一種dbat突變酶r363h及其應用
【技術領域】
[00011本發明屬于生物分子催化領域，特別涉及一種DBAT酶（10-去乙酰基巴卡亭II1-10 β乙酰基轉移酶)突變酶R363H及其應用。
【背景技術】
[0002] 定制酶一直是生物化學家奮斗的目標。隨著分子生物學技術的逐漸成熟，對蛋白 序列進行任意修改，可以解讀酶的催化機理并繼續理性設計酶。這種理性設計可以是增加 已有酶的性質，甚至是重新設計一個蛋白質。
[0003] 高催化活性酶是在生物產業中發揮重要潛能的關鍵所在，也是現代蛋白質工程研 究的主攻方向。新型催化劑的理性設計往往會拓展我們對蛋白生化特性的認識，尤其是那 些錯誤少、時間使用合理的蛋白質理性改造過程。目前已利用理性設計突變位點技術對天 然酶蛋白的催化活性、抗氧化性、底物特異性、熱穩定性以及改進酶的別構效應等進行了成 功的改造 (Kries et al. ,2013)。然而，理性設計方法僅適用于三維結構清楚、結構和功能 的相互關系也較清楚的酶。
[0004] 目前理性設計的思路仍然主要是由Hell inga和Richards于1991年提出的給蛋白 增加新的結合位點的觀點。實際操作中，第一步在蛋白分子內引入新的功能域，第二步再進 行優化（Feldmeier et al.，2013;Koga et al. ,2012)。
[0005] 酶活性中心是酶催化的核心部位，其特定的構象不僅有助于底物結合，還能促進 高效的催化作用。因此對酶活性位點改造相較整體蛋白質的改造能更為直接，更為顯著的 提升酶的催化活性(Kiss et al.，2013)。但是，酶的活性中心需要十分精確的構象調節，它 既需要一定的柔性去識別底物，完成催化反應，又需要一定的剛性維持合理的構象，來保持 良好的生物學活性;酶的活性中心保持著柔性與剛性間的微妙平衡，隨意對活性中心的突 變，會導致酶的迅速失穩或者失活(Hilvert，2013)。
[0006] 隨著學者們對酶結構與功能關系認知的逐步完善，計算生物學的迅猛發展，利用 計算機輔助設計進化酶學性質的方法也日趨成熟。利用計算機模擬的方法，可以快速鑒定 與催化直接相關的不可突變的氨基酸和有可能提升酶活性的靶標位點，為蛋白質工程改造 提供快速的指導。
[0007] 本發明通過合成生物學的手段，研究10-去乙酰巴卡亭m乙酰基轉移酶的底物拓 展和理性設計新酶，建立合成巴卡亭m的新方法。本發明能通過高效制備巴卡亭m從而極 大的改善紫杉醇供不應求的現狀。
【發明內容】
[0008] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的首要在于提供一種DBAT突變酶 R363H。該DBAT突變酶R363H比野生型DBA!1酶具有更高的催化效率。
[0009] 本發明的另一目的在于提供上述DBAT突變酶R363H的應用。
[0010] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0011] 本發明提供一種DBAT突變酶R363H，是氨基酸序列為SEQ ID如:2的0841'酶的第 363位氨基酸由精氨酸(Arg)變為組氨酸(His)。
[0012] 上述DBAT突變酶R363H的氨基酸序列為SEQIDN0:14，其編碼基因的核苷酸序列 為SEQ ID N0:13。
[0013] 本發明另一方面涉及攜帶具有編碼序列為SEQ ID NO:13的DBAT突變酶R363H基因 的重組質粒，所述的重組質粒為PET-R363H。
[0014] 本發明還涉及一種工程菌株，其攜帶上述重組質粒。
[0015] 所述的工程菌株為重組表達菌株TBL21-R363H，即重組質粒轉化進宿主大腸桿菌 (Escherichia coli)BL21 所得。
[0016] 所述的DBAT突變酶R363H在催化10-DAB合成巴卡亭ΙΠ 中的應用。以乙酰輔酶A為酰 基供體時，該DBAT突變酶R363H比DBA!1酶的催化效率提高了 12倍。
[0017] 以酰基供體1、酰基供體2、酰基供體3、酰基供體4、酰基供體5、酰基供體6或酰基供 體7為酰基供體時，所述的DBAT突變酶R363H比DBA! 1酶具有更高的催化效率。
[0018] 所述的酰基供體1為乙酸乙烯酯;所述的酰基供體2為乙酸丁酯;所述的酰基供體3 為乙酸異丁酯;所述的酰基供體4為乙酸仲丁酯;所述的酰基供體5為乙酸戊酯;所述的酰基 供體6為乙酸異戊酯;所述的酰基供體7為乙酸異丙烯酯。
[0019] 本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：
[0020] 本發明運用同源建模，分子對接的計算機輔助技術，對DBAT酶進行理性設計，成功 構建出突變酶R363H。該突變酶在利用乙酰輔酶A的催化效率上比野生型酶提高了 12倍，大 大提高了乙酰輔酶A的使用率和產物巴卡亭m的產量。同時，為降低生產成本，本發明尋找 了 7種新型酰基供體，突變酶均能高效利用這些酰基供體，其中對乙酸乙烯酯的利用率提高 了 100倍，能作為替代乙酰輔酶A成為合成底物用于制備巴卡亭ΙΠ 。迄今為止，在生物合成巴 卡亭m的研究中，并未發現有以非植物輔酶類為酰基供體并體現高利用率的研究。
【附圖說明】
[0021] 圖1是各突變酶的SDS-PAGE結果。
[0022] 圖2是各突變酶純化后的SDS-PAGE結果。
[0023]圖3是突變酶D166H催化不同濃度酰基供體1、5、7產生巴卡亭ΙΠ 的結果。
[0024]圖4是突變酶R363H催化不同濃度酰基供體1、7產生巴卡亭ΙΠ 的結果。
[0025] 圖5是突變酶D166HR363H(簡稱DHRH)催化不同濃度酰基供體1、6、7產生巴卡亭ΙΠ 的結果。
[0026] 圖6是DHRH、R363H和D166H分別相對野生型DBAT在利用酰基供體1、2、3、4、5、6上的 效率對比圖。
【具體實施方式】
[0027]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0028]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件。
[0029] 實施例1野生型DBAT的獲得
[0030] 在NCBI上公布的DBAT酶的基因序列SEQ ID N0:l(GenBank:JQ029678.1)，在其起 始密碼子ATG前增加 GGAATTC(EcoRI酶切位點），在其終止密碼子TGA后增加 GCGGCCGCTTTA (Not I酶切位點），獲得帶有酶切位點的DBA!1酶的基因序列。
[0031] 用限制性內切酶EcoRI和NotI(Invitrogen公司）對DBA!1酶的基因進行雙酶切；同 時，用限制性內切酶EcoRI和Notl對pET-32a( + )載體(Invitrogen公司）進行雙酶切。使用凝 膠純化試劑盒將酶切產物純化，并用T4DNA連接酶（Invitrogen公司）將上述兩個酶切產物 連接。將連接產物轉化入E.coli DH5a感受態細胞（Invitrogen公司）中，質粒小量提取，酶 切鑒定，PCR(引物是dbat-F和dbat-R)鑒定后送測序確定表達載體構建成功，命名為pET-DBAT。重組質粒轉化E·co 1 i BL21 (Invitrogen公司），獲得重組表達菌株TBL21-DBAT。所述 DBAT的氨基酸序列為SEQ ID N0:2(GenBank:AFD32413.1)。
[0032] dbat-F: 5' -GGAATTCATGGCAGGCTCAACAGAAT-37 ;(下劃線為EcoRI酶切位點）
[0033] dbat-R：57 -ATTTGCGGCCGCTCAAGGTTTAGTTA-37 ;(下劃線為Notl酶切位點）
[0034] 實施例2DBAT突變酶的獲得
[0035](一)利用全質粒PCR方法構建突變酶載體 [0036] 1、重組質粒pET-DBAT的質粒小量提取；
[0037] 2、以質粒pET-DBAT為模板，結合兩端突變引物，利用重疊延伸PCR技術，擴增出含 有突變位點的dbat質粒，PCR體系如下：
[0038]
[0039] 所述的Primer-F和Primer-R需要根據不同的突變酶進行相應的變化，具體如表1 所示。
[0040] 引物對D166AF和D166AR用于獲得DBAT突變酶D166A，其氨基酸序列為SEQ ID N0: 4,編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:3。
[0041 ] 引物對D166HF和D166HR用于獲得DBAT突變酶D166H或D166HR363H;DBAT突變酶 D166H的氨基酸序列為SEQ ID N0:6,編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:5;DBAT突變酶 D166HR363H的氨基酸序列為SEQ ID N0:8,編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:7。
[0042] 引物對H162AF和H162AR用于獲得DBAT突變酶H162A或H162AR363H;DBAT突變酶 H162A的氨基酸序列為SEQIDN0:10，編碼核苷酸序列為SEQIDN0:9;DBAT突變酶 H162AR363H的氨基酸序列為SEQ ID N0:12,編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:11。
[0043] 引物對R363HF和R363HR用于獲得DBAT突變酶R363H或D166HR363H;DBAT突變酶 R363H的氨基酸序列為SEQIDN0:14，編碼核苷酸序列為SEQIDN0:13 ;DBAT突變酶 D166HR363H的氨基酸序列為SEQ ID N0:8,編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:7。
[0044] PCR擴增程序:預變性98 °C 3min;循環設定:變性98 °C 15s，退火56 °C 15s，延伸72 °C 8min，20個循環;最后延伸：72°C 10min;反應完成后，利用E.Z.N,A