一種原位雜交探針及其對大麥染色體組鑒定的方法與流程

本發明涉及分子細胞遺傳學領域，特別是涉及大麥染色體原位雜交(FISH)過程中寡核苷酸的確定與應用，本發明還涉及利用本發明提供的寡核苷酸探針對大麥開展非變性熒光原位雜交(ND-FISH)反應體系的建立與對大麥染色體組鑒定的應用。

背景技術：

高等生物染色體復結構雜，在不同染色體區域存在大量的重復序列，基于這一特性，在分子細胞遺傳學領域通常通過標記重復序列用于鑒定染色體。其是通過對重復序列進行熒光標記標記制備探針，使用染色體原位雜交方法分析染色體上探針信號的分布狀態，從而區分基因組與染色體組。此外，通過比較染色體上探針信號的變化亦是分析染色體行為的普遍做法。進一步地，染色體原位雜交方法在染色體工程育種中也起著至關重要的作用，染色體原位雜交方法是鑒定、區分特定物種基因組與染色體組最有效、直接的方法之一。

目前，已經報道的大麥亞端粒探針僅有Hv01，其是通過擴增大麥基因組亞端粒重復序列而得到的(Schubert et al.The Plant Journal 1998,14:494)。然而，通過標記擴增目標序列流程復雜，耗時費力，且受多種因素影響使得標記效果往往不理想。尤其是在進行大量試驗操作時，這一方法將在很大程度上影響試驗進程與效果。同時，通過標記擴增目標序列開展染色體原位雜交實驗的方法需要對目標材料染色體進行變性處理，不僅增加了試驗流程，同時在處理過程中易對載玻片上的染色體位置產生位移。當前，ND-FISH技術逐步興起，替代傳統的FISH試驗方法。其可通過設計合適的寡合苷酸探針，在不變性的條件下直接對目標材料染色體進行標記，極大地精簡了實驗步驟、縮短了試驗時間，同時保證了試驗效果。因此，提供一條能穩定標記大麥亞端粒區域的核苷酸探針將有助于解決當前原位雜交試驗中標記大麥亞端粒區域所面臨的困境。

技術實現要素：

為克服現有技術上的不足，本發明提供一種能穩定標記大麥染色體組的寡核苷酸探針以及該探針結合其他寡核苷酸探針通過ND-FISH方法鑒定大麥染色體組的應用。

基于以上目的，本發明根據Schubert et al.(The Plant Journal 1998,14:494)對大麥染色體亞端粒區的研究結果確定引物：

上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)

下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)，利用該引物對栽培大麥Baudin、野生大麥CN4027全基因組DNA進行PCR擴增反應，通過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現其產物存在如圖1所示的4條較亮條帶。選取其250bp左右條帶回收并構建質粒進行測序，結果顯示，其序列長度為113-116bp，說明所回收的核苷酸中存在兩個前后相連的相似性極高的片段。利用NCBI數據庫對測序結果Baudin 1進行序列比對分析，檢測出其在一段全長為105111bp序列HV_Mba442-A01(GenBank登錄號為AC256248.1)上存在64個拷貝。將HV_Mba442-A01分成小片段后反復在NCBI數據庫中與其自身比對，最終確定一段相對保守的全長為55bp的核苷酸用于探針制備，其堿基序列為：

5’-CTACTACTCACTGATTTTGGGTCCCGGGGCGATACGAACGTTCGGGGAACTTCGG-3’，命名為Oligo-442A01，合成該序列并對其進行熒光標記用于制備探針。本發明提供了上述寡核苷酸探針在ND-FISH方法中對大麥染色體標記方法及染色體組鑒定的應用。

本發明的寡核苷酸探針可用于檢測大麥材料染色體。

本發明提供了上述寡核苷酸探針在ND-FISH方法中對大麥染色體組鑒定的應用，是用上述寡核苷酸探針與寡核苷酸探針(AGG)₅組成的探針組合對大麥染色體開展ND-FISH試驗，綜合大麥染色體組的兩種探針信號位點分布狀況，若在熒光顯微鏡下能將大麥染色體組區分開，說明寡核苷酸探針Oligo-442A01與(AGG)₅的組合能用于鑒定大麥染色體組。

本發明提供了檢測大麥材料染色體的寡核苷酸探針，即Oligo-442A01，探針核苷酸序列為：

5’-CTACTACTCACTGATTTTGGGTCCCGGGGCGATACGAACGTTCGGGGAACTTCGG-3’。(SEQ ID NO.3)

進一步地，提供了Oligo-442A01在檢測大麥材料染色體的方法。

本發明提供了Oligo-442A01探針在ND-FISH方法中的應用。

本發明提供了Oligo-442A01探針在大麥種質資源改良中的應用。

本發明提供了Oligo-442A01探針結合(AGG)₅探針在ND-FISH方法中鑒定大麥材料染色體組的應用。

本發明提供了一種寡核苷酸探針Oligo-442A01在ND-FISH方法中檢測大麥材料染色體的方法，用寡核苷酸探針Oligo-442A01對大麥材料染色體開展ND-FISH試驗，若在熒光顯微鏡下大麥部分區域表現出對應的信號，說明寡核苷酸探針Oligo-442A01能用于ND-FISH方法中檢測大麥材料染色體亞端粒區域。

其中，所述ND-FISH方法反應程序為：于光學顯微鏡下檢查染色體，選取染色體形態清晰、分散較好的載玻片，滴加10μl(0.35μl1OD/ml Oligo-442A01探針與9.65μl雜交液)混合雜交液，蓋蓋玻片，置于潮濕的暗盒中37℃孵育2h，2×SSC緩沖液清洗雜交液兩次，ddH₂O洗1次，滴加10μl DAPI染液，蓋蓋玻片，于OLYMPUS BX63熒光顯微鏡下觀察染色體并使用OLYMPUS DP80CCD相機拍攝照片。上述雜交液為：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉。

本發明提供了上述方法在大麥細胞學檢測中的應用。

本發明提供了一種寡核苷酸探針Oligo-442A01與寡核苷酸探針(AGG)₅組合在ND-FISH方法中鑒定大麥材料染色體組的應用，用寡核苷酸探針Oligo-442A01與寡核苷酸探針(AGG)₅按一定比例濃度組合對大麥材料染色體開展ND-FISH試驗，綜合大麥染色體組的兩種探針信號位點分布狀況，若在熒光顯微鏡下能將大麥染色體組區分開，說明寡核苷酸探針Oligo-442A01與(AGG)₅的組合能用于鑒定大麥染色體組。

其中，所述ND-FISH方法反應程序為：于光學顯微鏡下檢查染色體，選取染色體形態清晰、分散較好的載玻片，滴加10ul(0.35μl 1OD/ml Oligo-442A01探針、0.35μl 1OD/ml(AGG)₅探針與9.30μl雜交液)混合雜交液，蓋蓋玻片，置于潮濕的暗盒中37℃孵育2h，2×SSC緩沖液清洗雜交液兩次，ddH₂O洗1次，滴加10μl DAPI染液，蓋蓋玻片，于OLYMPUS BX63熒光顯微鏡下觀察染色體并使用OLYMPUS DP80CCD相機拍攝照片。上述雜交液為：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉。

本發明所開發的ND-FISH方法中對大麥染色體進行標記的寡核苷酸探針，直接對大麥染色體進行檢測，結果顯示該探針能顯著地標記于大麥染色體亞端粒區域。該方法不僅具有靈敏度高、檢測效果較好的特點，同時還克服了傳統的質粒標記方法所帶來的流程復雜、標記效果受干擾較大的不足，是一種很好的檢測大麥染色體亞端粒區域的寡核苷酸探針。同時，本發明提供的ND-FISH方法鑒定大麥染色體組的應用具有耗時短、靈敏度好、檢測效果好、染色體組易于區分的特點，是一種較優的鑒定大麥染色體組的方法。利用本發明提供的寡核苷酸探針及鑒定方法，將使后續研究操作更便捷有效。

附圖說明

圖1為栽培大麥Baudin、野生大麥CN4027PCR擴增凝膠電泳檢測圖，從左到右依次為Marker、Baudin、CN4027。圖中從100bp-500bp間存在4條較亮條帶，250bp左右條帶為回收條帶。

圖2為栽培大麥Baudin、野生大麥CN4027擴增序列對比結果。各材料從涂板中選取24株長勢較好菌落涂板，再從涂板中挑選3條菌落條帶測序，Baudin1、Baudin9、Baudin21分別表示材料Baudin第1、9、21條菌落條帶，CN4027 11、CN4027 17、CN4027 19分別表示材料CN4027第11、17、19條菌落條帶。

圖3為寡核苷酸探針Oligo-442A01在ND-FISH體系中對栽培大麥Baudin(左)、野生大麥CN4027(右)染色體的標記效果圖，其中灰色區域為DAPI標記的大麥染色體，亞端粒高亮區域為Oligo-442A01信號點。

圖4為寡核苷酸探針Oligo-442A01與(AGG)₅在ND-FISH體系中對栽培大麥Baudin(左)、野生大麥CN4027(右)開展原位雜交后染色體的信號分布圖。其中亞端粒高亮區域為Oligo-442A01信號點，近著絲粒高亮區域為(AGG)₅信號點。從圖中可發現，寡核苷酸探針Oligo-442A01與(AGG)₅信號組合在大麥材料各染色體組上的信號分布存在顯著差異，且在兩個親緣關系相對較遠的大麥材料中的同一染色體組信號分布位點相似。說明寡核苷酸探針Oligo-442A01與(AGG)₅的組合能有效地區分大麥染色體組。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。本發明所使用的大麥材料：栽培品種Baudin、野生品種CN4027，均來自四川農業大學資源學院。本發明所使用生化試劑均為市售。本發明各試劑及配方如下：

DNA提取試劑盒：TaKaRa MiniBEST Plant DNA Extraction Kit(TaKaRa)。PCR擴增試劑盒：EmeraldAmp MAX PCR Master Mix(TaKaRa)。cDNA回收試劑盒：TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(TaKaRa)。質粒：pMD^TM19-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)。感受態細胞：Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells(TaKaRa)。瓊脂糖凝膠：采用0.5％瓊脂糖凝膠檢驗gDNA，2.0％瓊脂糖凝膠檢驗cDNA。其具體配方如表1。

表1

LB培養基(pH 7.0)：1％(W/V)tryptone,0.5％(W/V)Yeast Extract,1％(W/V)NaCl。

2×SSC緩沖液：0.3M NaCl,0.03M檸檬酸鈉。

70％甲酰胺變性劑：70％甲酰胺，溶于2×SSC緩沖液中。

雜交液：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉。

實施例1 大麥亞端粒重復序列分析及寡核苷酸探針序列的確定

1、大麥基因組DNA的提取

選取待測材料Baudin、CN4027幼嫩葉片，采用柱式法(TaKaRa MiniBEST Plant DNA Extraction Kit)提取DNA，提取步驟如下：

a)取150mg新鮮幼嫩葉片，液氮研磨成細粉迅速加入500μl的Buffer HS I和10μl的50×DTT Buffer混勻，然后加入10μl的RNase A(10mg/ml)，充分振蕩混勻，于56℃水浴中溫育10分鐘。

b)加入62.5μl的Buffer KAC，充分混勻。冰上放置5分鐘，12,000rpm離心5分鐘。取上清，加入與上清液等體積的BufferGB，充分混勻。

c)將Spin Column安置于Collection Tube，溶液移至Spin Column中。將500μl的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。

d)將700μl的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。

e)將Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm離心2分鐘。

f)將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入預熱至65℃的40μl Elution Buffer，室溫靜置5分鐘。

g)12,000rpm離心2分鐘洗脫DNA。

h)0.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度及質量。

2、PCR擴增

根據文獻(Schubert I,Shi F,Fuchs J,et al.An efficient screening for terminal deletions and translocations of barley chromosomes added to common wheat.The Plant Journal,1998,14:494.)對大麥染色體亞端粒標記探針的研究結果，參考其公布的引物HvT01，其核苷酸序列如下：

上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)；

下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)。利用該引物對Baudin、CN4027進行PCR擴增反應。

PCR反應體系：

PCR反應程序：

擴增結果如圖1。

3、寡核苷酸探針核苷酸序列的確定與探針制備

圖1中存在4條明顯條帶，選擇250bp左右條帶回收，構建質粒后送樣測序，結果如圖2。測序結果顯示堿基序列為113-116bp長，說明圖1中存在的間斷條帶極有可能為連續相接的重復序列。將B1序列導入NCBI數據庫中進行序列比對分析，檢測出其在一段全長為105111bp序列HV_Mba442-A01(GenBank登錄號為AC256248.1)上存在64個拷貝。將HV_Mba442-A01分成小片段后反復在NCBI數據庫中與其自身比對，最終確定一段相對保守的全長為55bp的核苷酸用于探針制備，其在HV_Mba442-A01中存在75個拷貝，堿基序列為：

5’-CTACTACTCACTGATTTTGGGTCCCGGGGCGATACGAACGTTCGGGGAACTTCGG-3’，將其命名為Oligo-442A01，合成該序列并對其進行及熒光標記物質標記用于制作探針。

預期本發明的寡核苷酸探針可便捷快速地用于鑒定大麥染色體亞端粒區域。

實施例2 寡核苷酸探針Oligo-442A01在ND-FISH方法中對大麥染色體標記的方法

1、大麥根尖細胞染色體制片

選取發芽后根長1-2cm根尖于N₂O中處理4h，醋酸滅活，ddH₂O洗凈，切取分生區于37℃酶混合液(纖維素酶：果膠酶＝1:1)中酶解37min，吸除酶液后依次用ddH₂O、無水乙醇各洗2次。每1根尖加入20μl乙酸充分攪拌至細胞呈現懸浮狀，于每張載玻片上滴10μl懸浮液。光學顯微鏡下檢查染色體，選取染色體形態清晰、分散較好的載玻片，并做好標記4℃冰箱中保存備用。

2、染色體原位雜交

取出載玻片自然晾干，混合雜交液按每張載玻片0.35μl 1OD·ml^-1Oligo-442A01與9.65μl雜交液的比例配置，用移液槍將混合雜交液反復打勻，吸取10μl混合雜交液滴于干燥的載玻片上，蓋蓋玻片于濕潤暗盒中37℃孵育2h。取出后避光條件下2×SSC洗2次、ddH₂O洗1次，每次5min。自然晾干后每張載玻片滴加10μl DAPI，蓋蓋玻片于OLYMPUS BX63熒光顯微鏡下觀察染色體并使用OLYMPUS DP80CCD相機拍攝照片。上述雜交液為：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉。

結果如圖3，大麥各染色體亞端粒區域均存在顯著的信號點，表明本發明開發的寡核苷酸探針Oligo-442A01在ND-FISH試驗中對大麥亞端粒區域具有顯著地標記效果，能夠快捷、準確地用于檢測大麥染色體亞端粒區域。

實施例3 寡核苷酸探針Oligo-442A01與(AGG)₅在ND-FISH方法中對大麥染色體組鑒定方法的建立及應用

選取實施例2中制好的載玻片自然晾干，混合雜交液按每張載玻片0.35μl 1OD·ml^-1 Oligo-442A01、0.35μl 1OD·ml^-1(AGG)₅與9.30μl雜交液的比例配置，用移液槍將混合雜交液反復打勻，吸取10μl混合雜交液滴于干燥的載玻片上，蓋蓋玻片于濕潤暗盒中37℃孵育2h。取出后避光條件下2×SSC洗2次、ddH₂O洗1次，每次5min。自然晾干后每張載玻片滴加10μl DAPI，蓋蓋玻片于OLYMPUS BX63熒光顯微鏡下觀察染色體并使用OLYMPUS DP80CCD相機拍攝照片。上述雜交液為：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉。

檢測結果見圖4，由圖可看出，本發明提供的寡核苷酸探針Oligo-442A01結合(AGG)₅的探針組合能有效識別大麥染色體組。圖中亞端粒區域高亮區為寡核苷酸探針Oligo-442A01信號，近著絲粒區域高亮區為寡核苷酸探針(AGG)₅信號。其特點為：1H染色體短小，長臂與短臂Oligo-442A01信號較強，(AGG)₅信號分布于著絲粒附近，且其信號強度較弱；2H染色體短臂存在明顯的Oligo-442A01信號，而長臂上不存在Oligo-442A01信號，(AGG)₅信號分布于著絲粒附近，且其信號強度較弱；3H染色體長臂Oligo-442A01信號較強，(AGG)₅信號分布于著絲粒附近，且其信號強度較強；4H染色體長臂與短臂Oligo-442A01信號較強，(AGG)₅信號分布范圍較廣，主要位于著絲粒附近與短臂區域，且其信號強度在所有染色體組中是最強的；5H染色體短臂存在明顯的Oligo-442A01信號，(AGG)₅信號分布于著絲粒附近；6H染色體長臂與短臂Oligo-442A01信號較強，(AGG)₅信號分布于著絲粒附近，其信號強度較適中；7H染色體長臂與短臂均存在Oligo-442A01信號，但其信號強度最弱，(AGG)₅信號集中于著絲粒附近，其信號強度適中。

雖然，上文已經用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之做出一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川農業大學

<120> 一種原位雜交探針及其對大麥染色體組鑒定的方法

<130> KHP171110047.2TQ

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgaaactcgc attttggcc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagttcccg taaccggccc 20

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 大麥

<400> 3

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