一株新型RSV病毒及其應用的制作方法

本發明涉及一株新型RSV病毒及其應用。
背景技術：
：呼吸道合胞病毒（RSV）是副粘病毒科、肺炎病毒亞科、肺病毒屬的病原性病毒。RSV廣泛在世界各地廣泛流行，是引起嬰幼兒、老年人和免疫力低下人群下呼吸道感染最常見的病原微生物之一。RSV為非節段性的負鏈RNA病毒，基因組可編碼11個蛋白。RNA基因組與病毒N蛋白緊密關聯形成包裹在病毒包膜內的核衣殼，病毒粒子直徑為150-300nm。RSV主要感染鼻腔以及肺部大、小氣道的上皮細胞，也可能感染肺泡巨噬細胞和肺部其他類型的細胞，可引起細胞融合在一起形成合胞體。在RSV外膜具有G、F、SH等跨膜糖蛋白，共同參與病毒外膜與宿主細胞膜的融合以及細胞培養過程中合胞體的形成，其中G、F為兩個重要的膜蛋白成分。G蛋白與病毒和細胞的黏附有關，并且G蛋白在亞型間及亞型內變異極大，是RSV逃逸機體免疫攻擊的重要手段。根據G糖蛋白的抗原性的不同可將RSV病毒分為A和B兩個亞型。F蛋白與病毒進入細胞并形成特征性的合胞體有關，還具有促使RSV在感染細胞間傳播及溶血的作用。F和G蛋白是激發機體產生保護性抗體最主要的病毒抗原。但G蛋白具有較高的亞型特異性及變異性，故不宜制成疫苗，與之相比F蛋白的抗原性比較穩定，較少變異，并且F蛋白是誘導機體產生免疫保護的主要蛋白，它誘導產生的抗體能保護機體免受RSVA、B兩亞型病毒的侵襲，而G蛋白抗體僅對同亞型病毒提供保護，所以F蛋白更有研究價值。在對臨床RSV感染患者所感染的RSV病毒進行分離、分析后發現，中國國內患者感染的RSV病毒與國際流行株RSVA2有所不同。特別是病毒表面的F蛋白有較大差異。人們已經研制出多種形式的RSV疫苗，如福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)、亞單位疫苗和減毒疫苗、冷適應株疫苗、病毒載體疫苗、DNA疫苗等，但至今尚無可用于預防RSV感染的疫苗問世。其中福爾馬林滅活疫苗在20世紀60年代就已經研制出，但在當時人體接種后自然感染RSV時出現病情加重的意外情況。而RSV感染的廣泛性使研發RSV疫苗尤為重要。如何構建得到高免疫原性F蛋白的RSV病毒是開發出高效RSV疫苗的關鍵。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種新型的RSV病毒及其應用。本發明所采取的技術方案是：一株新型的RSV病毒，其全基因組長15180bp，其序列如SEQIDNO：1所示。上述RSV病毒在制備RSV疫苗中的應用。RSV疫苗為全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗、減毒活疫苗、VLP、基因工程疫苗、DNA疫苗。上述RSV病毒在制備進行體外預防性疫苗、治療性疫苗及治療性藥物藥效評價試劑中的應用。一種RSV抗原，其為上述RSV病毒F蛋白中的一段或全部，且至少包括一個特異性F蛋白氨基酸位點。RSV抗原的序列含有103A、276S中的至少一個。特別的，RSV抗原的序列為其F蛋白。本發明的有益效果是：本發明在中國分離的RSVA13病毒株序列的基礎上獲得的基因工程疫苗具有良好的免疫原性，其中BR4F蛋白可以誘導更高水平的抗體免疫反應，對小鼠肺部RSVA2和A13病毒株均具有極好的清除率。附圖說明圖1本發明中RSVA13病毒在HEP-2細胞上的擴增示意圖；圖2BR1、BR2、BR3和BR4F蛋白SDS-PAGE和WB分析圖；圖3BR1、BR2、BR3和BR4F蛋白抗鼠血清中和RSVA2/A13中和抗體分析圖：A：中和RSVA2；B：中和RSVA13；圖4小鼠肺組織RSVA2/A13病毒清除率分析圖：A：清除RSVA2；B：清除RSVA13。具體實施方式下面結合實施例，進一步說明本發明的技術方案。主要材料病毒：RSVA2；細胞：昆蟲細胞Sf9。主要試劑病毒RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒（OMEGA）；KODFX（TOYOBO）；Bac重組桿狀質粒提取試劑盒（Omiga生物）；卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal、IPTG（北京鼎國）；1640培養基（Gibco)；胎牛血清（Gibco)；CellfectinⅡ脂質體（Sigma）；Palivizumab單抗；HRP羊抗人二抗（Invitrogen）。HEP-2細胞培養從液氮中取出一支凍存的細胞，37℃溫水中迅速融化后，將細胞懸液接種轉入75cm2的培養瓶中，逐步滴加培養基(含10％胎牛血清)的1640培養基至20ml，37℃，5％的CO2培養箱中培養。培養48～72h后，棄去培養液，使用D-Hanks洗三遍。用0.25%的胰酶消化細胞后加入上述1640培養基，以1:4～1:5分種率傳代細胞，直到獲得種毒所需的足量細胞。呼吸道合胞病毒RSV的分離、培養和全基因組測序將HEP-2細胞消化后，在24孔板中每孔按照1.0～2.0×105個/ml的密度加入1ml，37℃，5％的CO2培養箱中培養48h。從醫院拿回鼻咽腔內分泌物等臨床樣品，5000rpm離心15min；離心后的上清液接種于24孔板中，每個孔0.5ml，放置于37℃吸附75～120min；然后加入含2％胎牛血清的1640培養基0.5ml，在37℃，5％的CO2培養箱中培養2～4天；連續盲傳3代，第4代出現病變的樣品繼續傳代，未出現病變的舍棄，篩選出一株出現合胞體現象并且增殖、病變速度最快的RSV毒株。取200μl獲得的RSV病毒，利用OMEGA公司的病毒RNA提取試劑盒提取其基因組RNA。然后再以此RNA為模板配制逆轉錄體系，在1.5mlNuclease-Free離心管中加入下列成分配制成混合液：32μlRNA，2μl50μM的Random6mers，2μl10mM的dNTPmix，總體積為36μl；混勻后在65℃孵育5min，取出于冰上冷卻2min；加入14μlcDNA合成混合液（10μl的5×RTBuffer、2μl的M-MLVReveraseTranscriptase和2μl的RnaseInhibitor），總體積為50μl，即為PCR擴增模板。設計15對不同引物再進行PCR擴增，反應體系：5μlRSV病毒cDNA，25μl2×PCRBuffer，1μlKODFX，10μldNTPs，1.5μl正向引物1，1.5μl反向引物2，6μlddH2O，50μl總體積；反應程序：94℃，3min；（98℃，10s；57℃，30s；68℃，2～3min），30cycles；68℃，10min。PCR產物送華大基因測序后，利用DNAstar軟件進行拼接，結果顯示病毒mRNA長15180bp，其基因序列如SEQIDNO：1所示，經分析該病毒株蛋白的氨基酸序列如下所示：編碼核酸區域編碼蛋白編碼核酸區域編碼蛋白99-518NS14678-5571G628-1002NS25651-7375F1140-2315N7593-8177M2-12347-3072P8152-8418M2-23255-4025M8485-14982L4293-4487SH將拼接的全長序列在NCBI中BLAST比對，可以看出該病毒是A型RSV病毒，并將該序列與NCBI中的序列RSVA2（GenBank登錄號KT992094.1）進行比對，比對結果顯示序列具有較高的相似度，分離的RSV病毒主要抗原F蛋白特有的氨基酸位點和氨基酸名稱如下表所示，其中F蛋白276位點與A2株該位點不同（Palivizumab來源A2，該位點位于Palivizumab抗原位點II區域內，氨基酸位點為N），該病毒命名為RSVA13。新型RSVF蛋白特有的氨基酸位點和氨基酸名稱表氨基酸位點氨基酸名稱氨基酸縮寫氨基酸位點氨基酸名稱氨基酸縮寫4脯氨酸P105絲氨酸S9蘇氨酸T122蘇氨酸T16丙氨酸A124天冬酰胺N20亮氨酸L152異亮氨酸I25絲氨酸S276絲氨酸S66谷氨酸E384異亮氨酸I101蘇氨酸T540丙氨酸A103丙氨酸A基于上述測序結果，本領域技術人員可以使用已知的RSV病毒，合成基因組全序列或者構建cDNA克隆，克隆質粒，體外轉染和包裝病毒的方法，構建得到本發明所述的新型RSVA13病毒株。病毒(RSVA13株)擴增、滴度測定和保藏將HEP-2細胞傳代到5瓶75cm2的培養瓶中，當細胞密度達到90%以上時，吸棄培養液上清，接種0.5ml實施例2中分離的RSV-A13病毒和3.5ml不含血清的1640培養基，37℃恒溫培養，每隔15min搖晃一次，2h后補加16ml含10％胎牛血清的1640培養基。當細胞出現典型病變或細胞剝離量超過70%時，即可對培養物進行收獲，如圖1所示。將剩余貼壁的細胞全部吹下，使細胞或細胞碎片均勻懸浮，共100ml；以500μl/管分裝至無菌螺蓋離心管中，貼好標簽，立即投入液氮中進行急凍；5-15min后從液氮中取出，放入-80℃長期保存。利用蝕斑法測定上述擴增的RSVA13病毒滴度，細胞消化后6孔板每孔加入3ml2.5×105個/ml的細胞懸液，在37℃，5%的CO2培養箱中培養。待細胞鋪滿培養孔后開始進行感染。用EP管將病毒稀釋至所需的濃度，例如10-4～10-7；吸棄六孔板里的培養液，用D-Hanks液洗一遍后加入稀釋好的病毒液0.2mL/孔，并設置復孔；輕輕振蕩使其均勻分散在培養孔中，然后放置在CO2培養箱中，孵育75min，間隔15min輕搖一次；75min后，加入1%的甲基纖維素覆蓋培養基，每孔4ml；放置于CO2培養箱中6天，結晶紫染板，統計出斑情況并計算病毒滴度；病毒滴度計算公式為：蝕斑形成單位（PFU/ml）=（平均蝕斑數×病毒稀釋度）/每孔接種病毒量取對數計算LogPFU，得到RSVA13病毒滴度。疫苗的制備可以按常規方法進行，方便比較起見，下面提供一種疫苗的制備工藝。當然，本領域技術人員也可以使用其他方法制備得到相應的RSV疫苗。RSVF蛋白基因工程亞單位疫苗制備1)將RSV中國流行株（包括RSVA13）與A2株的F蛋白進行序列比對，發現有兩處普遍存在的差異，差異位點為：T103A和N276S，并且其中一個位點在Palivizumab單抗作用的抗原位點II區域內，據此，針對A2株的F蛋白疫苗進行改造，設計出針對中國流行株的F蛋白疫苗，運用現有方法，如CN106119287A公開的方法構建4個針對F蛋白的穿梭載體，分別命名為Rp1、Rp2、Rp3和Rp4，其中Rp1根據RSVA2構建的載體，表達的目的蛋白為RSVA2的F蛋白，其余三個穿梭載體中的目的基因表達的目的蛋白與Rp1表達的目的蛋白有如下差異：Rp2，T103A（即F蛋白序列103位的T替換為A，下同）；Rp3，N276S；Rp4，T103A、N276S；2)將Rp1、Rp2、Rp3和Rp4三個質粒分別轉化到本實驗室制備的DH10multiBac感受態中進行重組，篩選陽性菌落，搖菌提取桿粒；3)將上一步所獲得的桿粒轉染到Sf9細胞中獲得相應的第一代重組桿狀病毒分別命名為：BR1-V1、BR2-V1、BR3-V1和BR4-V1。以MOI=0.1感染Sf9懸浮細胞對各病毒進行擴增，獲得的第三代病毒分別為：BR1-V3、BR2-V3、BR3-V3和BR4-V3；4)將上述制得的第三代病毒以MOI=1感染Sf9懸浮細胞，以SF900-Ⅱ為懸浮培養基，接毒后在恒溫搖床上27℃，95rpm培養96h，5000rpm離心30min收集細胞沉淀于-80℃保存；5)將收獲的細胞樣品按照10ml/g的比例加入裂解液（pH8.0，25mMTris-Cl，50mMNaCl，0.1%TergitolNP9，2mg/mlLeupeptin）重懸，冰上震蕩搖晃2h，高速離心后依次使用強陰離子柱EMDTMAE，外源凝集素親和介質GST-Sepharose4B和強陽離子EMDSO3純化即可獲得目的蛋白（RSVF蛋白或改造后的F蛋白）。RSVF蛋白SDS-PAGE和Westernblot分析分別取100μl純化的BR1、BR2、BR3和BR4F蛋白，分別加入SDS-PAGELoadingBuffer后煮沸用于SDS-PAGE和Westernblot分析。四個樣品點樣在一塊膠上，兩個拷貝，其中一塊SDS-PAGE電泳后直接考馬斯亮藍染色和脫色液脫色。另一塊進行Westernblot分析，檢測時一抗使用人源化Palivizumab單抗；二抗使用HRP標記抗人多克隆抗體，SDS-PAGE和Westernblot分析結果如圖2所示，BR1、BR2、BR3、BR4四個F蛋白都沒發現明顯的差異。四個F蛋白對應的F0、F1、F2蛋白在同一水平位置且四個F蛋白純度相近。同時利用Bradford法測定四個F蛋白的蛋白濃度。RSVF蛋白基因工程亞單位疫苗免疫原性分析將純化獲得的BR1、BR2、BR3和BR4F蛋白分別稀釋到適合濃度，分別加入1/10體積的Al(OH)3佐劑（1000mg/ml）。利用加入佐劑后的RSVF蛋白按照1μg、5μg、25μg的劑量對BALB/c小鼠進行腹腔注射免疫。第0、21天分別免疫一次，于第28天進行眼后框采血，收集血清，-80℃分裝保存。并在第29天進行攻毒試驗。攻毒時每個劑量組又分為三個組別，分別滴鼻106PFURSVA2、RSVA13或PBS，并在攻毒后第4天，斷頸處死小鼠，無菌條件下取左肺和右肺置于無菌的收集管中，并加入1ml預冷的1640培養基（2%FBS，雙抗），保存于-80℃。抗鼠血清和肺組織標本采集后進行下列處理后和檢測：抗鼠血清中和抗體滴度檢測取各組小鼠血清樣品，56℃滅活30min，用無血清的RPMI-1640培養基成倍比稀釋，并分別將RSVA2和RSVA13用無血清的1640培養基稀釋到100PFU/100μl。稀釋后的病毒液、樣品各取100μl，混合均勻，在37℃細胞培養箱放置2小時。吸棄Hep-2細胞培養上清，取200μl混合液加入到6孔板Hep-2細胞中，加入陰性對照，放入37℃繼續培養2h。每孔加入4ml1%的甲基纖維素覆蓋培養基，放置于CO2培養箱中5天，棄培養基，結晶紫染色，統計出斑情況，能使空斑數減少50%的血清稀釋度判定為血清的中和抗體滴度，計算各個血清樣品分別中和的RSVA2和RSVA13的中和抗體滴度。實驗結果如圖3A所示，本發明制備的BR1、BR2、BR3和BR4F蛋白1μg、5μg和25μg抗鼠血清中和RSVA2都可以誘導1:256左右的中和效價，免疫劑量達到1μg以后，中和效價沒有明顯變化，說明當免疫劑量達到1μg時，引起的體液免疫已經達到飽和；抗鼠血清中和RSVA13也都可以誘導1:256以上的中和效價（圖3B），其中BR4F蛋白誘導的中和效價明顯高于BR1、BR2和BR3F蛋白，差異極顯著。肺組織病毒滴度檢測于-80℃取出肺組織，無菌勻漿制備肺組織懸液，4℃，10000g離心5min，保留上清液。取100μl參照實施例3-蝕斑法進行病毒滴度測定，并計算肺組織病毒清除率。肺組織病毒清除率計算公式為：病毒清除率=（PBS對照組肺病毒滴度-樣品組肺組織病毒滴度）/PBS對照組肺病毒滴度×100%。實驗結果如圖4（A：清除RSVA2；B：清除RSVA13）所示，針對RSVA2和RSVA13，BR1、BR2、BR3和BR4F蛋白組別的清除率都達到80%以上，其中BR4F蛋白三個免疫劑量對RSVA13清除率達到100%。綜合F蛋白抗血清中和抗體效價和肺部病毒清除率結果說明，本發明在中國分離的RSVA13病毒株序列的基礎上獲得的基因工程疫苗BR2、BR3和BR4F蛋白具有良好的免疫原性，其中BR4F蛋白針對中國株RSVA13免疫原性更好。因此根據本發明RSVA13的病毒株序列，可構建出作為預防呼吸道合胞病毒感染相關疾病的疫苗。SEQUENCELISTING<110>廣東華南聯合疫苗開發院有限公司<120>一株新型RSV病毒及其應用<130>RSV-A13<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>15180<212>DNA<213>RSV<400>1acgcgaaaaaatgcgtacaacaaacttgcgtaaaccaaaaaaatggggcaaataagaatt60tgataagtaccacttaaatttaactcctttggttagagatgggcagcaactcattgagta120tgataaaagttagattgcaaaatctgtttgacaatgatgaagtagcattgttaaaaatga180catgctatactgacaaattaatacagttaactaatgctttggctaaggcagttatacata240caatcaaattgaatggcattgtatttgtgcatgttattacaagtagtgatatttgcccta300ataataatattgtagtgaaatccaatttcacaacaatgccagtattacaaaatggaggtt360atatatgggaaatgatggaattaacacactgctctcaacctaatggcctaatagatgaca420attgtgaaattaaattctccaaaaaactaagtgattcgacaatgaccaattatatgaatc480aattatctgaattacttggatttgacctcaatccataaatcataataaatatcaactagc540aaatcaatgtcactaacaccattagttaatataaaacttgacagaagataaaaatggggc600aaataaatcaattcagccgacccaaccatggacacaacacacaatgataccacaccacaa660agactgatgatcacagacatgagaccattatcacttgagactataataacatctctaacc720agagatatcataacacataaatttatatacttgataaatcatgaatgcatagtgagaaaa780cttgatgaaagacaggccacatttacatttctggtcaactatgaaatgaaactattgcac840aaagtgggaagcactaaatataaaaaatatactgaatacaacacaaaatatggcactttc900cctatgccaatatttatcaatcatgatgggttcttagaatgcattggcattaagcctacc960aagcacacacccataatatacaagtatgatctcaatccatgaatatcaaaacaagattca1020aacaatccgaaataacaactttatgcataatcacactccatagtccaaatggagcctgaa1080aattatagttatttaaaattaaggagagacataagatgaaagatggggcaaatacaaaaa1140tggctcttagcaaagtcaagttgaatgatacactcaacaaagatcaacttctatcatcca1200gcaaatataccatccaacggagcacaggagacagcattgacactcctaattatgatgtgc1260agaaacacattaataagttatgtggcatgttattaatcacagaagatgctaatcataaat1320tcactgggttaataggtatgttatatgctatgtctagattaggaagagaagacaccataa1380aaatactcaaagatgcgggatatcatgttaaggcaaatggagtggatgtaacaacacatc1440gtcaagacattaatgggaaagaaatgaaatttgaagtgttaacattagcaagcttaacaa1500ctgaaattcaaatcaacattgagatagaatctagaaaatcctacaaaaaaatgctaaaag1560aaatgggagaggtggcaccagaatacaggcatgactctcctgattgtgggatgataatat1620tatgtatagcagcattagtaataaccaaattagcagcaggagatagatcaggtcttacag1680ctgtgattaggagagctaataatgtcctaaaaaatgaaatgaaacgttataaaggtttat1740tacccaaggatatagccaacagcttctatgaagtgtttgaaaaatatcctcactttatag1800atgtttttgttcattttggtatagcacaatcttctaccagaggtggcagtagagttgaag1860ggatttttgcaggattgtttatgaatgcctatggtgcagggcaagtgatgttacggtggg1920gggtcttagcaaaatcagttaaaaacattatgttaggacacgctagtgtacaagcagaaa1980tggaacaagttgtggaggtgtatgagtatgctcagaaattgggtggagaagcaggattct2040accatatattgaacaacccaaaagcatcactattatctttgactcaatttcctcacttct2100ctagtgtagtattgggcaatgctgctggcctaggcataatgggagaatacagaggtacac2160caaggaatcaagatttatatgatgctgcaaaagcatatgctgaacaactcaaagaaaatg2220gtgtgattaactacagtgtattagacttgacagcagaagaactagaggctatcaaacatc2280agcttaatccaaaagataatgatgtagagctttgagttaataaaaaagtggggcaaataa2340atcatcatggaaaagtttgctcctgaattccatggggaagatgcaaacaacagagccacc2400aaattcctagaatcaataaagggcaaattcacatcacccaaagatcccaagaaaaaagat2460agtatcatatctgtcaactcaatagatatagaagtaaccaaagaaagccctataacatca2520aattcaaccattataaacccaataaatgagacagatgatactgtagggaacaagcccaat2580tatcaaagaaagcctctagtaagtttcaaagaagaccctatgccaagtgataatcctttt2640tcaaaactatacaaagaaaccatagaaacatttgataacaatgaagaagaatctagctat2700tcatatgaagaaataaatgatcagacaaacgataatataacagcaagattagataggatt2760gatgagaaattaagtgaaatactaggaatgcttcacacattagtagtagcgagtgcagga2820cctacatctgctcgggatggtataagagatgccatggttggtttaagagaagaaatgata2880gaaaaaatcagaactgaagcattaatgaccaatgacagactagaagctatggcaagactc2940aggaatgaagaaagtgaaaagatggcaaaagacacatcagatgaagtgtctctcaatcca3000acatcagagaaactgaacaacctgttggaagggaatgatagtgacaatgatctatcactt3060gaagatttctgattagctaccaaactgtacatcaaaacacaacaccaatagaaaaccaac3120aaacaaaccaactcacccatccaaccaaacatccatccgctgactagccaaccagccaaa3180aaacaaccagccaatccaaaactagccacccggaaaaaatcgacactatagttacaaaaa3240aagatggggcaaatatggaaacatacgtgaataa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