專利名稱：增強的病毒介導的dna轉移的制作方法
技術領域：
本發明涉及通過病毒提高細胞轉導效率的方法，具體地說，涉及用纖維結合素和/或纖維結合素片段來增強病毒介導的基因向細胞轉移的方法。
背景技術：
近來，隨著人們對許多人類疾病分子基礎的了解以及基因轉移技術的發展，人們開始嘗試建立對一些遺傳病的體基因療法(somatic genetherapy)方案。目前用基因療法有希望治愈的疾病有這樣一些在這些疾病中，一種酶或其他蛋白有缺陷或者丟失，而這些酶或蛋白的水平不需精確調節，尤其不需內在的精確調節，而且那些酶或蛋白的缺陷是在患者骨髓中可發現的。
例如，一種可用基因療法來治療的疾病是腺苷脫氨酶(ADA)缺乏癥。這種病會導致嚴重的并發免疫缺乏癥(SCID)。ADA缺乏的患者骨髓中有很少或沒有這種酶。然而，ADA缺乏已通過相配的骨髓移植得到治療。ADA正常的細胞對ADA缺乏的細胞有一種選擇優勢，并且會再生出病人的骨髓。
骨髓細胞之所以是體基因療法的好的目標，是因為骨髓組織易于體外操作并且包含可再生細胞。另外，人臍帶血中也包含大量的始祖細胞。把基因成功地轉入可長期再生的造血干細胞中，這些細胞的后代的存在使得多種疾病得以終身治愈。
一些研究者已在鼠中將基因轉移至可再生干細胞中并在可再生干細胞中長期表達。然而對于大型動物，如狗和靈長類，體內實驗還僅有極少的成功記錄。這很可能是由于初級造血干細胞的感染效率較低的緣故。當應用于人類時，現有的基因轉移技術的局限性就更加復雜了，這是由于以下因素的存在造成的成人骨髓(ABM)中干細胞較少；缺乏純化這些細胞的方法；并且這種原始細胞在細胞周期中所占的時間相對較少。
在鼠和大型動物的骨髓細胞實驗中，人們注意到，最成功的方案是把靶細胞與產生逆病毒的細胞系共同培養。另外，多數的FDA支持的基因轉移試驗依賴于重組的逆病毒載體來進行基因轉導。由于重組逆病毒載體轉移效率高并且可以精確而穩定地把外源DNA整合到細胞DNA中，所以它成為基因療法很合適的載體。這些載體中包含所要轉移的外源DNA，并經過進一步的修飾除去了病毒的病原性。由于這些修飾，病毒的產生就通過逆病毒包裝細胞而基本上完成了。然而，對于臨床基因療法，由于考慮到生物安全性和質量控制，不依賴細胞的轉導更為合適。不幸的是，如果不與產生病毒的細胞共同培養，一般很難把基因有效地轉移到造血細胞比如干細胞中。
最近，有人指出，在感染過程中，把靶細胞暴露于基質細胞中，基因轉移效率會被提高。基質細胞是造血微環境(HM)的一種主要成分。HM由一種有組織的網絡組成，主要包括巨噬細胞、基質細胞、內皮細胞、脂肪細胞和一類由多種特定粘附分子組成的復合胞外基質(ECM)。一些ECM分子，如laminin，膠原，thrombospondin，蛋白多糖，葡糖胺多糖和纖維結合素，為造血細胞和生長因子提供了錨定位點。基質使逆病毒感染效率提高的機制還不清楚，但一段時間以來，人們已經知道，當造血細胞與HM的細胞直接接觸時，會對這些造血細胞增殖和分化有生理調節作用。
要把基因有效地轉入可長期再生的造血干細胞及其他細胞之中還存在一些疑問，這就使基因轉移法在對造血病或其他病的治療方面受到了限制。人們需要一種方法，它可以有效地把遺傳物質轉入哺乳動物體內，并且不帶有過去方法所具有的危險性和局限性。本發明中的方法滿足了這些需求。
發明概述簡單地說，本發明的一個優選實施方案提供了一種通過逆病毒載體來提高造血細胞轉導頻率的方法。這種方法包括在可通過逆病毒來有效地提高細胞轉導頻率的純的纖維結合素和/或纖維結合素片段存在的條件下，用一種缺乏復制能力的重組逆病毒載體來感染活的造血細胞。這些纖維結合素和/或纖維結合素片段可以從天然材料中獲得，或通過合成而得到(例如，用重組或化學合成基因工程技術進行)，也可以通過天然與合成材料相結合而獲得。另外，應該明白，本發明中所用的纖維結合素多肽可能包括對天然纖維結合素氨基酸序列的一些突變，從而為本發明提供了對提高轉導效率有促進作用的具有粘附的功能多肽。
本發明的另一個優選實施方案提供了一種制備被轉導的造血細胞的方法。此方法包括用一種復制缺損型帶有外源DNA的重組逆病毒來感染活的造血細胞。此方法中要有足夠的固定化的纖維結合素或其片段或者它們的固定化混合物，從而能夠有效地通過逆病毒來提高細胞轉導頻率。
本發明的另一個優選實施方案提供了一種細胞移植的改進方法。這一方法包括從動物供體中獲得活的造血細胞；在固定化的纖維結合素和/或它的片段存在并可有效地提高轉導頻率的條件下，用重組的逆病毒載體感染造血細胞來制備被轉導的活的造血細胞；并且把這種被轉導的活的造血細胞作為細胞移植體導入到動物受試者體內。在一個優選方式中，這些被感染的細胞能被導入到自身供體中。
本發明的另一個優選實施方案提供了一種可獲得適合于細胞移植過程的被轉導的臍帶血細胞的方法。這種方法包括在存在可通過逆病毒提高造血細胞轉導頻率的有效固定化量的纖維結合素和/或纖維結合素片段的情況下，用復制缺損型重組逆病毒載體來感染臍帶血中的造血細胞。本發明還包括用這種方法獲得的從臍帶血中得到的活的被轉導細胞類群；以及把被轉導的細胞類群作為移植體導入動物體內的移植方法。
根據上述各實施方案中更特殊的方面，所用的纖維結合素或纖維結合素片段將包括提供了纖維結合素的肝素-II結合區逆病毒結合活性的第一氨基酸序列，也包括提供了纖維結合素的CS-1區細胞結合活性的第二氨基酸序列。把纖維結合素的這兩個結合區同時使用被證明可以非常明顯地通過逆病毒提高靶細胞的轉導效率。
本發明的另一個優選實施方案提供了一種制備通過逆病毒載體來提高指定靶細胞轉導效率的構建體的方法。本方法包括把靶細胞上結合的配體，與纖維結合素上提供了逆病毒結合活性的肝素II結合區序列的多肽共價偶聯的步驟。本發明還包括利用這些構建體通過逆病毒來增加指定靶細胞轉導效率的方法，以及用這些被轉導的細胞進行移植的過程。
本發明的另一個優選實施方案提供了一種定位多種病毒的方法。此方法包括，在足夠的固定化的纖維結合素或纖維結合素片段存在下，溫育含有該病毒的培養基，其中纖維結合素或纖維結合素片段中具有肝素II結合區域的病毒結合活性，可用來定位多種病毒。
本發明還有一個優選的實施方案，它提供了被轉導的活的造血細胞及含有基本上純的和/或固定化的纖維結合素或其片段的細胞培養物。同時還提供了逆病毒介導的DNA向細胞轉移的試劑盒。這將在后面進一步說明。
本發明的一個目的是提供利用逆病毒有效地感染哺乳動物細胞的方法。
本發明的另一個目的是提供利用逆病毒載體進行基因轉移的方法。
本發明的另一個目的是提供一些用于自體和/或異體細胞移植的改進的移植方法和細胞培養物。
本發明的這些及其他目的、優點、特性經過閱讀下面的說明書之后，對那些熟悉本領域的人來說將是非常明顯的。
圖1.給出了包括胰凝乳蛋白酶片段的纖維結合素分子的簡圖。
圖2.顯示了存在纖維結合素片段時TKNEO載體使人的始祖細胞被感染的效率。在以后的實施例1中將進一步描述。
圖3.比較了在纖維結合素片段存在時用TKNEO載體使各種人的造血始祖細胞被感染的效率。在以后的實施例1中將進一步描述。
圖4.比較了用不同方法轉導的骨髓細胞移植到小鼠體內之后，hADA的存在情況。(i)泳道2-4用的是共同培養法，(ii)泳道5-7是在固定化的纖維結合素片段存在時的上清感染，(iii)泳道8～10是用BSA進行的上清感染。這些將在以后的實施例7中詳細描述。hADA的對照實驗分別為泳道1和12，鼠類ADA的對照為泳道8。
圖5.表明結合在纖維結合素片段上的逆病毒，在以后的實施例8中將進一步描述。
圖6.表明結合在纖維結合素片段上的逆病毒的劑量依賴性，在以后的實施例8中將進一步描述。
圖7.給出了實施例9-11中所用的各種重組纖維結合素片段的簡圖。
圖8.顯示了逆病毒與各種纖維結合素片段包括一些重組片段結合的情況。在以后的實施例9中將進一步描述。
圖9.說明了肝素阻礙逆病毒與纖維結合素片段結合的情況。在以后的實施例9中將進一步描述。
圖10.顯示了鼠造血細胞在各種纖維結合素片段存在的條件下被逆病毒感染的效率。在后面的實施例10中進一步說明。
圖11.比較了用不同方法轉導的骨髓細胞移植到小鼠體內之后hADA的存在情況(i)共培養方法；(ii)用不同纖維結合素片段進行上清感染；(iii)用BSA進行上清感染。在以后的實施例11中將進一步描述。
優選實施方案的說明為了進一步加深對本發明原理的理解，這里對它的一些特定的實施方案作一定的解釋，并且用特定的語言來描述同一實施方案。不過還應理解，此發明的范圍是沒有限制的。如把這里所述原理的應用進行進一步的替換修飾，對于熟悉相關領域的人來說是很容易的。
正如前面所指出的，本發明提供了用病毒，如逆病毒，來提高活細胞轉導效率的方法。本發明還提供了用重組逆病毒載體把基因有效地轉移到活細胞中的方法，獲得被轉導的細胞的方法，以及得到的自體及其他細胞移植的方法和材料。
本發明的一個特征是發現了纖維結合素(FN)及包含FN CS-1細胞粘合區的纖維結合素片段可以明顯地提高逆病毒介導的基因向細胞轉移的效率。例如，特定的前體及初級造血干細胞或長期培養起始細胞(LIC-IC)，帶有一個纖維結合素受治療者，因而表現出與纖維結合素及其片段相結合的能力。有利的是，這種效率提高使得不再需要與產生病毒的細胞共同培養。本發明的另外一些特征強調的是，位于肝素II結合區中的纖維結合素的病毒結合區的發現。這種病毒結合區可在多種應用中用于定位病毒粒子。包括例如，用于把病毒釋放到靶細胞中的范圍很廣的構建體。
與本發明的一些優選實施方案相一致的重組病毒載體包含有外源DNA，并且是沒有病原性的，也就是復制缺陷型的。這些載體有效地轉移外源DNA，并且精確而穩定地把外源DNA整合到宿主細胞，如動物細胞，尤其是哺乳動物細胞的DNA中。例如，在本發明中，包含我們感興趣序列的基因中一段堿基的核苷酸序列，可以在適當的啟動子作用下被整合到重組的逆病毒載體中，這種啟動子通常是外源的、可以啟動該基因的啟動子。考慮到這一點，外源DNA可能包含天然或人工制備的DNA，也可能是從異源部分得到的異源DNA。這些DNA可能是天然的，也可能是化學合成的分子，它們已通過連接或本領域其他技術手段被連接起來。正象前面指出的，導入的核苷酸序列將處于啟動子的控制之下，并一般位于啟動子的下游。換一種說法，就是啟動子一般位于編碼序列的上游(即5’端)。由此可知，除了啟動子和轉錄起始密碼子之外，可能還有，也可能沒有其他調節因子(如增強子)來與它們配合，共同完成外源編碼序列的轉錄。另外，重組DNA中在引進編碼序列的下游還應優先地包括一個終止序列。
包含外源DNA的逆病毒載體提供了一個選擇性標記或其它可以利用的選擇優勢。例如，這些載體可以包含一個或多個可抗多種選擇試劑的基因。選擇試劑包括一些抗生素，如新霉素。本發明使用的代表性載體包括N2/Zip TKNEO載體(TKNEO)(效價在NIH 3T3細胞上為1×105G418rcfu/ml)，ZipPGK-hADA載體，和ZipPGK-mADA載體。這些載體Moritz等人以前已經報告過(1993)，醫學專家雜志178529。在TKNEO載體中，neo磷酸轉移酶序列通過皰疹單純胸腺嘧啶激酶啟動子而進行正向表達(相對于5’的長末端重復LTR)。這一載體包含具有新霉素抗性的選擇性標記基因，從而易于確定被轉導的細胞。在ZipPGK-hADA載體中，人的ADA(hADA)cDNA經過人磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子作用而在相對于5’LTR的正方向上被表達。它只包含一個可表達的基因序列，而沒有明顯的選擇性標記。ZipPGK-mADA(PGK-mADA)載體與ZipPGK-hADA載體基本相同，只是由鼠的ADA取代了人的ADA cDNA。對于熟悉本發明領域的人來說，這些和其他一些病毒載體及其制備技術將是很清楚的，并且本發明的應用也是容易被掌握的。
本發明中使用的病毒載體表現出與纖維結合素，包括人的纖維結合素上的肝素II結合區中一個氨基酸序列相結合的能力。下面將會講到，雖然本發明不受任何理論的限制，但是人們相信，通過病毒與細胞上相應的功能區相結合而同時定位病毒和靶細胞，會使由病毒介導的細胞轉導效率有所提高。考慮到這一點，病毒與肝素II結合區中氨基酸序列相結合的能力會使本發明得以有效地進行，這些可用實施例8和實施例9中描述的常規方法進行表征。一般地講，這些方法決定了病毒粒子與包含肝素II結合區的固定化多肽結合的程度，因此不會被從固定化的多肽基質中洗掉。簡單地，在一定程度上，包含病毒的上清可以培養在一個包含帶有纖維結合素的肝素結合區的固定化多肽的小孔中。然后用生理鹽水沖洗小孔，之后把此病毒的靶細胞培養在此小孔中，用來確定小孔中保留下來的感染活性。相對于初始病毒上清，感染活性或效價的減低得到評價并且與類似的對照實驗相比較(例如用BSA涂覆的小孔)，與對照孔相比，包含肝素II結合區的小孔保留了相當高的效價，證明了病毒很適合于本發明的要求，為了簡化這一篩選過程，病毒載體可以帶有一個選擇性的標記，這在前面已提到過。
本發明中使用的纖維結合素的片段可以是天然的或合成的，并且可以從天然材料中制備到較純的樣品，例如Ruoslahti等人(1981)已經描述過，生物化學雜志2567277；Patel和Lodish(1986)細胞生物學雜志102449；Bernardi等人(1987)細胞生物學雜志105489。考慮到這一點，相當純的纖維結合素或纖維結合素片段的存在可能意味著它們基本上不受與天然纖維結合素同時產生的其他蛋白的影響。本發明中所使用的基本上純的纖維結合素或纖維結合素片段也可以通過重組細胞產生。例如Taguchi等人在1993年3月30日發表的美國專利No.5,198,423號上就描述了這樣的方法，此專利已轉讓給日本東京的Takara Shuzo有限公司。值得注意的是，在這個’423號專利中描述了與下面實施例子中H-271，H-296，CH-271，CH-296和C-CS1相一致的重組片段，這個專利中還描述了得到這些片段的方法。下面實施例子中使用的C274片段可用美國專利No.5,102,988中描述的方法來獲得。這些片段或那些可以通過常規方法而得到的片段可以在日本工業科學技術發酵研究院中通過培養大腸桿菌獲得，如FERM P-10721(H-295)，FERM BP-2799(C-277通過蛋氨酸連接到H-296)和FERM BP-2264(H-271)，在美國專利No.5,198,423中也有所描述。另外，關于在這里使用的纖維結合素片段和這種片段起始材料的一些信息可以在Kimizuka等人的論文中找到J.Biochem.110，25，4936-4961(1986)，他們的論文報告了人的纖維結合素的肝素II結合區域的情況。同時，具有CS-1細胞粘附區和肝素II結合區的纖維結合素片段，被發現能有效地提高本工作中基因向造血細胞中的轉移效率，因此在本發明中被優選地使用。這類片段包括大約一種30kd或35kd的片段(30/35FN)和下面的實施例子中將要介紹的多種重組片段。這樣就可以明白，廣義地說，與纖維結合素相關的多肽或本發明中所用的多肽將提供一個具有FN的CS-1細胞結合區細胞結合活性的氨基酸序列，同時也能提供一個能與病毒結合的FN上肝素II結合區氨基酸序列。熟悉本領域的人將會認識到，這里所需的細胞和病毒的結合活性一方面可以由天然的這些FN區域的氨基酸序列提供，另一方面也可以由那些在序列上與天然序列有所不同，但很相似的，可以表現出細胞結合及病毒結合活性的片段來提供。這些相似的氨基酸序列與天然序列基本同源，并且可能包括那些被刪除、被取代、被修飾了部分氨基酸，但仍提供了細胞結合或病毒結合特性所需的氨基酸序列的序列。
考慮到這一點，有關的生物技術人員已進一步闡述了可用常規方法對主要功能區氨基酸的刪除、取代、增加或其他修飾。這樣，所得到的氨基酸序列可以通過常規篩選得到所需的細胞結合或病毒結合活性。例如，纖維結合素肝素II結合區的突變或修飾形式，就可以用上面一般性討論中所提到的方法篩選，更詳細的方法將在后面的實施例8和實施例9中討論，用病毒培養、洗滌、病毒效價分析來確定與對照相比保留下來的感染情況。按本文提供的精神，對工作于本領域的人來說，這些結合僅代表的是一些常規實驗。
細胞結合修飾或突變了的纖維結合素CS-1細胞結合區，或者結合其他細胞結合多肽，可能可以通過傳統的步驟進行分析。例如，自然352438-441頁中所描述的步驟即可用于此分析。簡單地說，把細胞結合多肽涂在塑料小碟上，把要分析的細胞類群涂布于其上，放置30分鐘至2小時，之后，把沒有與蛋白結合的細胞取出，計數，并且測試活性。與多肽結合的細胞通過胰蛋白酶或細胞解離緩沖液(如Gibco)作用而回收，計數并測試活性。在某些情況下，如對于造血集落形成細胞，這些細胞繼續培養12到14天直至證明這些細胞確實具有形成集落的特性。然后計算粘附細胞的比例并且與標準對照進行比較。標準對照可用涂于塑料碟上的牛血清白蛋白(BSA)。靶細胞基本上與所分析的多肽能夠結合，這說明這種多肽與細胞的結合是適合于本發明的，而且這種多肽還可以被結合于纖維結合素的逆病毒結合片段之上，以生成本發明的構建體來通過病毒載體有效地提高靶細胞的感染率。
依照本發明更特殊的一些方面，用于通過逆病毒來提高轉導效率這一過程中的病毒結合多肽將包括(i)與人纖維結合素肝素II結合區的Ala1690-Thr1960相對應的第一氨基酸序列，此序列如下(Seq.I.D.#1)Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr SerLeu Ser Ala Gln Thr Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg ValArg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu AlaPro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys TyrGlu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala GlnGly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg ValThr AsP Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr GluThr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr ProIle Gln Arg Thr Ile Sys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu GlnPro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn AsP Asn Ala ArgSer Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser AsnLeu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln ProPro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Sys Pro Gly Sev ProPro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr IleThr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu LysAsn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr；或者與上述序列充分相似而且具有與逆病毒結合能力的氨基酸序列；(ii)與人纖維結合素III CS結合區的一部分(CS-1細胞結合區)相對應的第二氨基酸序列，此序列如下(Seq.I.D.#2)Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His GlyPro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr；或者與上述序列充分相似而且具有造血細胞結合能力的氨基酸序列。造血細胞可以是始祖細胞和/或長期再生(干)細胞。
正如前面提到的，可以理解，所得氨基酸序列與天然序列充分相似而且表現出與病毒結合的能力(在肝素II結合區的情況)和與靶細胞結合能力(在CS-1區的情況)。在此情況下本發明應用中對天然序列進行修飾和誘變是完全可能的。
本發明的一個方面是提供了一種體基因療法，此療法包括體外細胞療法和隨后的靶細胞向宿主的移植，也就是把被轉導的靶細胞“移植”到宿主中。造血細胞或其他細胞可以從人體或其他哺乳動物中通過標準方法而獲得。例如，造血細胞可以從人的骨髓或外周血中或者胎兒的臍帶血中獲得。一旦得到，造血細胞就可以在干細胞和/或始祖細胞中用標準技術來處理，擴增。這樣造血細胞就可以培養了，例如可在組織培養皿上進行培養。可選地，在這一階段中非粘附性、低密度、單核的細胞可以在逆病毒感染之前被預刺激。這里使用的和本領域中所用的“預刺激”指的是在暴露于逆病毒之前把細胞暴露在生長刺激因子之中的過程。這種預刺激被證明對逆病毒介導的造血細胞轉導有促進作用。
在預刺激之后，收集細胞并把它們與纖維結合素或纖維結合素片段一起培養，這里的FN片段是可以提高逆病毒介導的細胞轉導效率的片段。優選地，細胞是與純的和/或不溶的如被固定化的纖維結合素或纖維結合素片段一起培養的。然后，可以用重組病毒感染這些細胞，此重組病毒包含有例如修復細胞中酶或其他蛋白缺乏或異常的基因。感染時存在足夠的纖維結合素或纖維結合素片段使得逆病毒介導的細胞轉移效率被有效地提高。之后產生的轉導造血細胞可內源地引入到動物細胞移植受治療者中。移植時優選受治療者是自體供體，當然也包括異體移植。后者，尤其是使用臍帶血細胞作移植體的情況將在后面討論。
本發明的方法可以用于基因標記或多種疾病的基因療法。這些疾病包括骨髓病，如癌癥，白血病，蛋白缺失或異常。還可用于修飾細胞的療法，從而提高對其他療法，如化學療法的耐受性，用本發明治療的代表性疾病包括ADA缺乏癥，如ADA缺乏SCID，幼兒急性骨髓白血病(AML)、神經分裂癥，和成人AML及淋巴白血癥。
本發明的一個特定的優選實施方案中，用于細胞移植的細胞是從人臍帶血中得到的。這樣，人臍帶血就可以被獲得并在活的造血祖細胞和/或干細胞中擴增富集，例如，通過獲得一種非粘附性、低密度、單核的細胞類群而達到富集的目的。這一類群緊接著被選擇預刺激，并在存在逆病毒和固定化或純的纖維結合素或其片段的條件下培養，從而提高載體介導的細胞轉導效率。考慮到這一點，人們發現，在纖維結合素或其片段存在時，即使纖維結合素并不構成臍帶因ECM的一部分，即使所用的臍帶血原始祖細胞和干細胞與骨髓中的并不相同，臍帶血中原始祖細胞和/或干細胞的轉導效率仍然被大幅度提高了。特別指出的是，臍帶血中的干細胞被表征為CD34+，HLA-DR+；而骨髓中的干細胞被表征為CD34+，HLA-DR-。申請者這一發現，即在纖維結合素或纖維結合素片段存在下臍帶血中的原始祖細胞可被高效地轉導的現象，使得人們能夠使用一種方便并且富含干細胞的造血細胞源。另外，用于富集原始祖細胞和干細胞的臍帶血通過異體移植而成功移植到無數病人體內的事實，使得臍帶血成為造血細胞的一個優選的源泉。請參考科利-庫瑪爾等，Brit.Heaematol.85419-422(1993)；布魯科思梅爾等，血細胞17313-329(1991)；格魯克曼等，Br.J.Heaematol.45557(1980)；海德爾堡Springer-Verlag pp.60-68(1989)；瓦格納等，血液791874-1881(1992)，瓦格納等，血液82-86a(摘要)如果需要，收獲的被轉導細胞或其他細胞可以再測定轉導效率和基因表達。例如，本發明提供的方法使逆病毒介導的基因轉移效率明顯提高，將在下面的特定實施例子中進行闡述。其中就描述了一些測定方法，用于說明在纖維結合素或纖維結合素片段存在下，逆病毒介導的感染和基因轉移的高效率。尤其指出，用PGK-hADA逆病毒感染的鼠造血細胞表達了很高水平的轉移來的ADA cDNA。類似地，用單個PGK-mADA病毒感染的人前體克隆比內源人ADA蛋白多表達了10倍以上。因此，為了嚴格地分析轉移效率，只有當轉移的mADA表達量等于或高于內源人的ADA水平時，才認為前體克隆被轉導了。TKNEO載體的新霉素的高效表達可通過對G418藥物的抗性來檢測的，這可用來分析neo磷轉移酶(新霉素基因的產物)活性。
正如前面指出的那樣，本發明中的方法的優點是不需要與產生逆病毒的細胞共同培養。這樣，根據本發明的這個方面，逆病毒介導的基因轉移可以在沒有其他細胞而只有靶細胞的情況下完成，靶細胞可以是造血細胞或其他類型細胞。例如，包含逆病毒載體質粒的生產者細胞可以被培養并且從上清中收集到這種載體質粒。然后包含逆病毒的上清可用來感染造血細胞。感染過程中有纖維結合素和/或纖維結合素片段存在，并且它們是優選地處于固定化狀態的，例如涂在要進行感染的基物之上或與感染用的介質相接觸。這樣，任何制備高效價游離逆病毒的細胞都被認為適用于本發明。這些細胞包括包裝細胞，如Psi-2，C2，PA 12，PA317和GptenvAM 12，和許多本領域中的其它包裝細胞系。
根據本發明的其他一些性質，與纖維結合素肝素II結合區上氨基酸相結合的病毒可以用于構建多種類型細胞病毒療法的構建體。至此，一種帶有纖維結合素逆病毒結合區的多肽，可以與具有這種靶細胞構建專一性的任何配體進行共價偶聯。這種方法將不再象以前那樣，需要對每一種靶細胞構建一個特定的逆病毒生產者細胞系(Kasahara，N.A.MDozy，和Y.W.Kan.，科學，266卷，1373-1376頁(1994)，Valsesia-Wittmann，S.，A.Drynda，G.Deleage，M.Aumailley，J.M.Heard，O.Danos，G.Verdier，和F.L.Cosset，病毒學雜志，68卷，4609-4619頁(1994))。靶向構建體的專一性可以通過使用不同的配基來實現，這些配基包括1)細胞粘連蛋白，2)激素或細胞因子，3)靶細胞的單抗隆抗體，4)與靶細胞結合的碳水化合物(G.Ashwell等，生物化學研究年鑒，51卷，531-554頁(1982))，5)靶細胞產生的代謝物，或者6)與靶細胞結合的功能多肽。這種基因傳遞構建體的效率可以通過加入一些肝素II病毒結合區來改善，從而可以增加傳遞到靶細胞上病毒粒子的數目。例如，美國專利第5,198,423號中描述的與Pro1239-Ser1515片段相對應的人類纖維結合素細胞結合區，已被證明可以與包括BHK和B16-F10細胞在內的幾種細胞相結合(Kimizuka等人，生物化學雜志110卷，285-291頁(1991))。另外，肝素II區本身也具有與纖維結合素，內皮細胞及癌細胞結合的能力。這些多肽序列可以被偶聯到纖維結合素的逆病毒結合區上，從而用來定靶于將要用逆病毒感染的靶細胞。
造血系統的典型應用還包括促紅細胞生成素構建體或G-CSF與纖維結合素的逆病毒結合區偶聯，從而高度特異地分辨并分別定靶于類紅細胞或粒狀前體細胞。本發明的另外一個常見的應用將使逆病毒的一個或多個結合區與專一或主要結合在惡性細胞上的配體相聯系。例如，已有人報道，在體外，甚至體內，乳腺癌細胞的生長會因為使用了一些結合在靶細胞受治療者上的物質而受到影響。這些物質包括促黃體生成素釋放的衍生物，(Emons，G.等人，人類繁殖91364-1379，(1994))，雌激素(Tolcher，A.W.，Oncol，839-43(1994))，或抗雌激素(Howell，A.等，Lancet 34529-30(1995))，孕激素或抗孕激素(Klijn，F.G.等，人類繁殖，9 Suppl.1181-189(1994)；Griffiths，K.等人，Semin.Oncol.21672-687(1994))。這些物質在本發明中充當了包含一個或多個纖維結合素病毒結合區的構建體中的配體。進一步舉例說明，甲狀腺(癌)細胞可以用帶有基質的構建物來高度特異地定靶，肝(癌)細胞可以用含有HDL或HDL的一部分的構建物來定靶。最后，單克隆抗體的構建物和纖維結合素逆病毒結合區將可以定靶單克隆抗體所適合的任何細胞和器官。這樣，通過利用纖維結合素逆病毒結合區結合并定位病毒載體的能力，很大范圍類型的哺乳動物細胞都可以成為靶細胞。
相應地，本發明的另一個優選實施方案包含了制備可用來制備靶細胞的病毒轉導的構建體。纖維結合素肝素II結合區上的病毒結合氨基酸序列是被偶聯在與靶細胞相連的配體上的。正象上面討論的，配體可以包括纖維結合素或其他蛋白上的一段多肽(包括細胞粘連蛋白，如層蛋白，膠原蛋白，vitronectin，osteopontin或thrombospondin)，一種激素，一種代謝物，一種抗體(包括單克隆抗體)，或任何一種具有專一地與靶細胞相結合能力的其他配體。所得到的總的構建物可以象纖維結合素那樣，以被固定化的形式來應用，這將在以后的實施例中專門描述。
正象前面所述，這樣的構建體和細胞定靶方法可以應用在體外，考慮到構建體的穩定性和專一性及在生理條件下逆病毒構建物的相互作用等因素，這種構建體也可用于逆病毒的體內定靶。通過修飾傳遞系統來定位構建體向靶細胞的傳遞還可以進一步提高特異性。例如，通過疏張門靜脈來定靶肝細胞。
使用為本發明的實用方法專門設計的試劑盒會使進行逆病毒介導的DNA轉移變得更為方便。相應地，本發明的另一個方面提供了一些試劑盒，其中包括大量基本上純的多肽或可增強靶細胞的轉導的構建體，和作為逆病毒感染基質的人造基質。多肽或其他構建物可以分別提供或涂在人造基質上。在人造血細胞的感染時，試劑盒中還包括用于細胞預刺激的造血細胞生長因子。另外，試劑盒中可包括上面討論過的用于轉導的重組逆病毒載體。一般地說，試劑盒應包括無菌包裝，從而保證試劑盒中各種成分在空間上分離，防止在使用試劑盒時成分被破壞。例如，在實踐中，常用帶多個分室或分區的密封塑料盒來分離試劑盒中的各種成分。
為了進一步加深對本發明的理解和認同，我們給出了以下實施例。應該明白，這些實施例僅僅是本發明的例證，實際上，本發明并不局限于此。
實施例1用TKNEO把基因轉移到骨髓細胞中1.1病毒上清的制備包含逆病毒質粒TKNEO載體的GP+EnvAM 12生產者細胞(參閱Markowitz等人(1988)病毒學167400)培養在Iscove的改進的Dulbeccos培養基(IMDM，Gibco公司，蓋斯伯里，MD)中。這種培養基中含有10％的胎牛血清(FCS，Hyclone公司，羅甘，UT)和100單位/毫升的青霉素及100毫克/毫升的鏈霉素(P/S，Gibco公司)包含病毒的上清通過加入10毫升含20％FCS的IMDM濃縮過夜而獲得。收集到的介質通過0.45微米濾膜(Gelman科學，Ann Arbor，MI)過濾之后保存在-80℃冰箱中待用。
1.2纖維結合素片段的制備FN是利用Ruoslahti等人在酶學方法，82803-831(1982)中所描述的方法從人血漿(生命源，Glenview，IL)中純化的，只是在用4N脲洗脫之前，用1M脲來洗這個明膠瓊脂糖柱。純化了的FN在4℃，10mM3-(環己胺)-1-丙基-磺酸(CAPS)，150mM NaCl，2mM CaCl2pH 11.0的溶液中進一步水解，并分裝保存在-80℃冰箱中。FN的胰凝蛋白酶細胞結合區(CBD)(CS-1)和肝素II結合片段用前面的方法進行純化(Ruoslahti等人，(1982)，如上，Patel和Lodish，細胞生物學雜志102，449-456頁(1986)，以及Bernardi等人.，細胞生物學雜志105，489-498頁(1987)。三個主要的肝素結合片段(30kD，35kD和42kD)從肝素瓊脂糖層析柱的1M NaCl洗脫成分中得到。為進一步純化這些肝素結合片段，這些1M NaCl洗脫成分在4℃10mM Tris-HCl pH 7.0溶液中水解過夜，并通過預先用10mM Tris-HCl pH 7.0平衡了的陽離子交換柱(2ml DEAE Sepharose快流(Pharmacia精細化學，Uppsala，瑞典)/毫克蛋白)，30/35kD片段在沒結合的流份中被收集，而42kD片段則用10mM NaCl洗脫下來。從500mg FN中，大約可得到26mg的30/35kD片段和4mg 42kD片段。通過Wester印跡技術測定可知是42kD片段，而不30/35kD片段可被抗fibrin結合區的抗體所識別。同樣，42kD片段可以結合在fibrin-sepharose親和層析柱上。
為了用于感染方案中，纖維結合素片段被固定于35或100mm的培養皿中(Falcon公司，林肯公園，NJ)，濃度和Patel，Lodish所述一樣為75pmol/cm2，(1986)，如上。對照皿中以相似的方式涂上2％(不含FN)的牛血清清蛋白(BSA，伯寧漢姆，Mannheim，德國)。
1.3逆病毒感染方法從健康成人中取來的骨髓樣品被收集在含無菌，無防腐劑的硫酸鈉肝素的試管中。這一方法是依據印第安那大學醫學院學術委員會認可的方法來進行的。在Ficoll-Hypaque(密度1.077g/ml，Pharmacia，Piscataway，NJ)離心機上，25℃離心45分鐘，制備出低密度的單核的細胞。通過在含2％FCS的IMDM組織培養皿上進一步培養4-16小時除去低密度骨髓細胞中的塑料粘連細胞。培養溫度為37℃，在5％CO2環境中。
正象以前Luskey等人描述的那樣，非粘附性、低密度、單核的細胞在37℃下含5％CO2的IMDM的培養皿中，在用逆病毒感染之前，首先預刺激48小時。這種IMDM培養基含有20％FCS，100U/ml rhIL-6，100ng/ml rhSCF(Amgen，Thousomdoaks，CA)，和細胞密度為1×10細胞/ml的P/S。被預刺激了的細胞通過充分的吹洗除去與塑料結合不緊密的細胞。
預刺激了的細胞(5×105個細胞/ml)在涂有BSA(對照)或纖維結合素或其片段的平板上培養6小時(這些蛋白或多肽經UV放射性檢測，已很好地粘附在塑料平板上)，然后，在生長因子(如上)和7.5毫克/ml多(Aldrich化學公司，Milwankee，WI)存在下，用病毒上清進行感染。兩小時后，除去病毒上清(包括生長因子和5.0毫克/ml溴化己二甲銨)，并繼續培養12到24小時。每次交換介質時都重新加入非粘的細胞。
感染步驟之后，非粘附細胞被棄掉，而粘附的造血細胞按照廠家的說明用細胞裂解液(CDB)(以無酶/PBS為基礎，Gibco)從培養物中收集得到。粘附細胞中加入非粘附部分，洗兩次然后計數。收集到的細胞或接種在克隆化甲基纖維素前體化驗平板上，或接種在長期骨髓培養物的平板上。
1.4長期骨髓培養LTC-IC(人干細胞)分析是按前面描述的方法進行的，僅做了輕微的改動，Sutherland等人，血液741563(1989)。簡要地說，0.5-1×106被感染了的細胞被接種在含濃縮的被預照射的(如上)異源人骨髓成纖維細胞的5ml IMDM六個組織培養平板上的長期骨髓培養物(LTMC)中。IMDM含有10％FCS，10％馬血清(Sigma)和P/S，1×10-5M的氫化可的松(Upjohn，Kalamazoo，MI)和320毫mol NaCl(Costar，劍橋，MA)。LTMC被培養在33℃，5％CO2的條件下，并且每星期除去50％的介質和非粘附細胞。五周后，LTC-IC培養物用CDB除去以從BMF中除去粘附細胞。非粘附和粘附細胞都結合并鋪在甲基纖維素平板上，從而從LTC-IC中獲得克隆。
1.5克隆化甲基纖維素分析甲基纖維素分析基本上按Toksoz等人在美國國家科學院院刊，Vol.89，p7350(1992)中描述的方法進行，只是做了輕微的改動。簡單地說，2-5×104個被感染的成骨髓細胞與5單位/ml促紅細胞生成素(Epo，Amgen)，100ng/ml rhSCF，10ng/ml rhIL-3(Genzyme，劍橋，MA)一起鋪在1ml 2.4％IMDM甲基纖維素平板上(Fluka，Ronkonkoma，NY)。這種平板含25％FCS，10％人血漿，10-5Mβ-巰基乙醇(Sigma)和P/S，培養物在37℃含5％CO2，95％空氣中培養，并用反相顯微鏡在第13天時觀察記錄克隆的情況，如CFU-GM(包含粒細胞和巨噬細胞)CFU(包含類骨髓細胞和類紅細胞成分)，或BFU-E(只包含類紅細胞成分)。
1.6逆病毒感染的分析用TKNEO病毒進行感染的效率可通過測定在13天時甲基纖維素克隆在1.5mg/ml(干粉，Gibco)G418存在下的存活百分比來分析。模擬感染在每個實驗中都通過不生產重組病毒的GP+EnvAM 12包裝系培養骨髓來進行，這些模擬感染細胞培養物在用G418存在時顯示出低于1％的本底克隆。
1.7定型祖細胞的基因轉移效率通過以感染鋪在30/35FN-或涂有BSA平板上的骨髓細胞為對照來分析轉導效率，在感染后，未經選擇前，在這些條件下沒有發現克隆數目有什么區別。圖2說明了感染后G418r克隆的百分比。在所有類型的祖細胞中，30/35FN上得到了更高比例的G418r克隆。其中包括那些從單譜系(BFU-E和CFU-GM)和多譜系(CFU-Mix)祖細胞中得到的克隆。對BSA相比，在30/35FN上，所有定型祖細胞被感染數提高了九倍。
1.8長期培養起始細胞的基因轉移效率基因向LTC-IC的轉移用TKNEO載體來估計，向LTC-IC進行基因轉移得到的克隆僅在30/35FN上的感染之后才進行檢測(30/35FN與BSA相比，分別為16％G418r和0％G418r克隆)。
1.9 30/35FN的專一性對造血細胞感染效率的影響為了確定在30/35FN上，提高基因轉移效率的專一性，在分別涂有BSA、30/35FN、天然纖維結合素、一種包含帶有RGDS四肽序列的中央細胞結合區(CBD)的115kD FN片段，一個42kd帶有肝素II結合區而無CS-1序列(圖1)的FN片段(42FN)，的平板上，用TKNEO進行感染。在BSA上的感染產生3±1％的G418rBFU-E，1±1％的G418rCFU-GM和0±0％G418rCFU-MIX。在CBD上沒有發現G418r克隆比例有明顯提高，而在42FN上BFU-E的感染有少量增加(6.0±-1％)。然而，天然的FN可以提高所有定型祖細胞的基因轉移。在所有譜系中，天然FN上感染后的G418r克隆比例都低于在30/35FN上的感染。包括BFU-E(16±-2對24±4％)，CFU-GM(5±2對20±4％)和CFU-MIX(6±1對9±1％)，以上是天然FN和30/35FN的比較，前者為天然FN，后者為30/35FN。
實施例2用PGK-mADA對骨髓細胞進行基因轉移2.1一般步驟用實施例1中制備TKNEO的方法來制備PGK-mADA病毒上清。纖維結合素的胰凝乳蛋白酶原片段(圖1)用實施例1中介紹的方法進行制備，之后按實施例1中的方法進行逆病毒感染。LTC-IC(人類干細胞)分析和甲基纖維素分析也按照實施例1進行。
2.2逆病毒感染的分析用PGK-mADA進行感染的效率可通過使用ADA同功酶電泳的蛋白分析來測定。對各種單個祖細胞克隆的分析可按以前Moritz(1993)和Lim等人(1989)在美國國家科學院院刊，Vol.86，p8892中描述的方法進行。為了精確分析轉移效率，只有當克隆所表達的mADA與內源人類ADA水平相同或更高時，才認為進行了轉導。為了分析收集到的克隆，把從甲基纖維素培養物中挑出的克隆放入1.5ml微量試管中，用溫的介質和磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，離心后保存在-20℃冰箱中。為進行ADA分析，在5μl裂解緩沖液中反復凍融裂解細胞，同功酶電泳用前面介紹的方法進行。
2.3定型祖細胞的基因轉移效率把骨髓細胞接種在分別涂有30/35FN和BSA的平皿上進行感染，來比較轉導效率，在未選擇時感染后得到的克隆數在這些條件之間沒什么區別。如表1所示，與在BSA上相比，在30/35FN上的所有定型祖細胞的轉導效率明顯地提高。正如用高效價(～1×107病毒/ml)載體來預測的那樣，定型祖細胞的轉導效率非常高。根據表1，在兩個不同實驗中，用PGK-mADA在30/35FN上對骨髓進行感染，幾乎100％的定型祖細胞被轉導。
表1在纖維結合素30/35片段上用PGK-mADA載體對定型祖細胞轉導的效率。
*mADA表達克隆的數目/所分析的總克隆數2.4基因向長期培養起始細胞的轉移效率在用PGK-mADA進行的四個獨立的實驗中，5周齡的LTMC(即TLC-IC產生的克隆)中得到的祖細胞克隆中有很大比例都表達了轉移來的鼠ADA基因。所分析克隆的表達范圍為2/12(17％)到6/6(100％)(表2)在所有考慮到的陽性克隆中，引入mADA基因的表達超過了或至少等于人內源ADA的活性。PGK-mADA的感染效率高于TKNEO的效率。如表2所示，在兩個不同實驗中，用PGK-mADA在30/35FN對骨髓進行感染幾乎100％的定型祖細胞被轉導。
表2PGK-mADA載體對人長期培養起始細胞(LTC-IC)的感染效率
*mADA陽性克隆數/所分析的總克隆數N/A未分析。
2.5 30/35FN對造血細胞感染效率影響的專一性在30/35FN上基因向LTC-IC轉移的效率被提高了。由于再次得到的LTC-IC克隆相對較小，所以，用單個克隆進行蛋白分析受到限制。在BSA，天然FN和42FN上感染后，分別得到了0/6，0/4，和0/3的LTC-IC獲得克隆，而用30/35FN感染時得到的LTC-IC獲得克隆3/5表達了mADA，說明了鼠ADA的表達。另外，多種LTC-IC獲得克隆在分析前被均分后，進行另外兩個實驗。結果，感染之后在30/35FN上發現mADA表達，在天然FN上表達量要少一些，而在42FN或BSA上，沒有mADA被表達。
實施例3用PGK-hADA對骨髓細胞進行基因轉移3.1一般步驟用實施例1中制備TKNEO的方法來制備PGK-hADA病毒上清。纖維結合素的胰凝乳蛋白酶原片段(圖1)用實施例1中介紹的方法進行制備。之后按實施例1中的方法進行逆病毒感染。LTC-IC分析和甲基纖維素分析也按照實施例1進行。
3.2逆病毒感染的分析為了分析收集到的克隆，把從甲基纖維素培養物中挑出的克隆放入1.5ml微量試管中，用溫暖的介質和PBS沖洗，離心后保存在-20℃冰箱中。為了進行ADA分析，在5ml裂解緩沖液中反復凍融，裂解細胞，用前面介紹的方法進行同功酶電泳。
實施例4用TKNEO對臍帶血細胞進行基因轉移4.1一般步驟用前面實施例1中介紹的方法制備TKNEO病毒上清和胰凝乳蛋白酶原片段。實施例1中逆病毒感染過程基本上原樣進行，只是不再用骨髓細胞，而代之以收集在試管中的，含有肝素的，正常足月新生兒的臍帶血。這種臍帶血是根據印第安納大學醫學院學術委員會認可的方法制備的LTC-IC(人干細胞)分析，甲基纖維素分析也按照實施例1進行。
4.2向定型祖細胞進行基因轉移的效率在三個不同實驗中，與BSA相比，FN30/35上的感染要高四倍以上。(表3)表3用30/35FN片段和TKNEO載體對臍帶血祖細胞進行感染的效率
實施例5用PGK-mADA對臍帶血細胞進行基因轉移5.1一般步驟用前面實施例1中描述的方法制備PGK-mADA和胰凝乳蛋白酶原片段。實施例1中逆病毒感染過程基本上原樣進行，只是不再用骨髓細胞，而代之以收集在試管中的正常足月新生兒的臍帶血。這種臍帶血是根據印第安納大學醫學院學術委員會認可的方法制備的。LTC-IC分析和甲基纖維素分析按實施例1進行。
5.2基因向長期培養起始細胞的轉移效率利用高效價的PGK-mADA載體，分析LTC-IC獲得克隆，表明僅在FN30/35上用上清感染的臍帶血培養物高水平表達了引入的mADAcDNA，而在BSA對照平板上，LTC-IC獲得克隆中幾乎沒有檢測到mADA的表達。
實施例4和實施例5的結果表明當使用臍帶血祖細胞和干細胞時，用FN30/35也可以提高它們的感染效率。
實施例6用PGK-hADA向臍帶血細胞中進行基因轉移用實施例1中的方法制備PGK-hADA病毒和胰凝乳蛋白酶原片段(圖1)。實施例1中逆病毒感染過程基本上原樣進行，只是不再用骨髓細胞，而代之以收集在試管中的正常足月新生兒的臍帶血。這種臍帶血是根據印第安納大學醫學院學術委員會認可的方法制備的。LTC-IC分析和甲基纖維素分析按實施例1進行。
實施例7-11逆病毒載體和生產者細胞系關于實施例7-11在實施例7-11中使用了兩種逆病毒制備包裝細胞系分別是ecotropic GP+E86(Markowitz，D.，S.Goff，和A.Bank，病毒學雜志，62卷，1120-1124頁(1988))和amphotropic GP+envAM 12細胞系(Markowitz，D.，S.Goff，和A.Bank，病毒學，卷167，400-406頁(1988))。研究中所用的逆病毒載體和生產者克隆列于下列表4中表4
所有細胞系都在杜氏改進的Eagles培養基(DME，Gibco公司，GrandIsland，組約)中培養，除了EAL2a細胞是在含有10％FCS和P/S的DME-F12(Gibco)中生長。DME培養基中包含10％的胎牛血清(FCS，Hyclone，Logan，UT)和100單位/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素。通過加入10ml鼠細胞α最低量基本培養基(αMEM，Gibco)或人細胞的Iscove’s Dulbecco培養基(IMDM，Gibco)在10cm平板上濃縮過夜來收集包含病毒的上清。這兩種培養基中都含有10％的FCS和P/S。收集到的培養基質通過0.45微米濾膜(Gelman科學，Ann Arbor，MI)來過濾。
實施例7初級鼠造血細胞的轉導7.1實驗為了用鼠細胞來研究，在注射了150mg/kg 5-氟尿嘧啶兩天后，從6至8周齡C3H/HeJ小鼠股骨或脛骨中提取骨髓(Solopack實驗室，福蘭克林公園，IL)(Lim，B.，J.F.Apperley，S.H.Orkin，和D.A.Williams，美國國家科學院院刊86卷，8892-8896頁(1989))。在含有20％FCS和P/S及100ng/ml的重組干細胞因子，100單位/ml重組人白介素-6(rhIL-6；Pepro技術公司，洛克西爾，NJ)的IMDM培養基中，把濃度為5×105個細胞/ml的細胞預刺激48小時(Luskey，B.D.，M.Rosenblant，K.Zsebo和D.A.Williams，血液，80卷，396-402頁(1992))。然后，用三種不同的方法比較EPHA-5細胞制備的PGK-hADA載體的基因轉移效率。這三種方法是1)上清感；2)用上清在FN 30/35上感染；3)與EPHA-5生產者細胞共同培養。這樣，在室溫下，把溶于磷酸鹽緩沖液中的FN 30/35以2.5μg/cm2(相當于75pmol)的密度涂在10mm的細菌平皿中，開蓋在紫外燈下照射1小時，蓋上蓋再照射1小時，用2％的小牛血清清蛋白在室溫下封閉30分鐘之后，用補充了25％(v/v)1MHepes的Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)(Gibco)洗滌一次。對于上清感染，平皿只涂上BSA。5×106個預刺激了的供體細胞與10ml從EPHA-5細胞中用上述方法得到的病毒上清一起培養，其中加入100U/ml的rhIL-6，100ng/ml的hrSCF和7.5μg/ml的溴化己二甲銨。非粘附細胞被收集起來并與新鮮的病毒上清一起加入。對于共同培養，4ml培養基中的EPHA-5細胞與10μg/ml的絲裂霉素C一起培養2小時，沖洗，用胰蛋白酶消化并接種在100mm的含10ml αMEM/20％FCS和P/S的組織培養基上，接種濃度為3×106個細胞。第二天，5×106個預刺激了的骨髓細胞和100U/ml rhIL-6，100ng/ml rrSCF及4μg/ml的溴化己二甲銨一起加入到培養基中，繼續培養48小時。在感染之后，扔掉非粘附細胞并用細胞解離緩沖液按廠家的指導從培養物中收集粘附造血細胞。這些粘附細胞加入到非粘附組分中，沖洗兩次，并懸浮在大約1ml的HBSS/Hepes溶液中。把從5×106預刺激了的細胞獲得了全部細胞從尾靜脈注射到三只被全身致死性照射過的小鼠體內(用700+400cGy，137Cs-放射源照射)(Luskey，B.D.，M.Rosenblatt，K.Zsebo，和D.A.Williams，血液，80卷，396-402頁(1992))。造血干細胞的轉導情況通過測定恢復健康的小鼠體內引入的人ADA cDNA的表達來分析。這種ADA同功酶分析是在移植小鼠體內通過用乙酸纖維素原位酶分析法檢測外周血細胞中hADA蛋白的存在來完成的(Lim，B.，D.A.Williams，和S.H.Orkin，分子細胞生物學，7卷，3459-3465頁(1987))。檢測從移植四個月后開始，以后每月重復一次。
7.2結果用基因操作造血干細胞來完成的小鼠長期骨髓的重新恢復已被廣泛接受，并被認為可以充分確定移植四個月后干細胞轉導的效率。在7個月后，用同功酶分析法對受治療者轉入的骨髓進行分析表明1)無論是用共同培養還是在FN 30/35上培養，人ADA cDNA都進行了表達，而在無FN 30/35的感染之后，被移植的小鼠體內沒有人ADA cDNA表達。2)在共同培養和FN 30/35培養后的移植小鼠體內，ADA表達水平是可以進行比較的。如圖4中泳道2-4所示，移植了用與EPHA-5共培養而轉導的骨髓的三只小鼠顯示出很明顯的人的ADA帶，在三只移植了用FN 30/35上清感染而產生的造血細胞的小鼠體內，也有類似水平的人ADA的表達(圖4，泳道5-7)。相反地，在移植了在BSA上轉導的細胞的三只小鼠體內，沒有發現人的ADA(圖4，泳道8-10)。圖4中泳道1和12作為對照定位了人的ADA，泳道11定位了鼠ADA。在泳道2-10中的鼠ADA帶表明上樣量是相同的。這些數據說明用FN 30/35上的上清感染來對長期重建造血干細胞進行轉導是與共同培養法等效的，并且遠遠地優用沒有FN 30/35的上清感染。
實施例8用逆病毒載體結合到FN 30/35上來增強轉導的機制8.1實驗為了測定增加轉導是否是同時定位病毒和造血細胞的結果，我們分析了重組逆病毒粒子是否是結合在FN 30/35上。這樣，把涂有FN 30/35的平板用含有TKNEO病毒的上清預先培養30分鐘，然后，分別沖洗。根據標準方法用NIH/3T3細胞測定上清的病毒效價(Markowitz，D.，S.Goff和A.Bank，病毒學雜志，62，pp 1120-1124(1988))。簡單地說，3T3細胞以1000個細胞/孔的濃度被接種在6孔組織培養平板上并生長過夜。一系列病毒上清稀釋液與7.5μg/ml溴化己二甲銨一起加入到每個孔之中，37℃下培養2.5小時之后再加入2ml培養基。24小時之后用含有G418(0.75mg/ml干粉，Gibco)的培養基取代原培養基。把這些平板培育10-12天。10-12天之后，把具有G418抗性的克隆(G418r)染色并計數。每孔中的克隆數與病毒上清稀釋倍數的乘積即作為每毫升上清的感染數(cfu)。我們估計(“定效價”)了用病毒上清預培養之后留在涂有FN 30/35或BSA的35mm平板上的逆病毒粒子數，并在每個平皿中加入1000個NIH/3T3細胞和溴化己二甲銨。24小時后，向培養物中加入含0.75mg/ml G418(干粉)的培養基，并繼續培養10-12天。在此之后，通過測出具G418抗性的克隆數來定量存在的粘附病毒。
為了了解病毒與FN 30/35的結合是否與劑量有關，增加涂在平皿上的FN 30/35的濃度，重復上述實驗。因此，在35mm細菌培養皿上分別涂上1、4、10和20μg/cm2的FN 30/35，如上所述。把一種預先測了效價的TKNEO病毒樣品以1∶50的稀釋倍數加到涂有FN 30/35的平板上，培養30分鐘。其中稀釋后病毒樣品效價為1×104感染粒子/mL。在充分沖洗之后，向每個孔中加入2000個NIH/3T3細胞。象上面介紹的那樣進行挑選，挑選后培養10天，對具有G418抗性的克隆進行計數。
8.2結果圖5給出了三個代表性實驗之一的結果。利用TKNEO上清，用NIH/3T3細胞的G418r克隆數測出的逆病毒效價，在涂有BSA的平板上降低了三個量級以上(從4×103到0)，而在涂有30/35FN的平板上效價的減少僅為1個量級。這些結果表明逆病毒與FN 30/35定量地結合而不與涂有BSA的平板(對照平板)結合。圖6顯示了，當含有病毒的上清培養在涂有濃度不斷增加的FN 30/35的平板上時，檢測到具有G418抗性的克隆數也增加的情況。因此病毒與FN 30/35結合是依賴于劑量的。
實施例9病毒與重組纖維結合素片段的結合9.1實驗Kimizuka等人曾經報告了克隆的FN DNA序列在大腸桿菌中的表達(Kimizuka，F.，Y.Taguchi，Y.Odate.Y.Kawase，T.Shimojo，D.Hashino.I.Kato，K.Sekiguchi，和K.Titani，生物化學雜志，110卷，284-291頁(1991))。克隆的和嵌合的多肽中含有纖維結合素中參與細胞粘連的一個或多個重要的序列，(包括RGDS，CS-1和肝素結合位點)，參閱圖7。為了分析逆病毒是否能和這些重組FN片段相結合，在涂有各種重組片段的平板上反復進行3T3細胞克隆形成測試，測試中使用了冰凍的，效價為1×10-4cfu/ml逆病毒樣品的兩種不同稀釋液(稀釋倍數分別為1∶10和1∶100)。而所測試的重組片段包括C-274，H-271，H-296，CH-271，CH-296和C-CS1以及做為陽性對照的FN 30/35。FN片段的濃度為120-130pmol/ml(相當于4μg/cm2的C-274，H-271，H-296，C-CS1，FN 30/35和8μg/cm2的CH-271和CH-296)。簡單地說，涂平板，加入病毒，充分沖洗平板，加入NIH/3T3細胞培養24小時，然后在選擇培養基中培養10天，最后把產生的克隆進行染色和計數。
9.2結果圖8指出在片段H-271，H-296，CH-271和CH-296中，G418抗性克隆的數目有所增加(因此有病毒被粘連)。另外，雖然在本實驗中CH-271顯示出與病毒結合的最高水平，但總的來說，這幾種片段與病毒結合的數目是與FN 30/35基本相同的。這5種FN片段的共同點是具有包含高親和性肝素結合位點的第III類型重復序列12-14(Ruoslahti，E.，生物化學研究年鑒，57卷，375-413頁(1988)，Kimizuka，F.，Y.Taguchi，T.Ohdate，Y.Kawase，T.Shimojo，K.Hashino，I.Kato，K.Sekiguchi和K.Titani，生物化學雜志，110卷，284-291頁(1991))，可能位于重復序列13(Kimizuka，F.，Y.Taguchi，Y.Ohdat，Y.Kawase，T.Shimojo，K.Hashino，I.Kato，K.Sekiguchi和K.Titani，生物化學雜志，110卷，284-291頁(1991))。這指出病毒的結合是通過這些已知的位點進行的。通過下列實驗證明了這一點。在涂有4μg/cm2的CH-271的平板上，用不同濃度(10-1000μg/ml)的肝素硫酸鹽來預培養。肝素硫酸鹽是可以抑制細胞與肝素結合位點相結合的一種帶有強電荷的分子。如在圖9中所看到的那樣，在用不斷上升濃度的肝素硫酸鹽預培養以后，具有G418抗性的克隆減少了。這些數據表明，病毒與FN相結合是通過位于與FN的C-末端區CS-1位點相鄰的高親和性肝素結合位點參與而完成的。
實施例10在重組纖維結合素片段上轉導造血細胞10.1實驗為了分析前面介紹的FN 30/35對造血細胞轉導效率的增強效應是否會在重組FN片段上發生，我們利用高繁殖力潛在克隆形成細胞(HPP-CFC)法在體外測定了上清感染的轉導效率。通過使用EAL2a載體，我們以G418抗性克隆生長狀況作為基因轉移的指示劑，比較了在BSA上，各種重組FN片段和FN 30/35上清感染對造血細胞轉導的影響。另外，我們比較了與粘連在FN片段上的病毒粒子(與上清病毒)轉導造血細胞的能力。在35mm涂有FN片段的培養皿上1-2ml EAL2a包含病毒的上清中，用生長因子和5μg/ml的溴化己二甲銨培養0.5-1×106預刺激了的骨髓細胞。為了用病毒與FN的結合來測定造血細胞的轉導，用含病毒上清培育的涂有FN的35mm培養皿被沖洗三次，每次用2ml PBS。然后，向0.5-1×106被預刺激了的骨髓細胞中加入補充了生長因子和溴化己二甲銨的2ml培養基。22小時以后，收獲細胞然后在有和沒有1.5mg/ml G418的條件下，進行HPP-CFC分析(Bradley，T.R.和D.Metcalf，澳大利亞實驗生物醫學雜志，44卷，287-293頁(1966))。培養物在33℃，7％CO2中培養14天，然后用G418抗性克隆的比例來計算基因的轉移效率。
10.2結果對于所有片段，通過上清感染的初級造血細胞的轉導(圖10)明顯地高于在BSA上進行的上清感染。這里所述片段都包含肝素結合位點(HBS)和至少一個更活躍的細胞結合位點(粗條)。重組片段CH-271，H-296，CH-296和C-CS1的轉導效率與FN 30/35的作用相似。所有這三個片段都同時具有肝素結合位點和CS-1位點。在所有的其他情況下，轉導都明顯地減弱。這些數據說明，前面提到的在FN 30/35上初級造血細胞轉導被增強的現象，在重組FN片段上也可以再現。這還進一步說明，病毒直接與FN相結合能夠造成造血細胞的基因轉導。最后，還證明了CS-1和肝素結合位點同時存在對初級造血前體(干)細胞轉導的應用。
實施例11用在重組FN片段上鼠供體細胞的轉導進行的小鼠長期骨髓重建11.1實驗我們重復一下上述在體外對初級造血祖細胞的研究(實施例10)，如比較用骨髓移植比較在BSA、FN 30/35、重組FN片段以及共培養時上清感染，來分析對造血干細胞恢復的影響。簡單地說，被致命照射了的小鼠被注入供體細胞，這種供體細胞已被含有人ADA cDNA的EPHA-5載體所轉導。一個月后，通過外周血ADA同功酶分析來分析基因轉移的效率。
11.2結果圖11清楚地顯示了同時含有肝素結合位點和CS-1位點的纖維結合素片段H-296產生了與FN 30/35及共培養相似的結果。不同時含有這些位點的片段在轉導可轉導細胞時表現出較低的效率。這些數據說明，結合在重組FN片段上的初級造血/干細胞和逆病毒的同時定位使可轉導細胞有效地被轉導，其中重組FN片段中同時含有CS-1和肝素結合位點。
雖然在前面的描述中，本發明已被詳細地說明和描述，但同樣應認為這些僅是作為例證或說明，而不是嚴格的限定。應該明白，這里僅描述了優選的實施方案。因而，根據本發明的精神而進行的所有改變和修飾都要求受到保護。
這里引用的所有文獻都被作為整體引入本文，就象它們是單獨地被引入和完整地列出一樣。
權利要求
1.一種定位逆病毒的方法，其包括溫育一種包含有與有效固定化量的多肽相接觸的逆病毒的培養物，所述多肽包含纖維結合素的肝素II區中具有逆病毒結合活性的氨基酸序列。
2.權利要求1的方法，其中所述多肽具有下式所示的氨基酸序列Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln VaI Thr Pro ThrSer Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly TyrArg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu IleAsn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met ValAla Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu ThrSer Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser ProPro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr IleSer Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp AlaVal Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Sys Pro AspVal Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr LysIle Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val ValIle Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe LeuAla Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg AlaArg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Sys Pro Gly Sev Pro ProArg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr IleThr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala LeuLys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr或與其充分相似而表現出纖維結合素的肝素II區逆病毒結合活性的氨基酸序列。
3.一種用于增強向預定靶細胞中進行逆病毒介導的DNA轉移的構建體的構建方法，其包括選擇一種可專一地與所述靶細胞結合的配體；以及把該配體與含有具有纖維結合素肝素II區逆病毒結合活性的氨基酸序列的多肽共價偶聯。
4.權利要求3的方法，其中所述配體為細胞粘連蛋白、激素、細胞因子、單克隆抗體、碳水化合物、代謝物或從不同于纖維結合素的蛋白中得到的多肽。
5.權利要4的方法，其中靶細胞是惡性細胞，配體是激素。
6.權利要求5的方法，其中靶細胞是乳癌細胞，配體是促黃體素釋放激素、雌激素、孕激素或抗孕激素。
7.一種用逆病毒提高活的靶細胞類群轉導頻率的方法，其包括在存在有效固定化量的構建體的條件下，用逆病毒感染細胞，所述構建體中包含可與結合了逆病毒的多肽共價偶聯的細胞特異性結合的配基，所述多肽含有纖維結合素的肝素II區中具有逆病毒結合活性的氨基酸序列。
8.權利要求7的方法，其中所述配體是細胞粘連蛋白、激素、細胞因子、單克隆抗體、碳水化合物、代謝物或從不同于纖維結合素的蛋白中獲得的多肽。
9.權利要求7的方法，其中所述多肽是一段重組多肽，該重組多肽具有下式所示氨基酸序列Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro ThrSer Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly TyrArg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu IleAsn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met ValAla Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu ThrSer Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser ProPro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr IleSer Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp AlaVal Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Sys pro AspVal Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr LysIle Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val ValIle Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe LeuAla Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg AlaArg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Sys Pro Gly Sev Pro ProArg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr IleThr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala LeuLys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr或與其充分相似而表現出逆病毒結合活性的氨基酸序列。
10.權利要求7的構建體，其中所述多肽是一段重組多肽，該重組多肽具有下式所示氨基酸序列Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro ThrSer Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly TyrArg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu IleAsn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met ValAla Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu ThrSer Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser ProPro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr IleSer Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp AlaVal Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Sys Pro AspVal Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr LysIle Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val ValIle Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe LeuAla Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg AlaArg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Sys Pro Gly Sev Pro ProArg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr IleThr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala LeuLys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr或與其充分相似而表現出逆病毒結合活性的氨基酸序列。
11.權利要求10的構建體，其中配體是細胞粘連蛋白、激素、細胞因子、單克隆抗體、碳水化合物、代謝物或者是從不同于纖維結合素的蛋白中得到的多肽。
12.一種用于增強向預定靶細胞中進行逆病毒介導的基因轉移效率的構建體，其包括與一種多肽共價偶聯的可以與所述靶細胞特異性結合的配體，所述多肽含有纖維結合素的肝素II區中具有逆病毒結合活性的氨基酸序列。
全文摘要
一種通過逆病毒提高造血細胞和其它細胞轉導效率的方法，其包括在纖維結合素或纖維結合素片段存在的條件下感染細胞。如圖所示，纖維結合素或纖維結合素片段顯著地增強了逆病毒介導的向細胞(特別是造血細胞，包括定型祖細胞和初級造血干細胞)中進行的基因轉移。本發明還提供了利用增強的基因轉移法、造血細胞類群和新的用于增強向細胞中進行逆病毒介導的DNA轉移的構建體而進行的改進的體基因療法及其應用。
文檔編號C12N15/86GK1775946SQ20041008265
公開日2006年5月24日 申請日期1995年3月27日 優先權日1994年3月25日
發明者D·A·威廉斯, V·P·帕特爾 申請人:印第安納大學研究及科技有限公司, 西北大學