞系nec8之小鼠的早期治療異種移植模型中，mumab89a顯示腫瘤生長抑制，并且在研究結束時，用mumab89a治療的小鼠中沒有可檢出的腫瘤(圖18)。

在使用植入了腫瘤細胞系nec8之小鼠的晚期治療異種移植模型中，mumab64a顯示抑制腫瘤生長(圖19)。

在使用植入了腫瘤細胞系nec8之小鼠的晚期治療異種移植模型中，以mumab64a治療的小鼠顯示存活延長(圖20)。

在使用植入了腫瘤細胞系nec8之小鼠的晚期治療異種移植模型中，用鼠單克隆抗cldn6抗體mumab61d、67a和89a實現對腫瘤生長的抑制(圖21)。

在使用植入了腫瘤細胞系nec8之小鼠的晚期治療異種移植模型中，用cldn6特異性抗體mumab61d或67a治療的小鼠顯示存活延長(圖22)。

在使用植入了腫瘤細胞系nec8野生型和具有穩定cldn6敲低的nec8細胞之小鼠的晚期治療異種移植模型中，mumab64a和89a僅在植入了nec8野生型的小鼠中(而非植入了具有穩定cldn6敲低的nec8細胞中)顯示治療作用，表明抗體的體內cldn6特異性(圖23)。

實施例9：抗cldn6單克隆抗體的高分辨率表位作圖

在elisa表位作圖研究中，cldn6特異性的單克隆抗體僅顯示與線性肽非常弱的(如果有的話)結合，表明其表位是構象表位。為分析本文中描述的抗體與天然構象的cldn6的相互作用，將哺乳動物細胞培養物中的位點定向誘變用作表位作圖技術。分別在第一和第二細胞外結構域中進行氨基酸27～81和137～161的丙氨酸掃描誘變。在hek293t細胞中瞬時表達之后，評價cldn6突變體被特異性單克隆抗體所結合的能力。特異性單克隆抗體與cldn6突變體的結合受損表明突變的氨基酸是重要的接觸和/或構象殘基。通過流式細胞術分析所述結合。用熒光標志物共轉染細胞以區分轉染的和未轉染的細胞群。

已通過丙氨酸掃描系統地鑒定了對于與cldn6特異性嵌合抗體相互作用來說重要的cldn6氨基酸殘基。通過位點定向誘變(geneartag，germany)生成丙氨酸和甘氨酸突變。為測試單克隆嵌合抗體與野生型cldn6及其突變體的結合，用編碼相應密蛋白的質粒瞬時轉染hek293t細胞，通過流式細胞術分析表達。為了區分轉染和未轉染的細胞，用熒光標志物作為報道分子共轉染hek293t細胞。轉染之后24小時，用0.05％胰蛋白酶/edta收獲細胞，用facs緩沖液(含有2％fcs和0.1％疊氮化鈉的pbs)清洗，以2×10⁶個細胞/ml的濃度重懸于facs緩沖液中。在4℃下用10μg/ml抗體孵育100μl細胞懸液45分鐘。使用可商購的小鼠抗cldn6抗體(r&d，mab3656)作為對照檢測細胞表面cldn6突變體的表達。用facs緩沖液清洗細胞三次，用apc綴合的山羊抗人iggfc-γ(dianova，109-136-170)或apc綴合的抗小鼠igg1+2a+2b+3a特異性二抗(dianova，115-135-164)在4℃下孵育30分鐘。清洗細胞兩次，重懸于facs緩沖液中。通過使用bdfacsarray的流式細胞術分析被轉染細胞群中的結合。因此，以熒光標志物的表達為橫軸，相對于縱軸上的抗體結合進行作圖。與突變的cldn6結合的單克隆嵌合cldn6特異性抗體的平均信號強度表示為野生型結合的百分比。在被突變之后，對于結合至關重要的氨基酸不顯示結合，而支持結合的氨基酸僅顯示與野生型相比降低的結合。

高分辨率表位作圖證明cldn6第一細胞外結構域的氨基酸f35、g37、s39以及可能地t33對于與cldn6特異性嵌合抗體chimab61d、64a、67a和89a的相互作用是重要的。殘基i40對于chimab89a的結合是至關重要的，并且它有助于chimab61d和67a的結合。此外，cldn6第二細胞外結構域的l151對于與chimab67a的相互作用是重要的(圖24)。

實施例10：生成和測試改進的抗cldn6單克隆抗體

結果證明，雖然抗體64a在其關于與cldn6相結合方面的性質和關于腫瘤治療的效力方面是優良的，但是抗體64a在輕鏈位置46處具有游離的半胱氨酸殘基，發現所述半胱氨酸殘基潛在地損害其關于溶解性、穩定性和聚集體形成的性質。這樣的游離半胱氨酸由于另一些原因(例如調節規定)也是不期望的。因此，我們試圖基于64a創造抗體，所述抗體維持其期望性質并且避免了位置46處的游離半胱氨酸殘基。

通過將chimab64a的重鏈與chimab61d的輕鏈組合產生嵌合單克隆抗體mab206-lcc。通過氨基酸替換構建mab206-subg和mab206-subs。為此，chimab64a輕鏈中位置46處的半胱氨酸被分別替換為甘氨酸和絲氨酸。

在hek293t中產生嵌合單克隆抗cldn6抗體

在經編碼如實施例7部分b中所公開的對應抗體之輕鏈和重鏈的質粒dna轉染的hek293t細胞(atcccrl-11268)中瞬時表達嵌合單克隆抗體。

在適應懸浮的cho細胞中產生嵌合單克隆抗cldn6抗體

使適應懸浮的cho細胞在濕潤co2振動器中的無血清培養基中進行傳代培養。轉染前一天，將細胞接種到振動器燒瓶中的無血清培養基中，在轉染當天，對細胞進行離心(200×g下5分鐘)并重懸于振動器燒瓶中的新鮮dmem培養基(invitrogen，41965-039)中。將dna和轉染試劑添加到細胞中并通過振動輕輕混合。在co2孵育器中靜態孵育之后，細胞用無血清生長培養基稀釋并且再次進行培養以在孵育振動器中表達。在第0、2、4和6天向細胞分別提供chocdefficientfeed^tma和b(invitrogen，a1023401和a1024001)。在細胞生活力降低到90％以下之后收獲嵌合抗體。使用蛋白a柱通過fplc純化抗體。經280nm處的吸光度確定抗體濃度并且通過sds-page分析純度。

流式細胞術

通過流式細胞術分析cldn6特異性嵌合單克隆抗體與表達靶標的細胞的結合。因此，用0.05％胰蛋白酶/edta收獲細胞，用facs緩沖液(含有2％fcs和0.1％疊氮化鈉的pbs)清洗，以2×10⁶個細胞/ml的濃度懸于facs緩沖液中。在4℃下，將100μl細胞懸液與指定濃度的合適抗體一起孵育30分鐘。使用chimab5f2d2檢測cldn6和cldn9表達。可商購的小鼠抗密蛋白抗體抗cldn3(r&d，mab4620)和抗cldn4(r&d，mab4219)抗體充當陽性對照，而人igg1-κ(sigma，i5154)充當陰性對照。用facs緩沖液清洗細胞三次，并將其分別與apc綴合的山羊抗人iggfc-γ(dianova，109-136-170)或apc綴合的抗小鼠igg1+2a+2b+3a(dianova，115-135-164)特異性的二抗在4℃下一起孵育30分鐘。清洗細胞兩次，重懸于facs緩沖液中。使用bdfacsarray通過流式細胞術分析結合。

cdc

在向與如實施例7部分c中所公開的抗cldn6抗體一起孵育的靶細胞中添加人補體后，通過測量未裂解細胞中細胞內atp的含量測定補體依賴的細胞毒作用(cdc)。

adcc

向與抗cldn6抗體一起孵育的靶細胞中添加人pbmc之后，通過測量未裂解細胞中細胞內atp的含量測定抗體依賴性細胞的細胞毒作用(adcc)。作為非常靈敏的分析方法，使用螢光素酶的生物發光反應測量atp。

在該測定中，使用均以螢光素酶rna表達構建體穩定轉導的nec-8野生型細胞(cldn6陽性)和nec-8cldn6敲低的細胞(cldn6陰性)，而以編碼熒光素酶的ivt-rna瞬時轉染ov90細胞。用0.05％胰蛋白酶/edta收獲細胞，并將其在含有額外的20mmhepes的各自的生長培養基中調節至2×10⁵個細胞/ml(nec-8野生型和cldn6敲低細胞)的濃度。分別將1×10⁴個或5×10⁴個細胞接種到白色96孔pp板中并且在37℃和5％co2下孵育。

使用ficollhypaque(gehealthcare，17144003)通過密度梯度離心從人供體血液樣品中分離pbmc。分離含有分裂間期之pbmc，用pbs/edta(2mm)清洗細胞兩次。將1×10⁸個pbmc接種到50ml含有5％熱滅活人血清(得自于六個健康供體的混合血清)的x-vivo15培養基(lonza，be04-418q)中，在37℃和5％co2下孵育2小時。

接種靶細胞4小時之后，以指定的濃度向細胞中添加25μlpbs中的單克隆嵌合抗cldn6抗體。收獲2小時內從黏附的單核細胞中分離出的非黏附的pbmc，在x-vivo15培養基中調節至1.6×10⁷個細胞/ml(對于nec-8野生型和cldn6敲低實驗)或4×10⁷個細胞/ml(對于ov90實驗)。向靶細胞和單克隆嵌合抗cldn6抗體中添加25μl該細胞懸液。在37℃和5％co2下孵育板24小時。

孵育24小時之后，向總裂解對照中添加每孔10μlpbs中的8％(v/v)tritonx-100，而向最大活細胞對照和向實際樣品中添加每孔10μl的pbs。每孔添加50μl熒光素混合物(ddh2o中的3.84mg/mld-熒光素、0.64u/mlatp酶和160mmhepes)。在rt下將板在黑暗中孵育30分鐘。使用發光計(infinitem200，tecan)測量生物發光。以積分數字相對光單位(rlu)給出結果。

按以下計算比裂解：

最大活細胞：10μlpbs，沒有抗體

總裂解：10μlpbs中的8％(v/v)tritonx-100，沒有抗體

晚期治療

對于晚期異種移植腫瘤的抗體治療，將200μlrpmi培養基(gibco)中的2×10⁷個nec8細胞皮下接種進入6～8周齡雌性無胸腺的nude-foxn1^nu小鼠的脅部。每兩周監測一次腫瘤體積(tv＝(長度×寬度²)/2)。以mm³表示tv，允許構建隨時間的腫瘤生長曲線。接種腫瘤17天之后，將小鼠分成具有高于80mm³的均勻腫瘤大小的每組8只動物的治療組。每周兩次交替靜脈內和腹膜內注射應用200μg純化的單克隆抗體5周。用非特異性抗體治療的實驗組充當陰性對照。當腫瘤達到大于1500mm³的體積時，處死小鼠。

轉移測定

對于轉移測定，收獲nec8細胞并通過70μm細胞濾網過濾以排除大的細胞聚集體。將4×10⁶個nec8細胞注射到6周齡雌性無胸腺的nude-foxn1^nu小鼠的尾靜脈中。細胞注射3天之后，每周兩次交替靜脈內和腹膜內注射應用200μgpbs中純化的單克隆抗體mumab64a或沒有抗體的pbs5周。8周后處死小鼠，制備肺并在液氮中迅速冷凍。

根據“blood&cellculturednamidikit”(qiagen，13343)的說明書從冷凍組織中分離基因組dna。使用ultratoraxt8.10(ika-werke)將肺組織勻漿。為了避免人基因組dna的污染，在無菌條件下進行基因組肺dna的定量pcr(qpcr)。為了評價鼠肺組織樣品中人nec8細胞的腫瘤負荷，使用限定量的人nec8基因組dna和鼠肺基因組dna產生標準曲線。因此，使用以下稀釋系列(nec8dna/小鼠肺dna)：200/0、40/160、8/192、1.6/198.4、0.32/199.68、0.064/199.94、0.013/200和0/200ng。對于qpcr，使用appliedbiosystems的7300實時pcr系統分析總體積為50μl的200ng基因組dna、2×sybrgreen(qiagen，204145)、16nmol正義引物(gggataatttcagctgactaaacag，eurofins)和16nmol反義引物(ttccgtttagttaggtgcagttatc，eurofins)。作為陰性對照，使用水代替dna。在以下條件下進行qpcr：95℃下15分鐘(1次重復)、95℃下30秒/62℃下30秒/72℃下30秒(40次重復)、95℃下15秒/60℃下30秒/95℃下15秒(1次重復)。所有的qpcr進行三次重復。使用7300系統軟件(appliedbiosystems)與標準曲線相關地定量每個肺組織樣品的腫瘤負荷。

高分辨率表位作圖

為分析我們的抗體與天然構象的cldn6之間的相互作用，將哺乳動物細胞培養物中的位點定向誘變用作表位作圖技術。因此，分別在cldn6的第一和第二細胞外結構域中進行氨基酸27～81和137～161的丙氨酸掃描誘變。通過位點定向誘變(geneartag，germany)產生丙氨酸突變。在hek293t細胞中瞬時表達之后，評價cldn6突變體被特異性單克隆抗體所結合的能力。特異性單克隆抗體與cldn6突變體的結合受損表明突變的氨基酸是重要的接觸和/或構象殘基。通過流式細胞術分析所述結合。為了區分轉染和未轉染的細胞群，用熒光標志物作為報道分子共轉染hek293t細胞。

轉染之后24小時，用0.05％胰蛋白酶/edta收獲細胞，用facs緩沖液(含有2％fcs和0.1％疊氮化鈉的pbs)清洗，以2×10⁶個細胞/ml的濃度重懸于facs緩沖液中。在4℃下用10μg/ml抗體孵育100μl細胞懸液30分鐘。使用可商購的小鼠抗cldn6抗體(r&d，mab3656)作為對照檢測細胞表面cldn6突變體的表達。用facs緩沖液清洗細胞三次，用apc綴合的山羊抗人iggfc-γ(dianova，109-136-170)或apc綴合的抗小鼠igg1+2a+2b+3a特異性二抗(dianova，115-135-164)在4℃下孵育30分鐘。清洗細胞兩次，重懸于facs緩沖液中。通過使用bdfacsarray的流式細胞術分析被轉染細胞群中的結合。因此，以熒光標志物的表達為橫軸，相對于縱軸上的抗體結合進行作圖。與突變的cldn6結合的單克隆嵌合cldn6特異性抗體的平均信號強度表示為野生型結合的百分比。在被突變之后，對于結合至關重要的氨基酸不顯示結合，而支持結合的氨基酸僅顯示與野生型相比降低的結合。

免疫組織化學

在切片后-20℃下用丙酮將冷沉淀的組織切片(4μm)直接固定10分鐘。然后，在rt下將切片干燥10分鐘并在-80℃儲存。在使用前將切片解凍(rt下10分鐘)并在pbs中再水化5分鐘。在rt下用pbs中的0.3％過氧化氫封閉內源性過氧化物還原酶活性15分鐘。為了避免非特異性結合，在rt下用pbs中的10％山羊血清封閉載玻片30分鐘。其后，在4℃下將載玻片與cldn6特異性鼠單克隆抗體mumab64a(在10％山羊血清/pbs中稀釋為0.2μg/ml)一起孵育過夜。第二天，在rt下用pbs清洗載玻片(3×5分鐘)，在rt下與100μl二抗(即用的powervisionpolyhrp-抗小鼠igg(immunologic))一起孵育1小時。其后，在rt下用pbs清洗載玻片(3×5分鐘)。通過使用vectorlaboratories(burlingame)的vectornovaredsubstratekitsk-4800進行1：30分鐘的最后染色。在rt下用蘇木精復染切片90秒。用梯度的醇(70％、80％、2×96％和99％，每次5分鐘)脫水并且在二甲苯中孵育10分鐘之后，用x-trakit(meditehistotechnic)封片。

為了在人組織上使用嵌合單克隆抗體mab206-lcc和mab206-subg，所述抗體標記有fitc(squarixgmbh，germany)。制備冷凍切片并且如上關于固定、內源性過氧化物酶封閉和非特異性結合位點封閉所述的進行處理。之后，在暗室中在rt下將載玻片與抗體mab206-lcc-fitc和mab206-subg-fitc(10％山羊血清/pbs中的1μg/ml)一起孵育1小時。然后在rt下用pbs清洗載玻片(3×5分鐘)，并且在rt下與200μl兔抗fitc-hrp抗體(abdserotec，以1∶300稀釋在10％山羊血清/pbs中)一起孵育30分鐘。在rt下用pbs清洗(3×5分鐘)之后，通過使用vectorlaboratories(burlingame)的vectornovaredsubstratekitsk-4800進行2：30分鐘的底物反應。如上所述進行復染、脫水和封片。

使用分別經人cldn6、3、4和9瞬時轉染的hek293t細胞通過流式細胞術針對cldn6嵌合單克隆抗體的結合特異性的分析表明，嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs分別顯示出與cldn6相結合而不與cldn3、4和9相互作用(圖27)。

關于與在hek293細胞表面上穩定表達的人cldn6的結合，抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs表現出類似低的ec50值，并且在低濃度達到飽和結合(圖28)。

通過流式細胞術分析與睪丸癌細胞系nec8的結合來評價抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs與內源性表達人cldn6之腫瘤細胞的結合親和力。與cldn6特異性抗體chimab64a、mab206-subg和mab206-subs相比，輕鏈組合變體mab206-lcc顯示出與nec8細胞強三倍的結合親和力。在所有的情況下，在低濃度達到飽和結合(圖29)。

通過流式細胞術針對cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs與人卵巢癌細胞系ov90的結合親和力的分析表明，cldn6特異性抗體表現出類似低的ec50值。輕鏈組合變體mab206-lcc顯示出與ov90細胞最強的結合(圖30)。

抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc和mab206-subg對nec-8細胞表現出劑量依賴性方式的cdc活性，而對于nec-8cldn6敲低細胞，這些抗體都不誘導非特異性細胞裂解。該結果證明chimab64a、mab206-lcc和mab206-subg的靶標特異性效應功能(圖31a)。

抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs對nec8細胞表現出劑量依賴性方式的cdc活性。與chimab64a相比，氨基酸替換變體mab206-subg和mab206-subs對nec8細胞顯示出類似的cdc活性(圖31b)。

抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs在nec8和ov90腫瘤細胞系中顯示出劑量依賴性的adcc活性，并且甚至在低抗體濃度下誘導adcc(圖32a)。

圖32b示出了抗cldn6嵌合單克隆抗體chimab64a、mab206-lcc和mab206-subg對nec8野生型細胞和nec8敲低細胞的抗體依賴性細胞毒作用(adcc)活性。為了證明靶標特異性，使用了具有穩定cldn6敲低的nec8細胞。

使用植入腫瘤細胞系nec8之小鼠的晚期治療異種移植模型顯示出，與抗體對照組相比，cldn6特異性抗體mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs抑制腫瘤生長(圖33)。

圖34a的生長曲線證明，抗cldn6嵌合單克隆抗體mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs能夠抑制腫瘤生長。圖34b的存活圖顯示出用cldn6特異性抗體治療的小鼠的存活延長。

chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs的高分辨率表位作圖證明，cldn6第一細胞外結構域的氨基酸f35、g37和s39以及可能的t33對于與cldn6特異性嵌合抗體的相互作用是重要的。chimab64a、mab206-lcc、mab206-subg和mab206-subs顯示出相同的結合形式(圖35)。

為了測試抗cldn6鼠單克隆抗體mumab64a在轉移異種移植模型中的治療作用，將nec8細胞注射到無胸腺的nude-foxn1^nu小鼠的尾靜脈中。植入3天之后，用cldn6特異性抗體mumab64a治療小鼠。8周之后，制備肺并通過pcr分析腫瘤負荷。與pbs對照組相比，鼠單克隆抗體mumab64a清楚地顯示出腫瘤生長的抑制(圖36)。

使用單克隆抗體mumab64a、mab206-lcc和mab206-subg對人癌組織和正常組織進行免疫組織化學染色表明，與正常組織相比，在來自卵巢癌和睪丸癌的組織切片上觀察到強的均勻的染色。檢測到惡性腫瘤上皮細胞群非常強的膜染色，而相鄰的基質細胞和非惡性上皮細胞沒有被染色(圖37)。這些結果清楚地表明，我們的cldn6特異性抗體與來源于腫瘤患者的惡性細胞特異性結合。(解釋：被抗體染色的組織的數目/被分析組織的數目。)

生物材料的附加頁

另外保藏物的識別

1)保藏機構的名稱和地址：

德國微生物菌種和細胞培養物保藏中心

inhoffenstr.7b

38124brauschweig

de

針對上述保藏物的額外指示：

-小鼠(musmusculus)骨髓瘤p3x63ag8.653與小鼠(musmusculus)的脾細胞融合

-分泌抗人cldn6抗體的雜交瘤

2)保藏人：

所有上述保藏物均由以下單位制備：

加尼梅德藥物公司(ganymedpharmaceuticalsag)

freiligrathstraβe12

55131mainz

de

序列表

<110>ganymedpharmaceuticalsag等

<120>用于治療表達密蛋白6之癌癥的抗體

<130>342-64pct

<150>ep11004004.5

<151>2011-05-13

<150>us61/486,071

<151>2011-05-13

<160>57

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1369

<212>dna

<213>人

<400>1

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atggcctctgccggaatgcagatcctgggagtcgtcctgacactgctgggctgggtgaat120

ggcctggtctcctgtgccctgcccatgtggaaggtgaccgctttcatcggcaacagcatc180

gtggtggcccaggtggtgtgggagggcctgtggatgtcctgcgtggtgcagagcaccggc240

cagatgcagtgcaaggtgtacgactcactgctggcgctgccacaggacctgcaggctgca300

cgtgccctctgtgtcatcgccctccttgtggccctgttcggcttgctggtctaccttgct360

ggggccaagtgtaccacctgtgtggaggagaaggattccaaggcccgcctggtgctcacc420

tctgggattgtctttgtcatctcaggggtcctgacgctaatccccgtgtgctggacggcg480

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ctgtgctgcacttgcccctcgggggggtcccagggccccagccattacatggcccgctac660

tcaacatctgcccctgccatctctcgggggccctctgagtaccctaccaagaattacgtc720

tgacgtggaggggaatgggggctccgctggcgctagagccatccagaagtggcagtgccc780

aacagctttgggatgggttcgtaccttttgtttctgcctcctgctatttttcttttgact840

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gctctgctgtttctcacccttggatgatggagccaaagaggggatgctttgagattctgg960

atcttgacatgcccatcttagaagccagtcaagctatggaactaatgcggaggctgcttg1020

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tctcttcacccctggaaaaacaaatgatctgttaacaaaggactgcccacctccggaact1200

tctgacctctgtttcctccgtcctgataagacgtccaccccccagggccaggtcccagct1260

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ccccctttacactcacatttttatcaaataaagcatgttttgttagtgc1369

<210>2

<211>220

<212>prt

<213>人

<400>2

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151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

<210>3

<211>805

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>編碼人密蛋白6的密碼子優化的核酸序列

<400>3

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gcaacagcatcgtggtggcccaggtcgtgtgggagggcctgtggatgagctgtgtggtgc240

agagcaccggccagatgcagtgcaaggtgtacgacagcctgctggccctgcctcaggatc300

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gcggaggcctgctgtgctgtacatgtcctagcggcggctcccagggccctagccactaca660

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agaactacgtgtgataggaattcgagctcttatggcgcgcccaattcgccctatagtgag780

tcgtattacgtcgcgctcactggcc805

<210>4

<211>165

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>編碼預測的人密蛋白6的細胞外環2（ec2）的密碼子優化的核酸序列

<400>4

ggcgcgccaaggtaccaagcttgccaccatggaaaccgacaccctgctgctgtgggtgct60

gctcctgtgggtcccaggctctacaggcgacgccgcccagcccagagacttctacaaccc120

cctggtggccgaggcccagaagctcgagtctagagggttaattaa165

<210>5

<211>38

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>預測的含有igκ前導序列的人密蛋白6的第2細胞外環

<220>

<221>信號

<222>(1)..(21)

<223>igκ前導序列

<220>

<221>結構域

<222>(26)..(38)

<223>預測的人密蛋白6的第2細胞外環（ec2）

<400>5

metgluthraspthrleuleuleutrpvalleuleuleutrpvalpro

151015

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202530

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<210>6

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<213>人

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1510

<210>7

<211>53

<212>prt

<213>人

<400>7

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151015

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202530

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354045

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<210>8

<211>220

<212>prt

<213>人

<220>

<221>variant

<222>(143)..(143)

<223>人密蛋白6的i143v多態性

<400>8

metalaseralaglymetglnileleuglyvalvalleuthrleuleu

151015

glytrpvalasnglyleuvalsercysalaleupromettrplysval

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145150155160

glyalaserleutyrvalglytrpalaalaserglyleuleuleuleu

165170175

glyglyglyleuleucyscysasncysproproargthrasplyspro

180185190

tyrseralalystyrseralaalaargseralaalaalaserasntyr

195200205

val

<210>11

<211>220

<212>prt

<213>人

<400>11

metsermetglyleugluilethrglythralaleualavalleugly

151015

trpleuglythrilevalcyscysalaleupromettrpargvalser

202530

alapheileglyserasnileilethrserglnasniletrpglugly

354045

leutrpmetasncysvalvalglnserthrglyglnmetglncyslys

505560

valtyraspserleuleualaleuproglnaspleuglnalaalaarg

65707580

alaleuilevalvalalaileleuleualaalapheglyleuleuval

859095

alaleuvalglyalaglncysthrasncysvalglnaspaspthrala

100105110

lysalalysilethrilevalalaglyvalleupheleuleualaala

115120125

leuleuthrleuvalprovalsertrpseralaasnthrileilearg

130135140

aspphetyrasnprovalvalproglualaglnlysargglumetgly

145150155160

alaglyleutyrvalglytrpalaalaalaalaleuglnleuleugly

165170175

glyalaleuleucyscyssercysproproargglulyslystyrthr

180185190

alathrlysvalvaltyrseralaproargserthrglyproglyala

195200205

serleuglythrglytyrasparglysasptyrval

210215220

<210>12

<211>159

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>編碼預測的人密蛋白6的細胞外環1（ec1）的密碼子優化的核酸序列

<400>12

cccatgtggaaagtgaccgccttcatcggcaacagcatcgtggtggcccaggtggtctgg60

gagggcctgtggatgagctgcgtggtgcagagcaccggccagatgcagtgcaaggtgtac120

gacagcctgctggccctgcctcaggatctgcaggctgct159

<210>13

<211>106

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>預測的含有igκ前導序列的人密蛋白6的第1細胞外環

<220>

<221>信號

<222>(1)..(21)

<223>igκ前導序列

<220>

<221>結構域

<222>(26)..(78)

<223>預測的人密蛋白6的第1細胞外環（ec1）

<400>13

metgluthraspthrleuleuleutrpvalleuleuleutrpvalpro

151015

glyserthrglyaspalaalaglnpropromettrplysvalthrala

202530

pheileglyasnserilevalvalalaglnvalvaltrpgluglyleu

354045

trpmetsercysvalvalglnserthrglyglnmetglncyslysval

505560

tyraspserleuleualaleuproglnaspleuglnalaalaleuglu

65707580

serargglyprophegluglnlysleuileserglugluaspleuasn

859095

methisthrglyhishishishishishis

100105

<210>14

<211>13

<212>prt

<213>人

<400>14

promettrplysvalthralapheileglyasnserile

1510

<210>15

<211>15

<212>prt

<213>人

<400>15

mettrplysvalthralapheileglyasnserilevalvalala

151015

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>寡核苷酸

<400>16

tccatgacgttcctgacgtt20

<210>17

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>17

gagaaagcttgccgccaccatgggatggagctggatctttctc43

<210>18

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>18

gagagggcccttggtggaggctgaagagactgtgagagtggtg43

<210>19

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>19

gagagggcccttggtggaggctgaggagactgtgagagtggtg43

<210>20

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>20

gagagggcccttggtggaggctgaggagactgtgagagtggtg43

<210>21

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>21

gagaaagcttgccgccaccatgcattttcaagtgcagattttcagc46

<210>22

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>22

cacacgtacgtttgatttccagcttggtgcctc33

<210>23

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>23

cacacgtacgtttgatttccagcttggtgcctc33

<210>24

<211>993

<212>dna

<213>人

<400>24

gcctccaccaagggcccaagcgtgttccccctggcccccagcagcaagagcaccagcggc60

ggcacagccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgagc120

tggaacagcggagccctgacctccggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagc180

ggcctgtacagcctgagcagcgtggtgaccgtgcccagcagcagcctgggcacccagacc240

tacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtggagccc300

aagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgcccagccccagagctgctgggcgga360

cccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcaggaccccc420

gaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaggacccagaggtgaagttcaactgg480

tacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggagcagtacaac540

agcacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaag600

gaatacaagtgcaaggtctccaacaaggccctgccagcccccatcgaaaagaccatcagc660

aaggccaagggccagccacgggagccccaggtgtacaccctgccccccagccgggaggag720

atgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctaccccagcgacatc780

gccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccccccagtg840

ctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagtccaggtgg900

cagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacc960

cagaagtccctgagcctgagccccggcaagtag993

<210>25

<211>330

<212>prt

<213>人

<400>25

alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys

151015

serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr

65707580

tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys

859095

argvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys

100105110

proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro

115120125

lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys

130135140

valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrp

145150155160

tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu

165170175

gluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleu

180185190

hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn

195200205

lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysgly

210215220

glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu

225230235240

metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr

245250255

proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn

260265270

asntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphephe

275280285

leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn

290295300

valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr

305310315320

glnlysserleuserleuserproglylys

325330

<210>26

<211>324

<212>dna

<213>人

<400>26

cgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagtcc60

ggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctacccccgggaggccaaggtgcag120

tggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtcaccgagcaggac180

agcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgag240

aagcacaaggtgtacgcctgcgaggtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaag300

agcttcaacaggggcgagtgctag324

<210>27

<211>107

<212>prt

<213>人

<400>27

argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu

151015

glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe

202530

tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln

354045

serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser

505560

thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu

65707580

lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser

859095

provalthrlysserpheasnargglyglucys

100105

<210>28

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(31)..(32)

<223>任何核苷酸

<400>28

ttttttttttttttttttttttttttttttnn32

<210>29

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>29

aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg30

<210>30

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>30

ctgctcactggatggtgggaagatgg26

<210>31

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>31

acaggggccagtggatagaccgatg25

<210>32

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>32

gtaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt45

<210>33

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>33

gtaatacgactcactatagggc22

<210>34

<211>117

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vh序列

<400>34

gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala

151015

sermetlysilesercyslysalaserglytyrserphethrglytyr

202530

thrmetasntrpvallysglnserhisglylysasnleuglutrpile

354045

glyleuileasnprotyrasnglyglythrsertyrasnglnlysphe

505560

lysglylysalathrleuthrileasplysserserserthralatyr

65707580

metgluleuleuserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys

859095

alaargasptyrglytyrvalleuasptyrtrpglyglnglythrthr

100105110

leuthrvalserser

115

<210>35

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vl序列

<400>35

glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserprogly

151015

glulysvalthrilethrcysseralaserserservalsertyrleu

202530

histrppheglnglnlysproglythrserprolysleutrpvaltyr

354045

serthrserasnleuproserglyvalproalaargpheglyglyser

505560

glyserglythrsertyrserleuthrileserargmetglualaglu

65707580

aspalaalathrtyrtyrcysglnglnargseriletyrproprotrp

859095

thrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105

<210>36

<211>117

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vh序列

<400>36

gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala

151015

sermetlysilesercyslysalaserglytyrserphethrglytyr

202530

thrmetasntrpvallysglnserhisglylysasnleuglutrpile

354045

glyleuileasnprotyrasnglyglythriletyrasnglnlysphe

505560

lysglylysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyr

65707580

metgluleuleuserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys

859095

alaargasptyrglyphevalleuasptyrtrpglyglnglythrthr

100105110

leuthrvalserser

115

<210>37

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vl序列

<400>37

glnilevalleuthrglnserproserilemetservalserprogly

151015

glulysvalthrilethrcysseralaserserservalsertyrmet

202530

histrppheglnglnlysproglythrserprolysleucysiletyr

354045

serthrserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyarg

505560

glyserglythrsertyrserleuthrileserargvalalaalaglu

65707580

aspalaalathrtyrtyrcysglnglnargserasntyrproprotrp

859095

thrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105

<210>38

<211>117

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vh序列

<400>38

gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala

151015

sermetlysilesercyslysalaserglytyrserphethrglytyr

202530

thrmetasntrpvallysglnserhisglylysasnleuglutrpile

354045

glyleuileasnprotyrasnglyglyileiletyrasnglnlysphe

505560

lysglylysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyr

65707580

metgluleuleuserleuthrsergluaspseralavalphetyrcys

859095

alaargasppheglytyrvalleuasptyrtrpglyglnglythrthr

100105110

leuthrvalserser

115

<210>39

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vl序列

<400>39

glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserprogly

151015

glulysvalthrilethrcysseralaserserservalsertyrmet

202530

histrppheglnglnlysproglythrserprolysleutrpiletyr

354045

serthrserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyser

505560

glyserglythrsertyrserleuthrileserargvalalaalaglu

65707580

aspalaalathrtyrtyrcysglnglnargserthrtyrproprotrp

859095

thrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105

<210>40

<211>117

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vh序列

<400>40

gluvalglnleuglnglnserargprogluleuvallysproglyala

151015

sermetlysilesercyslysalaserglytyrserphethrglytyr

202530

thrleuasntrpvallysglnserhisglylysasnleuglutrpile

354045

glyleuileasnprotyrasnglyglysersertyrasnglnlysphe

505560

lysasplysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyr

65707580

metgluleuleuserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys

859095

alaargasptyrglytyrvalpheasptyrtrpglyglnglythrthr

100105110

leuthrvalserser

115

<210>41

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vl序列

<400>41

glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserprogly

151015

glulysvalthrilethrcysseralaserserservalasntyrmet

202530

histrppheglnleulysproglythrserprolysleuleuiletyr

354045

serthrserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyarg

505560

glyserglythrsertyrserleuthrileserargmetglualaglu

65707580

aspalaalathrtyrtyrcysglnglnargasnasntyrproprotrp

859095

thrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105

<210>42

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vhcdr3序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>任何氨基酸，優選leu或phe，更優選leu

<400>42

xaaglyxaavalxaa

15

<210>43

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vhcdr3序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>任何氨基酸，優選leu或phe，更優選leu

<400>43

aspxaaglyxaavalxaa

15

<210>44

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vhcdr3序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>任何氨基酸，優選leu或phe，更優選leu

<400>44

xaaglyxaavalxaaasp

15

<210>45

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vhcdr3序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>任何氨基酸，優選leu或phe，更優選leu

<400>45

aspxaaglyxaavalxaaasp

15

<210>46

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vhcdr3序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>任何氨基酸，優選芳族氨基酸，更優選phe或tyr，最優選tyr

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>任何氨基酸，優選leu或phe，更優選leu

<400>46

alaargaspxaaglyxaavalxaaasptyr

1510

<210>47

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vhcdr1序列

<400>47

glytyrserphethrglytyrthr

15

<210>48

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vhcdr2序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>任何氨基酸，優選thr、ser或ile，最優選thr

<400>48

ileasnprotyrasnglyglyxaa

15

<210>49

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vlcdr3序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>任何氨基酸，優選ser或asn，最優選ser

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>任何氨基酸，優選tyr、ser、ile、asn或thr，更優選tyr、ser或asn，最優選asn

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>任何氨基酸，優選ser或tyr，更優選tyr

<400>49

argxaaxaaxaapro

15

<210>50

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vlcdr3序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>任何氨基酸，優選ser或asn，最優選ser

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>任何氨基酸，優選tyr、ser、ile、asn或thr，更優選tyr、ser或asn，最優選asn

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>任何氨基酸，優選ser或tyr，更優選tyr

<400>50

glnargxaaxaaxaapropro

15

<210>51

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vlcdr3序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>任何氨基酸，優選ser或asn，最優選ser

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>任何氨基酸，優選tyr、ser、ile、asn或thr，更優選tyr、ser或asn，最優選asn

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>任何氨基酸，優選ser或tyr，更優選tyr

<400>51

glnglnargxaaxaaxaaproprotrpthr

1510

<210>52

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vlcdr1序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>任何氨基酸，優選ser或asn，最優選ser

<400>52

serservalxaatyr

15

<210>53

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vlcdr2序列

<400>53

serthrser

1

<210>54

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vl序列

<400>54

glnilevalleuthrglnserproserilemetservalserprogly

151015

glulysvalthrilethrcysseralaserserservalsertyrmet

202530

histrppheglnglnlysproglythrserprolysleuglyiletyr

354045

serthrserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyarg

505560

glyserglythrsertyrserleuthrileserargvalalaalaglu

65707580

aspalaalathrtyrtyrcysglnglnargserasntyrproprotrp

859095

thrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105

<210>55

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗體vl序列

<400>55

glnilevalleuthrglnserproserilemetservalserprogly

151015

glulysvalthrilethrcysseralaserserservalsertyrmet

202530

histrppheglnglnlysproglythrserprolysleuseriletyr

354045

serthrserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyarg

505560

glyserglythrsertyrserleuthrileserargvalalaalaglu

65707580

aspalaalathrtyrtyrcysglnglnargserasntyrproprotrp

859095

thrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105

<210>56

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>56

gggataatttcagctgactaaacag25

<210>57

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>57

ttccgtttagttaggtgcagttatc25