鯉皰疹病毒3型1301株ORF136基因重組表達蛋白、抗體及其應用的制作方法

本發明屬于生物基因工程領域，具體涉及由鯉皰疹病毒3型1301株orf136基因重組表達蛋白、由orf136重組表達蛋白制備的多克隆抗體及其應用，進一步涉及多克隆抗體的制備方法。

背景技術：

鯉皰疹病毒3型(cyprinidherpesvirus3，cyhv-3)，又稱為錦鯉皰疹病毒(koiherpesvirus，khv)，是引起鯉魚、錦鯉及其變種高度傳染性錦鯉皰疹病毒病(koiherpesvirusdisease,khvd)的病原。該病自從1997年在歐洲發現以來，多個國家和地區都報道了由該疾病引起的鯉魚或錦鯉暴發性死亡現象，給鯉魚及錦鯉養殖產業帶來了嚴重的經濟損失。cyhv-3屬于皰疹病毒目，異皰疹病毒科，鯉皰疹病毒屬，是具有囊膜的雙鏈dna病毒，病毒顆粒直徑為167～200nm，基因組全長295kbp，兩端為22kbp的正向重復序列，共編碼164個開放閱讀框(openreadingframe,orf)，包括8個重復orf，是已知基因組最大的皰疹病毒。

目前，運用質譜學的方法已鑒定到46種病毒結構蛋白。其中，michel等運用液相串聯色譜技術在khv-fl株中鑒定到13種囊膜蛋白、3種核衣殼蛋白、2種皮層蛋白和22種未知蛋白共40種結構蛋白。隨后，yi等通過對亞洲型khv-gz10和歐洲型khv-gz11進行質譜鑒定，將鑒定的結構蛋白增加至46種。雖然通過蛋白質質譜鑒定對cyhv-3病毒蛋白有了一定的認識，但大部分蛋白的精確定位和功能研究仍處于空白，只有少數蛋白進行了較深入的鑒定，其中，orf81編碼蛋白是研究較多的結構蛋白之一。另外，fuchs等還對部分囊膜蛋白orf25、orf65、orf99、orf136、orf149和主要衣殼蛋白orf92進行了初步鑒定。

本發明選擇的orf136在亞洲型和歐洲型分離株中存在核苷酸序列差異，其完整開放閱讀框長度分別為474bp和462bp，該基因可作為cyhv-3分子分型的有效工具。雖然蛋白質譜分析顯示orf136編碼蛋白為結構蛋白，但未見具體的驗證，其深入的功能定位還不清楚，更多相關研究仍有待開展。

雖然目前已有很多cyhv-3的檢測診斷方法，但在實際廣泛應用中主要還是基于分子的檢測技術，血清學診斷并沒有得到廣泛的應用。尤其是對于潛伏感染的宿主來說，基于分子的檢測并不能判斷宿主體內是否存在病毒，而血清學診斷技術能彌補這個缺陷。基于免疫學的抗原檢測方法的建立，需要有能特異性識別cyhv-3的抗體。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明提供一種鋰皰疹病毒3型1301株orf136基因重組表達蛋白及其制備的多克隆抗體，進一步提供所述多克隆抗體用于檢測orf136基因病毒的應用，以及多克隆抗體的制備方法。

為解決上述問題，一方面，本發明在于提供一種鯉皰疹病毒3型1301株orf136基因重組表達蛋白，其全長氨基酸序列如seqidno:2所示。

另一方面，本發明在于提供一種編碼鯉皰疹病毒3型1301株orf136基因重組表達蛋白的核苷酸，其全長核苷酸堿基序列如seqidno:1所示。

一方面，本發明提供一種多克隆抗體，其是以氨基酸序列如seqidno:5所示的重組表達蛋白為抗原在免疫動物中制備所得。

進一步地，本發明所述如seqidno:5所示的氨基酸序列為seqidno:2所示的氨基酸序列的一部分；其具體制備過程為將鯉皰疹病毒3型1301株orf136基因進行pcr擴增后，得到重組克隆載體pmd18-t-orf136；將重組克隆載體pmd18-t-orf136、原核表達載體pet-32a(+)分別進行雙酶切后進行連接，構建重組原核表達載體pet-32a-orf136；將pet-32a-orf136轉化至大腸桿菌rosetta經iptg誘導表達后得到如seqidno:5所示的重組表達蛋白。

進一步地，本發明所述的多克隆抗體制備過程如下：將如seqidno:5所示的重組表達蛋白對兔子進行皮下多點注射免疫，免疫后進行采血；將血液靜置后，離心，收集血清，用親和純化的方式對抗血清進行純化，得到多克隆抗體。

另一方面，本發明在于提供一種本發明所述的多克隆抗體用于制備檢測鯉皰疹病毒3型的免疫工具的應用。本發明所述的免疫工具包括但不限于，試劑、試劑盒、芯片或試紙。

更進一步地，本發明所述的多克隆抗體在檢測、預防或治療鯉皰疹病毒3型感染引起的相關疾病中的應用。

另一方面，本發明在于提供一種檢測鯉皰疹病毒3型的試劑盒，含有本發明所述的鯉皰疹病毒3型1301株orf136基因重組表達蛋白的抗體。

另一方面，本發明提供一種制備本發明所述的多克隆抗體的方法，具體制備步驟如下：

1)擴增：以鯉皰疹病毒3型1301株dna為模板，設計特異性引物對orf136基因編碼蛋白第91～471位核苷酸區域進行pcr擴增，得到重組克隆載體pmd18-t-orf136；

2)構建：將重組克隆載體pmd18-t-orf136、原核表達載體pet-32a(+)分別進行雙酶切后連接，構建重組原核表達載體pet-32a-orf136；

3)表達：將pet-32a-orf136轉化至大腸桿菌rosetta經iptg誘導表達后得到如seqidno:5所示的重組表達蛋白；

4)制備：將如seqidno:5所示的重組表達蛋白在免疫動物中免疫后進行采血；對血液進行處理后得到多克隆抗體。

進一步地，本發明所述的一種制備本發明所述的多克隆抗體的方法，所述步驟2)中酶切的體系為：10×buffer2ul，ecori和xhoi各1ul，質粒1ug，補ddh2o水至20ul；37℃水浴酶切2h。

進一步地，本發明所述的一種制備本發明所述的多克隆抗體的方法，所述步驟2)中連接的體系為：t4ligase1.5ul，10×t4ligasebuffer1.5ul，pet-32a(+)3ul，酶切后的片段9ul；16℃連接過夜。

進一步地，本發明所述的一種制備本發明所述的多克隆抗體的方法，所述步驟3)中pet32a-orf136轉化至大腸桿菌rosetta中，篩選陽性克隆，接種于含有氨芐的lb培養基中，培養至od600為0.4，加入iptg進行表達誘導后，離心收集菌體，將菌體進行清洗、破碎、離心后收集包涵體蛋白，包涵體蛋白純化后得到重組表達蛋白。

進一步地，本發明所述的一種制備本發明所述的多克隆抗體的方法，所述步驟3)中菌體破碎采用冰上超聲波破碎。

進一步地，本發明所述的一種制備本發明所述的多克隆抗體的方法，所述步驟4)中重組表達蛋白在免疫動物中進行皮下多點注射免疫，免疫后進行采血；將血液靜置后，離心，收集血清，用親和純化的方式對抗血清進行純化，得到多克隆抗體。

進一步地，本發明所述特異性引物為

f:ccggaattcggcacaacaaccatgaactctacc(seqidno:3)(含ecori酶切位點，見下劃線部分)

r:ccgctcgagttagatttttctaaagtgcacgacgtc(seqidno:4)(含xhoi酶切位點，見下劃線部分)。

本發明通過生物信息學軟件，篩選khvorf136基因編碼蛋白第31～157位氨基酸區域為較完整的潛在b細胞抗原表位，構建pet-32a-orf136重組原核表達載體；通過iptg誘導表達后純化重組蛋白，經免疫兔子獲得多克隆抗體，并用純化的cyhv-3病毒和感染cyhv-3的ks細胞進行免疫印跡分析(westernblot)，并進一步采用間接免疫熒光實驗驗證抗體的檢測應用。orf136基因重組表達蛋白多克隆抗體的制備為orf136蛋白功能研究和cyhv-3血清學診斷方法的建立提供了重要材料。

本發明抗體的制備方法具有較高的回收率和較好的保持蛋白的生物活性，適合大規模純化和制備。本發明中多克隆抗體的純度高，易于產業化。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本發明提供一種鯉皰疹病毒3型1301株orf136基因重組表達蛋白，并將該蛋白產生多克隆抗體。該重組蛋白能用于鯉皰疹病毒3型的檢測應用。本發明提供一種能特異性識別cyhv-3的多克隆抗體，并提供制備的orf136基因重組表達蛋白多克隆抗體的方法，所述多克隆抗體能特異性識別純化的病毒和感染cyhv-3的細胞，在后續cyhv-3血清學診斷方法的建立中具有一定的應用價值，可用于臨床、實驗室檢測和流行病學研究。本發明提供的制備方法簡單，易操作。

附圖說明

圖1為cyhv-3orf136基因(第91～471位核苷酸)pcr擴增產物電泳圖；圖1中m為dlmarker2000；1為以khvdna為模板的pcr擴增產物；

圖2為重組質粒pet32a-orf136雙酶切鑒定結果；圖2中m為dlmarker10000；1為重組質粒pet32a-orf136雙酶切產物；2為空載體pet32a(+)雙酶切產物；

圖3為sds-page分析重組質粒pet32a-orf136表達產物；圖3中m為低分子質量蛋白質marker；1為pet32a-orf136誘導表達上清；2～4為pet32a-orf136誘導表達包涵體2倍、5倍和10倍稀釋；

圖4為westernblot分析orf136編碼蛋白抗血清特性；圖4中m低分子質量蛋白質marker；1為純化的cyhv-31301株；2為感染cyhv-3的ks細胞；3為未感染cyhv-3的ks細胞上清；4為未感染的ks細胞；

圖5為利用多克隆抗體檢測病毒感染的細胞；圖5中a為接種cyhv-31301株的ks細胞；b為未接種病毒的正常ks細胞對照。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。

以下實施例中所采用的分子生物學實驗技術包括pcr擴增、質粒提取、質粒轉化、dna片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規方法操作，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(sambrookj,russelldw，janssenk,argentinej.黃培堂等譯，2002，北京：科學出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1

步驟一、khv1301株orf136基因的擴增

根據genbank中cyhv-3orf136基因序列，用生物信息學軟件abcpred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)、bepipred1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/bepipred/)和dnastar子模塊protean預測orf136基因潛在b細胞抗原表位。

用primerpremier5.0設計特異性引物(特異性引物為：

f:ccggaattcggcacaacaaccatgaactctacc(seqidno:3)(含ecori酶切位點，見下劃線部分)，

r:ccgctcgagttagatttttctaaagtgcacgacgtc(seqidno:4)(含xhoi酶切位點，見下劃線部分)，

并由生工生物公司合成。

病毒基因組提取按血液/細胞/組織dna提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)中的說明書進行。

pcr反應體系：12.5ulrtaqmix、引物各1ul(10umol/l)和1uldna模板，補滅菌水至25ul。

反應程序如下：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，30個循環；72℃，7min。

以f/r為引物，針對orf136基因潛在b細胞抗原表位區域(即orf136基因編碼蛋白第91～471位核苷酸區域，即第31～157位氨基酸區域)，以鯉皰疹病毒3型1301株為模板進行pcr擴增，1.5％的瓊脂糖電泳分析顯示獲得一條與預期大小相符的條帶，片段大小為381bp(具體如圖1所示)。

步驟二、重組原核表達載體pet32a-orf136的構建

對步驟一擴增的重組克隆載體pmd18-t-orf136、原核表達載體pet-32a(+)分別進行雙酶切(酶為ecori和xhoi酶)，并將重組克隆載體插入片段和雙酶切后的原核表達載體進行連接，得到重組原核表達載體。實驗條件如下：

酶切體系為：10×buffer2ul，ecori和xhoi各1ul，質粒1ug，補ddh2o水至20ul。37℃水浴酶切2h。酶切后，電泳鑒定酶切效果，并對重組克隆中載體插入片段0rf136和雙酶切后的原核表達載體pet-32a(+)進行割膠回收。

連接體系：t4ligase1.5ul，10×t4ligasebuffer1.5ul，pet-32a(+)3ul，酶切后的片段9ul。16℃連接，過夜。

將連接產物轉化至dh5α感受態細胞，篩選陽性克隆進行菌液pcr。

將構建的重組原核表達載體pet32a-orf136進行雙酶切鑒定，獲得與預期大小相符的兩條條帶，表明重組原核表達載體構建成功(具體如圖2所示)。

步驟三、蛋白表達

將步驟二鑒定正確的重組原核表達載體pet32a-orf136轉化至大腸桿菌rosetta(de3)中，篩選陽性克隆，接種于含有氨芐的lb培養基中，在37℃下搖床培養至od600為0.4，加入終濃度為0.8mm的iptg進行表達誘導，4h后10000rpm/min離心5min收集菌體，進行少量表達鑒定。

將收集的菌體用pbs清洗2次后，重懸，在冰上超聲波破碎，10000rpm/min離心5min，分別收集上清和包涵體沉淀，運用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)進行鑒定。

sds-page分析，結果顯示獲得與目的大小相符的蛋白條帶，大小約為35kda(載體約為20kda，orf136第31～157位氨基酸預測蛋白分子量約為14kda)，且目的蛋白主要分布在包涵體中(圖3)。

參照ni-凝膠純化試劑盒的方法對包涵體蛋白進行純化，得到純化的重組表達蛋白，其氨基酸序列如seqidno:5所示。

步驟四、多克隆抗體制備與純化

將步驟三純化的重組表達蛋白對兔子進行皮下多點注射免疫(首次免疫采用弗氏完全佐劑，后三次免疫采用弗氏不完全佐劑，佐劑和重組表達蛋白體積比為1:1)，免疫66天后，進行頸動脈采血。將血液于37℃靜置1h后，3000rpm/min離心10min，收集血清，用親和純化的方式對抗血清進行純化，得到多克隆抗體，于-20℃下保存。

實施例2

sds-page與免疫印跡分析(westernblot)

聚丙烯酰胺凝膠由12％的分離膠和4％的濃縮膠組成，將純化的cyhv-31301株病毒、ripa裂解液裂解后感染cyhv-3的ks細胞和未感染cyhv-3的ks細胞分別與5×蛋白上樣緩沖液按比例混合后在沸水中加熱5min，冷卻后點樣進行電泳分析(200v，35min)。將sds-page分離后的凝膠用濕轉的方法轉移至硝酸纖維素膜，5％的脫脂奶粉室溫封閉1h，然后用封閉劑1:1000稀釋的實施例1步驟四得到的多克隆抗體室溫下孵育1h，接著用0.05％的pbst清洗3次，每次10min；最后用封閉劑1:10000稀釋的hrp標記羊抗兔igg室溫孵育1h，用0.05％的pbst清洗3次后進行dab顯色。

westernblot分析結果顯示，在15～25kda之間出現一條特異條帶(如圖4所示)，orf136編碼蛋白預測分子量約為17kda，與預期大小一致，說明本發明制備的多克隆抗體能特異性識別cyhv-3。

實施例3

間接免疫熒光試驗檢測感染細胞

將錦鯉吻端細胞(ks細胞)傳代至96孔細胞培養板中，待細胞長至單層鋪滿80％左右后，感染cyhv-31301株病毒；感染病毒5d后，將細胞培養板中的培養基吸盡，用0.01mol/l的pbs洗滌3次，加入80％的丙酮溶液室溫孵育30min，吸去丙酮，室溫干燥1h；每孔加100μl1：1000稀釋的兔抗orf136蛋白多克隆抗體，37℃孵育1h，pbst洗滌3次，加入1:50稀釋的羊抗兔igg-fitc標記的熒光二抗100μl，37℃孵育1h；pbst洗滌3次，最后加入細胞核染料碘化丙啶(pi)作用5min，熒光倒置顯微鏡(nikon，eclipseti-s)下觀察結果。陰性對照為未感染病毒的正常ks細胞。

間接免疫熒光實驗的結果顯示，制備的多克隆抗體能使感染cyhv-31301毒株的ks細胞能產生特異性的熒光(見圖5a)，而在未感染病毒的正常ks細胞中觀察不到熒光信號(圖5b)。

以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

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<110>中國水產科學研究院珠江水產研究所

<120>鯉皰疹病毒3型1301株orf136基因重組表達蛋白、抗體及其應用

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