本發明屬于生物技術領域。具體而言，本發明涉及一種重組蛋白的編碼序列、重組蛋白及其單克隆抗體的制備方法。
背景技術：
標簽蛋白抗體(Tag-antibody)是一類經過親和純化的小鼠單克隆抗體。用于檢測各種商品化表達載體上的標簽序列（如：MyC、His、GST、HA等），籍以分析檢驗目的蛋白的表達含量及其功能。其原理是抗原-抗體反應，這些標簽抗體可以高度特異地結合對應的標簽融合蛋白。標簽抗體是開展基因蛋白表達、信號轉導和基因功能研究的常用工具。
常規的標簽蛋白單克隆抗體制備所使用的免疫原是基因工程技術表達的完整蛋白，但由于堿基密碼子的緣故，該蛋白在大腸桿菌中表達困難，表達量極低，導致后續的純化工作難以開展，嚴重阻礙其單克隆抗體的制備。另外，標簽蛋白種類繁多，每種標簽蛋白單獨制備，耗時長、成本高，不利于市場的廣泛推廣和使用。
技術實現要素：
本發明旨在避免背景技術中的不足之處，通過設計一種重組蛋白并制備其單克隆抗體，從而實現同時制備多種標簽蛋白單克隆抗體，既增強了檢測靈敏度，又可以同時制備多種抗體。
為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
所述重組蛋白的編碼序列如SEQ ID NO.1所示。
所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述重組蛋白表達載體是含有SEQ ID NO.1所示編碼序列的質粒載體。
上述重組蛋白和重組蛋白表達載體可用于制備標簽蛋白單克隆抗體。
所述標簽蛋白單克隆抗體的制備方法包括如下步驟：
（1）合成SEQ ID NO.1所示的重組蛋白編碼序列，并將該重組蛋白編碼序列連接質粒載體，進而構建重組蛋白表達載體；
（2）將重組蛋白表達載體轉化大腸桿菌，篩選得到重組蛋白表達菌株；
（3）將重組蛋白表達菌株大規模培養后，經純化獲取重組蛋白，所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
（4）將重組蛋白多次免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾臟細胞與sp2/0骨髓瘤細胞融合，經過多輪篩選和多指標鑒定分別獲得針對重組蛋白所對應的標簽蛋白單克隆細胞株，再由標簽蛋白單克隆細胞株制得標簽蛋白單克隆抗體。
下面對本發明作進一步說明：
本發明首先以4種標簽結合蛋白（6xHis、S Tag、Trx和GST）為靶抗原，序列比較結果顯示所選擇的該抗原表位與其它蛋白序列無明顯同源性。
其次，為了促進所選擇抗原表位對BALB/c小鼠免疫系統的刺激，增強免疫效果，故分別將所選擇的四個優勢抗原表位序列重復后通過柔性片段（連續四個甘氨酸）連接，形成重組蛋白氨基酸序列。
第三步，采用大腸桿菌偏愛密碼子，將重組蛋白氨基酸序列轉換為對應的核苷酸序列，以利于重組蛋白在大腸桿菌中的表達以提高表達量。
第四步，化學合成上一步驟得到的核苷酸序列，并通過酶切連接，將合成得到的核苷酸片段插入表達載體PET-28a(+),構建重組蛋白表達載體。
第五步，重組蛋白表達載體轉化大腸桿菌ER2566感受態細胞，篩選得到重組蛋白表達菌株。
第六步，重組蛋白表達菌株大規模培養后，超聲破菌并低溫離心后，取溶液上清通過鎳瓊脂糖親和層析柱親和層析，洗脫得到純化重組蛋白。
第七步，純化后的重組蛋白多次免疫BALB/c小鼠后，取其脾臟細胞與sp2/0骨髓瘤細胞融合，經過多輪篩選并最終分別得到雜交瘤細胞株。
第八步，將雜交瘤細胞株分別制備BALB/c小鼠腹水，使用辛酸-硫酸銨法及Protein G分兩步純化單克隆抗體。
與現有技術相比，本發明的有益效果為：
一是通過分子生物學技術，實現了四種標簽結合蛋白抗原表位的重復及串聯表達，增強目的抗原表位對小鼠免疫系統的刺激，排除了無關序列可能帶來的干擾；
二是作為免疫原的重組蛋白僅含有四種標簽蛋白抗原表位，保證了最終得到的單克隆抗體僅特異性識別該四種標簽蛋白，并篩選同時得到四種標簽蛋白，提高了檢測的靈敏度，降低實驗成本。
三是采用大腸桿菌偏愛密碼子優化重組蛋白對應的核苷酸序列，從而大大提高了重組蛋白在大腸桿菌中的表達水平。
具體實施方式
一、4種標簽蛋白抗原表位選擇
以4種標簽蛋白為靶抗原，利用生物軟件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的親水性及抗原性，分別選擇6xHis、S Tag、Trx和GST抗原表位A、B、C和D。同時，序列比較結果表明所選擇的A、B、C和D抗原表位序列特異性高，與其它蛋白序列無明顯同源性。
二、4種標簽蛋白抗原表位的串聯
為增強所選擇抗原表位對小鼠免疫系統的刺激以利于后續實驗的進行，將標簽蛋白A、B、C和D四種抗原表位序列分別通過柔性片段（連續四個甘氨酸）連接，得到重組蛋白氨基酸序列，其具體序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
三、優化編碼重組蛋白的核苷酸序列
為了提高重組蛋白在大腸桿菌中的表達量，在重組蛋白氨基酸序列不變的前提下,根據大腸桿菌偏愛密碼子將編碼重組蛋白的氨基酸序列轉化為對應的核苷酸序列，具體序列如序列表SEQ ID NO.1所示，并在其上下游分別添加酶切位點BamHI和EcoRI對應的核苷酸序列后，由杭州賢至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因克隆于pMD19-T載體(寶生物工程大連有限公司)中。
四、構建重組蛋白表達載體
用限制性內切酶BamHI和EcoRI(寶生物工程大連有限公司)于37℃分別雙酶切含目的基因的pMD19-T載體和PET-28a(+)載體（德國Novagen公司）12小時，酶切產物分別行1％瓊脂糖凝膠電泳，并分別切膠回收目的基因和PET-28a(+)載體（本發明所使用的膠回收試劑盒均來自寧波中鼎生物技術有限公司）。使用T4連接酶(寶生物工程大連有限公司)將回收的目的基因和PET-28a(+)載體按一定的比例于4℃連接12小時后，連接產物轉化DH5α感受態細胞（杭州賢至生物科技有限公司），并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃恒溫培養12小時之后，于平板上挑取單克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液體培養基，37℃恒溫搖床培養12小時后，采用質粒純化試劑盒（本發明所使用的質粒純化試劑盒均來自于寧波中鼎生物技術有限公司）提取質粒，經BamHI和EcoRI雙酶切鑒定后得到正確的重組表達載體。
五、構建重組蛋白E表達菌株
將構建好的重組表達載體轉化E.coli ER2566感受態細胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃過夜培養。第二日，挑取平板上單克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液體培養基，37℃恒溫搖床培養8小時后，加誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（終濃度為1.0mmol/L）誘導表達4個小時后制備蛋白電泳樣品。13.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳結果表明重組蛋白成功表達，得到重組蛋白表達菌株。
六、純化重組蛋白F
接種重組蛋白表達菌株至LB液體培養基，加卡那青霉素至終濃度為50μg/mL，37℃恒溫搖床培養8小時后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液體培養基將該菌按1：100比例稀釋后，分裝至細菌培養瓶中，置37℃恒溫搖床培養至OD600=0.8，加誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷至終濃度為1.0mmol/L，繼續培養誘導4小時。離心收集菌體后，低溫超聲破菌，低溫離心后取上清通過鎳瓊脂糖親和層析柱,經洗滌、洗脫最終得到純化重組蛋白。
七、構建用于檢測的偶聯蛋白
將標簽蛋白A、B兩個抗原表位序列分別在N端連接一個半胱氨酸，合成G、H序列多肽，載體蛋白選擇BSA（Roche公司），用SPDP（PIERCE公司）連接法將合成的多肽分別與BSA偶聯：4.6mg SPDP溶解740ul DMSO,終濃度為20mM。0.1008g BSA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中，室溫靜置1h。HiTrapTM Deaslting column脫鹽柱洗脫多余的SPDP。4mg多肽加入偶聯好的BSA-SPDP體系中室溫過夜，得到產物BSA-G、BSA-H（由杭州賢至生物科技有限公司合成）。將蛋白GST和TRX（購買于杭州畢肯萊博生物科技有限公司）命名為I、L。
八、雜交瘤細胞株的獲得
取5-7周齡雌性BALB/c小鼠，基礎免疫每只小鼠皮下多點注射福氏完全佐劑乳化的70μg重組蛋白；15天后進行加強免疫，方法為取相同量的重組蛋白用福氏不完全佐劑乳化后，皮下多點注射；第三次加強免疫在15天以后，方法同第二次相同。30天后，取120μg重組蛋白腹腔加強注射，并于腹腔加強注射72小時后，眼眶取血，并處死小鼠，取其脾臟制備細胞懸液，細胞計數，按1/5于脾細胞的數量取生長狀態良好的sp2/0小鼠骨髓瘤細胞，混和離心后，加入聚乙二醇（PEG-4000）使二者融合。另外，再加入等體積的飼養細胞，混勻后分置于96孔細胞板（200μL/孔），于5％二氧化碳培養箱培養。5天后，半保留換液，10天后采用間接酶聯免疫吸附法檢測96孔細胞培養板中的雜交瘤細胞培養上清。
具體方法如下：
蛋白BSA-G、BSA-H、I、L分別通過包被液稀釋后（終濃度為1μg/mL），以100μL/孔加入酶標板（深圳金燦華實業有限公司）,4℃包被12小時后用洗滌液洗滌一次并拍干；加入封閉液，150μL/孔，37℃封閉2小時，棄孔內液體，拍干；分別加待檢細胞培養上清及對照血清, 100μL/孔，37℃孵育1小時后，洗滌液洗滌三次并拍干；加HRP（辣根過氧化物酶）標記的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育30分鐘后，洗滌液洗滌四次并拍干；每孔加顯色液A和顯色液B各50μL，37℃避光顯色10分鐘后，加終止液終止反應，50μL/孔，酶標儀450nm波長空白孔校零后讀取OD值。以免疫小鼠的血清作為陽性對照，相關溶液配方如下：
包被液：Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g, 加雙蒸水定容至1000mL(pH9.6)。
封閉液：Na2HPO4.12H2O 2.68g, NaH2PO4.2H2O 0.39g, NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
洗滌液：Na2HPO4.12H2O 2.68g, NaH2PO4.2H2O 0.39g, NaCl 8.5g，Tween-20 0.5mL，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
顯色液A: 200mg TMB 溶于100mL無水乙醇，加雙蒸水定容至1000mL。
顯色液B: 檸檬酸2.1g,Na2HPO4.12H2O 71g,加雙蒸水定容至1000mL。
使用時：1mL顯色液A＋1mL顯色液B+0.4μL 30%H2O2
終止液：2M H2SO4, 21.7mL濃H2SO4加雙蒸水定容至1000mL。
對于檢測陽性的雜交瘤細胞克隆，再使用有限稀釋法進行亞克隆。經過三次亞克隆，分別篩選得到6xHis 3株雜交瘤細胞株（1F4、8B6、3D7、），S Tag 2株雜交瘤細胞株（5D6、2C3）；Trx 5株雜交瘤細胞株（4F4、6B7、3G7、6T5、7H5）；GST3株雜交瘤細胞株（7F4、2C7、6D7）。
最后將雜交瘤細胞株分別制備BALB/c小鼠腹水，使用辛酸-硫酸銨法及Protein G分兩步純化單克隆抗體。