抗人c-反應蛋白抗體及其應用
【專利摘要】本發明涉及抗人C?反應蛋白抗體及其應用。本發明制備了多種抗體，并進行配對篩選，獲得靈敏度及特異性均能滿足需求的抗體組合(P24及P03)；同時其方便大量生產，可滿足日后大規模臨床應用的需求。對上述抗體組合進行檢測體系的調試優化工作，獲得操作簡便，靈敏度，特異性及相關檢測性能可滿足人臨床樣本檢測的人C?反應蛋白的時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡。
【專利說明】
抗人G-反應蛋白抗體及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體的涉及兩種抗人C-反應蛋白（CRP)抗體及其制備 方法以及上述抗體在人c-反應蛋白檢測中的應用。
【背景技術】
[0002] C-反應蛋白（C reactive protein，CRP)是蛋白質家族中的一員，是一種急性期反 應蛋白，在組織損傷和細菌感染時血漿濃度急劇升高，是機體重要的防御分子，主要由肝臟 產生并分泌。CRP由五個完全相同的球形單體以非共價鍵結合組成穩定的盤狀結構，屬于正 五聚體家族。CRP在結構上為對稱的五面體，其單體由206個氨基酸組成，分子量約為23KDa， CRP的總分子量約為118KDa<XRP參與體內的各種炎癥及免疫反應，是冠狀動脈粥樣硬化性 心臟病(冠心病）的重要標志物。大量研究表明：高水平的CRP是周圍性血管病、心肌梗死、腦 血管病及血管性死亡的獨立風險預測因子。
[0003] 在正常人血清中CRP含量極少，濃度為0.062-8.2mg/L，半衰期約為15小時。當發生 細菌感染2小時后即開始升高，平均8小時增加1倍，48小時達高峰，其在病毒感染時則不會 升高。CRP持續升高則提示機體存在慢性炎癥或自身免疫性疾病。CRP變化不受病人的個體 差異、機體狀態及治療藥物的影響。另外，CRP在其他領域亦發揮著重要的作用:①在由慢性 炎癥引發心血管疾病的獨立危險因素中CRP的作用已被證實，及時監測CRP的水平變化對心 血管疾病的干預及預后起重要作用。有些學者甚至認為CRP可作為心血管危險評估的金標 準，且CRP水平越高，發生心腦血管的危險性就越大;②CRP可用來評價急性胰腺炎的嚴重程 度，當發生廣泛壞死性胰腺炎時血清中CRP的水平可高達250mg/L;③如將CRP與甲胎蛋白聯 合應用，可用來鑒別肝臟惡性腫瘤與良性疾病，為臨床治療方案制定提供指導；另外，CRP測 定對腫瘤的治療和預后亦有積極的意義，惡性腫瘤患者CRP水平大都升高，手術切除腫瘤后 CRP水平則會下降，且進行放療、化療和皮質激素治療對血清CRP的影響非常小，所以測定血 清CRP的水平變化有助于臨床估測各個器官系統中惡性腫瘤的進展過程。④評估患者預后： CRP水平越高，提示疾病控制不佳，預后不良。
[0004] 鑒于CRP在眾多領域中的重要作用，制備CRP抗體并用于制備CRP定量檢測試劑盒 具有重要的臨床應用價值。CRP通常是通過抗體濁度法或免疫比濁法測定的，而他們的檢測 能力在3-5mg/L以上，這個水平僅僅適用于對感染的預測，而對于冠脈及腦血管的危險預測 是遠遠不夠的。除上述技術以外，使用膠體金和熒光定量檢測技術的CRP試紙卡，可滿足快 速檢測及床旁檢測的需求。其中熒光定量檢測具備較高的檢測性能，因此適用于檢測精密 度要求較高的檢驗中心或大型醫院臨床科室的應用需求。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是提供能有效的、特異性結合人C-反應蛋白的抗體。更 具體地說：
[0006] 本發明的第一目的在于提供兩種抗人C-反應蛋白抗體。
[0007]第一種抗人c-反應蛋白抗體(記為P24)，
[0008] 其重鏈可變區含有以下的互補決定區：氨基酸序列如序列SEQ ID NO: 1所示的 HCDR1、如序列SEQ ID N0:2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID N0:3所示的HCDR3;
[0009] 以及其輕鏈可變區序列含有以下的互補決定區：氨基酸序列如序列SEQ ID N0:4 所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID N0:6所示的LCDR3。
[0010] 優選的是本發明中的抗體P24的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，輕 鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0011] 第二種抗人c-反應蛋白抗體(記為P03)，
[0012] 其重鏈可變區含有以下的互補決定區：氨基酸序列如序列SEQ ID N0:9所示的 HCDR1、如序列SEQ ID N0:10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID N0:11所示的HCDR3;
[0013] 以及其輕鏈可變區序列含有以下的互補決定區：氨基酸序列如序列SEQ ID NO: 12 所示的LCDR1、如序列SEQIDN0:13所示的LCDR2和/或如序列SEQIDN0:14所示的LCDR3。
[0014] 優選的是本發明中的抗體重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，輕鏈可 變區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0015] 本發明第二個目的是提供兩種單鏈抗體，所述單鏈抗體P24的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示;所述單鏈抗體P03的氨基酸序列如SEQ ID N0:21所示。
[0016] 本發明第三個目的是提供兩種編碼上述單鏈抗體的核苷酸序列，編碼單鏈抗體 P24的核苷酸序列如SEQIDN0:18所示，和編碼單鏈抗體P03的核苷酸序列如SEQIDN0:20 所示。
[0017] 本發明第四個目的是提供一種含有上述核苷酸序列的表達載體。
[0018] 本發明第五個目的是提供一種含有上述表達載體的重組宿主細胞。所屬宿主細胞 可以是大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞，優選為畢赤酵母。
[0019] 本發明第六個目的是提供一種生產上述單鏈抗體的方法，包括：
[0020] 1)在合適的條件下培養上述重組宿主菌表達抗體；
[0021] 2)然后從宿主菌中純化、收集抗體。
[0022]本發明的第七個目的在于提供上述抗人C-反應蛋白抗體在檢測人C-反應蛋白含 量中的應用。
[0023]本發明的第八個目的在于提供一組可進行配對并檢測人C-反應蛋白的抗體對組 合;該抗體對組合的檢測靈敏度高，特異性好。
[0024]本發明的第九個目的在于提供一種利用所述抗人C-反應蛋白抗體檢測人C-反應 蛋白的時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡，包括樣品墊、熒光結合墊、反應膜和吸水墊;所 述熒光結合墊噴涂有熒光微球標記的抗體P03,所述反應膜上有檢測帶和質控帶，檢測帶位 置包被有抗體P24,質控帶位置包被抗His標簽抗體或Protein L。所述反應膜優選硝酸纖維 素膜。所述抗Hi s標簽抗體優選鼠抗Hi s抗體。
[0025]本發明制備了多種抗體，并進行配對篩選，獲得靈敏度及特異性均能滿足需求的 抗體組合(P24及P03);同時其方便大量生產，可滿足日后大規模臨床應用的需求。對上述抗 體組合進行檢測體系的調試優化工作，獲得操作簡便，靈敏度，特異性及相關檢測性能均可 滿足人臨床樣本檢測的人C-反應蛋白的時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡。
【附圖說明】
[0026] 圖1.抗體重鏈及輕鏈可變區基因電泳圖。Lane 1和Lane4為200bp DNA Ladder; Lane 2為抗體P24重鏈可變區DNA; Lane 3為抗體P24輕鏈可變區DNA; Lane5為抗體P03重鏈 可變區DNA;Lane 6為抗體P03輕鏈可變區DNA。
[0027] 圖2.單鏈抗體結構示意圖。VH表示重鏈可變區序列，VL表示輕鏈可變區序列，His標 簽為六個組氨酸。
[0028] 圖3.單鏈抗體PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0029] 其中，圖3-a.為單鏈抗體P24基因 PCR產物;圖3-b為單鏈抗體P03基因 PCR產物。
[0030] 圖4.重組單鏈抗體畢赤酵母菌株誘導表達上清培養液鑒定圖。
[0031] 其中，圖4-a為重組單鏈抗體P24重組畢赤酵母菌株誘導表達上清培養液SDS-PAGE 電泳鑒定圖；圖4-b為重組單鏈抗體P03重組畢赤酵母菌株誘導表達上清培養液SDS-PAGE電 泳鑒定圖。
[0032]圖5. SDS-PAGE電泳鑒定單鏈抗體純化效果圖。
[0033] 其中，圖5-a為SDS-PAGE電泳鑒定單鏈抗體P24純化效果圖；圖5-b為SDS-PAGE電泳 鑒定單鏈抗體P03純化效果圖
[0034] 圖6.為本發明時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡結構示意圖。1為樣品墊、2為反 應膜、3為吸水墊、4為質控線(C線）、5為檢測線(T線）、6為熒光結合墊、7為PVC片材。
[0035] 圖7.本發明時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡檢測范圍擬合曲線。其中橫坐標為 蛋白濃度(ng/mL);縱坐標為檢測值;r 2為0 · 998。
[0036] 圖8.本發明時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡線性范圍擬合曲線。其中橫坐標為 理論濃度(ng/mL);縱坐標為檢測值;r 2為0.996。
[0037] 圖9.時間分辨免疫熒光層析定量檢測與酶聯免疫檢測結果相關性。
【具體實施方式】
[0038] 定義
[0039] "抗體"又稱免疫球蛋白，是一類由B淋巴細胞分泌的大型Y形蛋白質，能夠通過Y形 的其中兩個分叉頂端的互補位點(抗原結結合位)特異性結合靶抗原的免疫球蛋白分子，所 述靶抗原如蛋白質、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。
[0040] "單鏈抗體"（scFv)指的是抗體的重鏈可變區（Vh)和輕鏈可變區（Vl)通過15~20個 氨基酸短肽(1 inker)連接形成的單一鏈融合蛋白，用于連接的1 inker通常富含甘氨酸和絲 氨酸，以利于單鏈抗體的穩定性與柔韌性。連接方式可將Vl的N端連接至VH的C末端，或者相 反。盡管去除了恒定區并引入linker，單鏈抗體依然保留了抗體對抗原的特異性，且其具有 分子量小、穿透力強和抗原性弱等特點。
[0041 ]互補決定區（complementarity-determining region，CDR)，也叫做高變區。成型 于抗體單體氨基酸的末端，是靶抗原與抗體結合的最關鍵區域，在免疫網絡理論中，每個抗 體的互補決定區又被稱為獨特型或者基因型。
[0042]實施例1.抗人C-反應蛋白雜交瘤細胞株的制備 [0043] 1.動物免疫
[0044]以提取于人血漿的C-反應蛋白（購買于HyTest公司）按照一般免疫程序免疫BALB/ c雌性小鼠（購自常州卡文斯實驗動物有限公司）。具體免疫情況參見《抗體制備與使用實驗 指南》。采用間接ELISA法跟蹤免疫小鼠血清滴度，選取血清效價最高的免疫小鼠，進行小鼠 脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞進行融合實驗。
[0045] 2.細胞融合
[0046] (1).脾臟細胞的制備
[0047] 將免疫小鼠，摘眼球取血，經斷頸椎處死后置于75% (v/v)的酒精中浸泡10分鐘， 于無菌操作臺中取出其脾臟，置于細胞篩網中，充分研磨細胞，過篩網，用無菌1640培養基 (購自Gibco公司）離心洗滌數次后，重懸細胞以制成單細胞懸液，并計數，備用。
[0048] (2).飼養細胞的制備
[0049] 取8~10周齡的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球獲取陰性血清，經斷頸椎處死后置 75 % (v/v)酒精中浸泡10分鐘;無菌揭開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器將約10mL 1640HT培 養基(購自SIGMA公司）注入小鼠腹腔，輕輕按摩腹部并吹打數次。吸取含有巨噬細胞的培養 基注入20 % 1640HAT培養基中備用；
[0050] 取2~3周齡的雌性BALB/c小鼠一只，經斷頸椎處死后置于75% (v/v)酒精中浸泡 10分鐘;無菌取胸腺于細胞篩網中，研磨，過篩網，獲得胸腺細胞置于上述含有巨噬細胞的 20 % 1640HAT培養基中，備用。
[0051] ⑶·細胞融合
[0052] 選擇處于對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0,收集并計數。取約108個上述脾 細胞與2X10 7個上述SP2/0細胞株加入融合管中混合，lOOOrpm離心10分鐘后棄上清(盡量 棄凈），將融合管置手掌上來回輕輕摩擦以使沉淀松散。60秒內先慢后快地加入lmL預熱的 PEG1450(聚乙二醇1450,購自SIGMA公司），加入1640HT培養基30mL終止，lOOOrpm離心10分 鐘，去上清，輕輕摩擦使沉淀松散，加入步驟2所獲得的20 %的1640HAT培養基中。
[0053] 將上述HAT培養基充分混勻后，以200yL/孔分裝至96孔細胞培養板中，置37°C，5% C〇2的細胞培養箱中培養。一周后用10%1640HT培養基替換20%1640HAT培養基，3天后取上 清進行檢測。
[0054] 3.抗人C-反應蛋白特異性雜交瘤株篩選
[0055] (1).檢測板的準備：用CB包被液稀釋CRP(購買于HyTest公司）至lyg/mL，包被96孔 ELISA酶標板，100yL/孔，2~8 °C包被過夜，洗滌一次拍干；含2 %牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，購買于鹽城賽寶生物科技有限公司）的PBST緩沖液封閉（200ul/孔）， 37°C封閉2小時；拍干，備用。
[0056] (2).陽性克隆的篩選:將待檢細胞培養上清100μL孔加入上述檢測板中，于37°C 作用30分鐘后洗滌并拍干，加入lOOyL/孔的HRP標記的羊抗鼠 IgG，于37°C作用30分鐘后洗 滌并拍干，加入l〇〇yL/孔的TMB顯色液，于37°C避光顯色15分鐘，每孔加入50yL的2M H2S〇4終 止反應，并于0D450處讀取數值。陽性孔確定原則:0D450值/陰性對照值2 2.1。選取陽性克 隆株進行細胞克隆化篩選。經過三至四輪的克隆化篩選后，單克隆細胞株陽性率100%即確 定為穩定細胞株，對細胞株進行定株。雜交瘤細胞株M24及M03均具有較高的效價，遂后續進 一步對上述雜交瘤細胞株進行抗體可變區序列測序分析。
[0057] 實施例2.雜交瘤細胞株抗體可變區序列的測定
[0058] 對上述雜交瘤細胞株M24及M03抗體可變區序列進行測定。
[0059] a. RNA的提取:參照細胞總RNA抽提試劑盒(購自Roche公司）說明書對上述雜交瘤 細胞株M24及M03進行總RNA提取并立即進行反轉錄；
[0060] b.RNA反轉錄成為DNA:參照Thermo Scientific Reverted First strand cDNA SynthesisKit (購自Thermo公司）對上一步驟中所提取的總RNA進行反轉錄，制得cDNA，凍存 于-20°C備用；
[0061] c.可變區序列的PCR擴增及回收：以上一步驟中所得cDNA為模板，以鼠 IgG亞型單 克隆抗體可變區序列通用引物為引物，對重鏈及輕鏈的可變區序列進行PCR擴增，將PCR產 物經DNA膠回收試劑盒(購自TIANGEN公司）進行回收，見附圖1;
[0062] d·可變區序列的克隆和序列測定：按照克隆載體pMD18-T kit(購自Takara公司） 說明書，將重鏈和輕鏈可變區基因分別與pMDl 8-T載體進行連接，轉化大腸桿菌DH5a，挑取 陽性克隆，交由南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。
[0063] 測序得到雜交瘤細胞株M24的抗體重鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示、輕 鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。Vbase2數據庫分析上述序列，其重鏈可變區的各 互補決定區的氨基酸序列分別是：如序列SEQ ID N0:1所示的HCDR1、如序列SEQ ID N0:2所 示的HCDR2和如序列SEQ ID NO:3所示的HCDR3;其輕鏈可變區的各互補決定區的氨基酸序 列是：如序列SEQ ID N0:4所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2和如序列SEQ ID 從):6所示的1^0)1?3。
[0064] 測序得到雜交瘤細胞株M03的抗體重鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID N0:15所示、 輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。Vbase2數據庫分析上述序列，其重鏈可變區 的各互補決定區的氨基酸序列分別是：如序列SEQ ID N0:9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO: 10所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO: 11所示的HCDR3;其輕鏈可變區的各互補決定區的 氨基酸序列是：如序列SEQIDN0:12所示的LCDR1、如序列SEQIDN0 :13所示的LCDR2和如 序列SEQ ID從)：14所示的1^0)1?3。
[0065]實施例3.單鏈抗體的重組表達及純化
[0066]根據實施例2中測序結果，分別將雜交瘤細胞株M24及M03抗體重鏈及輕鏈可變區 之間加入連接肽(GGGGS)3,引入六個組氨酸標簽SEQ ID N0:17,并將其全基因融合組氨酸 標簽按照畢赤酵母表達系統的偏愛性進行密碼子優化的方法，進行單鏈抗體的重組表達。 所表達得到的抗體分別命名為抗體P24及抗體P03,其結構組成如附圖2所示。上述單鏈抗體 的重組表達具體如下：
[0067] a)融合蛋白基因的表達質粒構建
[0068] 密碼子優化后的抗體P24的核苷酸序列如SEQ ID N0:18所示、氨基酸序列如SEQ ID N0:19所示;密碼子優化后的抗體P03的核苷酸序列如SEQ ID N0: 20所示、氨基酸序列如 SEQ ID勵:21所示。分別將優化后的抗體?24及?03全基因合成的片段上游引入?？102<^載 體中Xhol酶切位點，下游引入Xbal酶切位點，構建到pUC57質粒中，得到一種長期保存質粒， 質粒記為PUC57-P24及pUC57-P03(由南京金斯瑞科技有限公司提供）。進行PCR擴增，其中上 游引物P1為：5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'；下游引物P2為:5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'。常規PCR程序后，瓊脂糖凝膠電泳分析(附圖3-a，圖3-b)，顯示兩種產物大小與預期 大小（800bp、780bp)-致。將PCR獲得基因產物回收純化后，采用XhoI(#R0146S，購自New England Biolabs公司）和XbaI(#R0145V,購自New England Biolabs公司）雙酶切，用T4連 接酶連接到pPICZaA(V19520,購自Invitrogen)質粒中，轉化到DH5a感受態細胞中，在含有 Zeocin(R250_01，購自Invitrogen公司）的LB平板中37°C培養過夜。第二天篩選陽性克隆菌 測序，比對，與預期序列完全一致，即得到單鏈抗體P24及P03的表達質粒，分別記為pPICZa-P24及pPICZa-P〇3。
[0069] b)單鏈抗體基因在畢赤酵母宿主工程菌株的構建、篩選及表達
[0070] YPDS固體培養基配制：參照Invitrogen公司EasySelect Pichia Expression Kit 說明書;畢赤酵母感受態細胞制備:參照EasySelect Pichia Expression Kit說明書;BMGY 培養基配制：參照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit說明書；BMMY培養 基配制：參照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit說明書。
[0071] 將pPICZa-P24及pPICZa-P〇3質粒，用SacI限制性內切酶酶切線性化。乙醇沉淀后 將線性化載體，分別電轉化進入到X-33感受態酵母細胞，分別涂布到含有Zeocin的YPDS固 體培養基，30 °C培養3-5天，就有陽性克隆產生。
[0072] 挑取上述獲得的單克隆于5mL BMGY培養基中，30°C培養至0D6Q() = 2.0~6.0時，取 lmL保存菌種，并將剩余菌液重懸后轉移至IjBMMY中小量誘導表達，每隔24h補加甲醇至終濃 度為1 % (v/v)。一周后，離心收集菌液上清，通過SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，觀察目標蛋白表 達情況(附圖4-a，圖4-b)。
[0073] 將上述獲得的P24及P03重組基因工程菌株分別接種于500mL BMGY培養基中，30 °C，220rpm培養至菌體密度到0D6QQ = 2.0~6.0，每隔24小時補加甲醇至終濃度為1.0 % (v/ v)。一周后，收集發酵培養液。
[0074] c)單鏈抗體純化
[0075]采用組氨酸標簽親和柱純化抗體P24及P03單鏈抗體，預裝柱子選擇為HisTrap HP，具體步驟如下：
[0076] 步驟一、發酵液的除雜預處理:將上述表達得到抗體P24及P03融合蛋白發酵液上 清，離心收集上清，并加入結合緩沖液，使得上清終濃度為300mM NaCl，20mM NaH2P〇4,10mM Imidazole，調pH7 · 5，0· 45μηι 濾膜過濾。
[0077] 步驟二、HisTrap HP親和柱純化:運用全自動智能蛋白純化系統(AKTA avantl50， 購自GE healcare公司）對預處理獲得的抗體P24及P03融合蛋白發酵液進行親和純化，柱子 為 HisTrap HP(17-5248-02,購自 GE healcare 公司）。結合緩沖液為 300mM NaCl，20mM NaH2P〇4，10mM Imidazole，pH7.5,洗脫緩沖液為300mM NaCl，20mM NaH2P〇4,500mM Imidazole，pH7.5。洗脫時進行線性洗脫，并收集各個洗脫峰。通過SDS-PAGE電泳鑒定純度， 由附圖5-a和圖5-b可知，兩種純化后的蛋白純度均達到95 %以上，更換緩沖液為PBS溶液并 超濾濃縮(lmg/ml)，過濾除菌于-20°C保存備用。
[0078] 本領域技術人員知曉，重組蛋白可以不帶標簽，也可帶其他標簽，也可加入其他形 式的連接肽。無論是否帶標簽或者帶不同形式的標簽都可采用Capto L純化。
[0079] 實施例4.抗體的性能評價
[0080] 1、抗體P24及P03的Western blot鑒定
[0081] a.聚丙烯酰胺凝膠電泳:分別配置12%非變性聚丙烯酰胺凝膠和SDS-聚丙烯酰胺 凝膠;分別上樣標準蛋白質及天然CRP蛋白（購買于HyTest公司），恒壓下電泳1小時；
[0082] b.轉膜:恒流(35mA/膜)條件下轉膜1小時，將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質分別轉 移至硝酸纖維素膜上。考馬斯亮藍G250對完成轉膜的聚丙烯酰胺凝膠進行染色，觀察蛋白 的殘留情況；
[0083] c.封閉：含5%脫脂奶的TBST緩沖液封閉（封閉液），4°C過夜;封閉后洗滌液(TBST， 詳見TaKaRa公司TBST buffer)洗滌一次，10分鐘；
[0084] d.抗原抗體反應：封閉液稀釋（按1: 400體積比）辣根過氧化物酶標記P24(P24-HRP，lmg/mL，本公司采用經典過碘酸鈉法標記，下同）及辣根過氧化物酶標記P03(P03-HRP， lmg/mL，本公司采用經典過碘酸鈉法標記，下同），分別加入上述硝酸纖維素膜中，室溫反應 1小時;TBST洗滌5次，每次10分鐘；
[0085] e.顯色及拍照：吸干硝酸纖維素膜上殘留液體，每張硝酸纖維素膜分別加入2mL穩 定型過氧化物酶溶液（lmL)與魯米諾/增強劑溶液（lmL)的混合液(購買于Thermo公司），均 勻潤濕硝酸纖維素膜的表面，室溫避光反應一分鐘后于凝膠成像系統（購買于GE公司）拍 照，留取結果。
[0086]實驗結果表明，本發明兩種抗體均可與變性及非變性血液提取的天然CRP反應，證 明了本發明兩種抗體與天然CRP的結合力。
[0087] 2、單鏈抗體P24及P03在時間分辨熒光檢測平臺的評價
[0088] 用0.05mol/L pH7.2的roS將P24抗體稀釋至lmg/ml，劃線于硝酸纖維素膜上；用 0.05mol/L pH8.0的硼酸緩沖液將時間分辨熒光微球標記的P03抗體稀釋10倍，噴涂于結合 墊上；按附圖6所示貼膜、切條、裝卡(具體制備參見實施例5)。將檢測卡分別檢測濃度含量 為400、200ng/ml的天然CRP蛋白（購買于HyTest公司）和0.05mol/L pH7.2的PBS，檢測結果 如下：
[0090] 由上述結果可知，P24、P03組成的雙抗體夾心檢測系統可應用于時間分辨熒光檢 測平臺，能夠檢測一定濃度的天然CRP蛋白。
[0091] 實施例5. C-反應蛋白的時間分辨熒光免疫檢測卡的制備 [0092]本檢測方法采用雙抗體夾心免疫層析法的原理。
[0093] 1、溶液配制
[0094] 0.05mol/L ρΗ8·0的硼酸緩沖液制備：取0.1mol/L的H3B〇3 70ml，用0.025mol/L的 Na2B4〇7 · 10H20調節pH至8.0,并定容至100ml，置于4°C備用，有效期3個月。
[0095] 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，購自SIGMA公司）溶液制備： 1.5gEDC加入100ml去離子水，配成水溶液置于4°C備用，有效期3個月。
[0096] 封閉液的制備:含10 % BSA (所述百分比均為質量體積比），0.05mo 1 /L pH8.0的硼 酸緩沖液，用〇. 22um濾膜過濾，置于4°C備用，有效期7天。
[0097] 熒光抗體稀釋液制備:含1 %BSA，10%海藻糖，0·025%吐溫-20，0·05mol/L pH8·0 的硼酸緩沖液，用〇. 22U膜過濾，置于4°C備用，有效期7天。
[0098] 包被抗體稀釋液制備：含3 %甲醇，0 · 025 %吐溫-20，0 · 05mol/L pH7 · 2的PBS，用 0.22U膜過濾，置于4°C備用，有效期7天。
[0099] 樣本稀釋液:含0 · 5 % BSA，0 · 025 % 吐溫-20，0 · 05 % 安替比林，0 · 05 % procl in300， 0.05mol/L pH8.0的硼酸緩沖液，2-28°C保存有效期1年。
[0100] 2、c-反應蛋白熒光檢測卡制備
[0101] 1)時間分辨焚光微球標記
[0102] P03抗體標記方法如下（以500ul反應體系為例）：加400ul硼酸緩沖溶液于2ml離心 管中，加入l〇〇ul濃度1%粒徑200nm的空載焚光微球(購自Thermo公司），漩禍振蕩混勾。再 加入lOulEDC溶液，室溫振蕩15min。14000rpm 10°C離心10min，去上清，沉淀用0.5ml硼酸緩 沖液溶解，超聲分散，功率100W，時間lmin(超聲3s間隔3s)。
[0103] 活化后的微球中加入濃度lmg/ml的P03抗體75ul，250r/min25°C恒溫震蕩反應2h; 加入58ul封閉液，恒溫震蕩反應4h。14000rpm 10 °C離心15min，洗滌2次，去上清，沉淀用 〇.5ml硼酸緩沖液溶解，最后一次離心后沉淀用熒光抗體稀釋液溶解并超聲分散，置于4°C 恒溫保存。
[0104] 2)熒光結合墊的噴涂
[0105] P03抗體熒光結合墊6噴點方法如下：用熒光抗體稀釋液將上述制備的P03熒光抗 體稀釋10倍，噴涂于整條結合墊(長300mm，寬12mm的玻璃纖維)上。
[0106] 3)硝酸纖維素膜的包被
[0107] 硝酸纖維素膜包被方法如下：取0.5ml濃度4mg/ml的P24抗體，加到5ml刻度離心管 中，加包被抗體稀釋液至lml，包被于硝酸纖維素膜2的T線5位置。取0.5ml濃度為4mg/ml抗 HIS抗體，加到離心管中，加包被抗體稀釋液至lml，包被于硝酸纖維素膜2的C線4位置。
[0108] 4)貼膜、切條、裝卡
[0109] 樣品墊1、熒光結合墊6、包被有P24抗體的硝酸纖維素膜(反應膜)2、將吸水墊3從 左至右依次設置，且兩兩之間少許接觸，所述硝酸纖維素膜的T線5在左、C線4在右(如附圖6 所示），并根據卡殼大小進行切割，裝入卡殼，完成檢測卡制備。
[0110] 5)試劑盒組裝
[0111] 取鋁箱袋和干燥劑;打開熱封機，預熱;將檢測卡、干燥劑裝入鋁箱袋中；用熱封機 封好鋁箱袋;貼上標簽。
[0112] 3、c-反應蛋白熒光檢測卡的使用方法
[0113] 1)稀釋待測樣本:在潔凈的離心管加入lmL樣本稀釋液，再精確吸取10yL血清/血 漿樣本，加入到離心管中，振蕩充分混勻。
[0114] 2)加樣及判讀：用移液槍吸取50yL稀釋后的樣本慢慢加入加樣孔中，開始計時，10 ~15分鐘內用熒光免疫層析儀定量判定結果。超過15分鐘判定，結果無效。
[0115] 4、C_反應蛋白熒光檢測卡檢測效果評估
[0116] 1)精密性:將P24(包被)-P03(標記)檢測卡按檢測卡使用方法檢測l、10、50mg/l的 CRP參考品（購于hytest)各25次重復測定，剔除離群值后計算檢測卡精密度。實驗結果顯示 三個濃度檢測結果變異系數CV〈15%。
[0118] 2)檢測范圍：將P24(包被)-P03(標記)檢測卡檢測不同濃度的CRP天然蛋白（購于 hytest)0.5、l、2、4、8、16、32、64、128mg/l，擬合曲線及檢測范圍為 0.5-120mg/L(如附圖7)。
[0119] 3)線性范圍：將高值樣本與樣本稀釋液按照一定比例配制成5個系列濃度樣本 (0.5、1、10、50、100mg/ml)，用P24(包被)-P03(標記)檢測卡檢測，每個樣本檢測3次，將結果 與理論濃度進行回歸統計，判斷在該濃度范圍內是否成線性。線性范圍為0.5-100mg/L(如 附圖8)。靈敏度是0.5mg/L
[0120] 4)準確度一回收率:將P24(包被)_P03(標記）的檢測卡檢測添加量分別為1、10、 50mg/l的天然CRP蛋白，檢測結果如下表。
[0122] 5、準確度一方法學比對：
[0123] 上述結果顯示P24(包被)_P03(標記）的CRP檢測卡性能較優，選擇同類產品中目前 市場上獲得良好信譽的廣州萬孚生物技術股份有限公司全程C-反應蛋白（hsCRP+常規CRP) 定量檢測試劑盒(免疫層析法)作對照產品比對驗證。選擇20份臨床病人標本，按1到20的順 序編號，用對照產品和待評價的P24(包被)-P03(標記）的CRP熒光檢測卡同時進行實驗，按 照1，2，3......18，19，20，20，19，18......3，2，1的樣本順序進行測定。對照和待評價產品 的檢測結果相關系數R2 = 〇.98,說明兩種方法檢測結果有較好的相關性(如附圖9)。
[0124] 6、配方篩選：
[0125] 除上述最優制備例1外，
【申請人】還嘗試多種制備方案，例如下面5組檢測卡制備及 應用結果如下表：
【主權項】
1. 抗人C-反應蛋白抗體，包括： 重鏈可變區含有以下的互補決定區：氨基酸序列如序列SEQ ID NO: 1所示的HCDRUn 序列SEQIDN0:2所示的HCDR2和/或如序列SEQIDN0:3所示的HCDR3 ; 以及輕鏈可變區序列含有以下的互補決定區：氨基酸序列如序列SEQ ID N0:4所示的 LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID N0:6所示的LCDR3。2. 權利要求1所述的抗人C-反應蛋白抗體，其特征是重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。3. 權利要求1所述的抗人C-反應蛋白抗體，其特征是氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示。4. 編碼權利要求3所述抗體的核苷酸序列，如SEQ ID NO: 18所示。5. 含有權利要求4所述核苷酸序列的表達載體。6. 含有權利要求5所述表達載體的重組宿主細胞。7. 生產權利要求3所述抗體的方法，包括： 1) 在合適的條件下培養權利要求6所述重組宿主細胞表達抗體； 2) 然后從宿主細胞中純化、收集抗體。8. 權利要求1-3任一項抗人C-反應蛋白抗體在檢測人C-反應蛋白含量中的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK105949309SQ201610225905
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月12日
【發明人】馬永, 趙利利, 楊蕓, 王安良, 范宇
【申請人】江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司