本發明涉及一種ampc基因的實時pcr快速檢測系統，屬于實時pcr應用技術領域。
背景技術：
耐藥菌的危害已遍及全球，耐藥性問題成為世界性的新的研究熱點。自從第一個抗生素——青霉素發現以來，人類研制、開發了多種抗菌藥物，成功地控制和治療了由細菌引起的感染性疾病。然而，隨著抗生素的不斷應用，細菌的耐藥性問題越來越突出，越來越嚴重。2000年6月12日路透社報道世界衛生組織的觀點：假若人們繼續濫用抗生素，對一切藥物產生抵抗的“超級細菌”將把人類帶回到舊時代，一些小小的感染也會使人喪命。耐藥菌產生之快、傳播之迅速、耐藥率之高引起世界性廣泛關注。耐藥菌的危害十分嚴重，它不僅使藥物療效減弱，藥物劑量極大，療程延長，復發率升高，治療費用增加，有時還引起并發癥，某些情況下甚至會使抗生素失去療效導致病人死亡率升高。細菌耐藥性的出現和耐藥細菌的感染常使經驗型治療難以奏效，給臨床抗感染治療帶來極大的挑戰。因此，及時準確地檢測細菌的耐藥性，對細菌耐藥性的變遷和某些重點的耐藥細菌進行長期的監測和分析，可為臨床抗感染治療方案的擬定提供有益幫助。
在臨床病原菌的各種耐藥問題中，以青霉素和頭孢菌素為代表的β-內酰胺類抗生素的耐藥問題尤其突出，給臨床治療感染性疾病帶來極大困難。β-內酰胺類抗生素是現有的抗生素中使用最廣泛的一類，它系指化學結構中具有β-內酰胺環的一大類抗生素，主要包括青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類、碳青霉烯類、單環β-內酰胺類。β-內酰胺類抗生素通過抑制細菌胞壁的粘肽合成酶，阻礙細胞壁的合成而起到殺菌作用。針對β-內酰胺類抗生素，細菌在進化與繁殖過程中也產生了一套防衛機制，其中最重要的方式是產生β-內酰胺酶。β-內酰胺酶可以水解β-內酰胺環中的酰胺鍵，使之轉化成為無活性的衍生物而失去殺菌作用，這是革蘭陰性桿菌耐β-內酰胺類抗生素的主要機制。
β-內酰胺酶種類繁多、特性各異，目前已發現的β-內酰胺酶超過300種，其中頭孢菌素酶(ampc酶)是臨床較為常見的β-內酰胺酶，具有重要的檢測意義。質粒ampc酶高水平持續表達，且可通過轉化、接合等方式轉移給其它菌種，造成耐藥性的廣泛傳播。目前，在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、奇異變形桿菌、沙門氏菌屬中都已發現質粒介導的ampc酶。質粒ampc酶危害嚴重，這是因為一種質粒可同時攜帶多個耐藥基因，使得產ampc酶的菌株表現出多重耐藥性，而且耐藥譜呈現擴大趨勢。另一方面，質粒的可傳遞性，使耐藥問題越來越嚴峻，容易引起醫院感染的暴發流行。
要減緩和控制耐藥菌株的產生，建立一種可靠的檢測方法是關鍵，而如何快速、準確的檢測質粒介導的ampc酶是目前臨床實驗室面臨的一個普遍難題。目前用于實驗研究和臨床檢測的常見方法主要有以下幾種：頭孢西丁紙片法、頭孢西丁三維試驗、等點聚焦電泳/抑制試驗和基因檢測方法。前三種方法是利用耐藥表型篩選法或抑制劑篩選法對ampc酶進行檢測，其缺點是耗時、特異性差、操作繁瑣、檢測結果易受環境因素影響，所以假陽性率高。基因檢測方法可以有效彌補表型檢測的缺點，目前使用比較多的是傳統pcr方法和dna芯片方法。傳統pcr方法根據質粒ampc基因的同源性設計群特異性引物，通過pcr對質粒ampc基因進行擴增。但該方法需要對pcr產物進行電泳分析，開管操作易產生氣溶膠污染，導致假陽性結果出現。dna芯片方法通過pcr過程對擴增產物進行標記，若標記的產物與dna芯片上的探針發生雜交，即可證明有耐藥基因的存在。dna芯片技術雖然在檢測通量上有很大優勢，但卻需要pcr擴增、雜交、洗脫、檢測熒光等一系列操作步驟，而且成本高，難以在臨床實驗室推廣。由于上述種種原因，很多臨床實驗室很難準確及時的檢出質粒介導的ampc酶。
技術實現要素：
針對上述問題，本發明提供了一種ampc基因的實時熒光定量pcr快速檢測系統，具體涉及質粒ampc基因的檢測。本發明可以有效彌補現有檢測方法的不足。本發明提供了一種簡便、準確的檢測質粒ampc基因的快速檢測系統。本發明的技術方案如下：
一種ampc基因的實時熒光定量pcr快速檢測系統，其中，分子信標探針是一種含有“莖-環”結構，分子信標探針的核苷酸序列如seqno.1所示；
本發明的特異性引物為：
上游引物f：5’-atagtattggaatacgttatta-3’；
下游引物f：5’-tatgcactagaatatgagtc-3’。
本發明分子信標探針的莖部分是由于核酸分子的5′和3′末端的堿基配對而形成的，位于莖部分的5′端和3′端分別標記熒光基團和淬滅基團。環部分與構成莖的兩條鏈相連，并與待檢靶序列互補。未與靶序列雜交時，分子信標呈莖-環構象，熒光基團與淬滅基團彼此鄰近，二者之間發生能量轉移，使熒光基團發射出來的熒光被淬滅基團所吸收，所以觀察不到熒光；當分子信標探針與靶序列雜交時，莖-環結構打開，熒光基團與淬滅基團分開，淬滅基團不再能有效地吸收由熒光基團發出的光。因此，分子信標探針與其靶核酸序列的結合即伴隨著熒光發射的增加，并據此構成檢測的基礎。分子信標實時熒光pcr技術提高了探針與待檢靶序列的雜交效率，具有特異性強、敏感性高、便捷等特點。
本發明與現有技術相比具有以下優點：
利用實時pcr技術的多種優勢，并將特異的分子信標探針引入到其中，探索建立一種簡便、準確的檢測質粒ampc基因的快速檢測系統。與現有的基因檢測方法相比，本方法可以對pcr反應的擴增動力學過程進行實時監控，整個過程為全封閉反應和檢測，在2h內可由儀器自動完成，大大減少了模板污染和假陽性的可能；結果直觀客觀，避免人為判斷，簡便快速；通過使用96孔或384孔實時pcr儀可實現高通量檢測。如果應用于臨床可以大大減少誤用的抗生素處方率，幫助醫生選用針對性更強的抗生素，縮短療程，減輕細菌耐藥性產生和擴散的選擇壓力，延緩耐藥菌株的出現。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
ampc基因如seqno.2所示。
實施例1本發明ampc基因的實時熒光定量pcr快速檢測系統
本發明實時熒光定量pcr快速檢測系統中的分子信標探針是一種含有“莖-環”結構，分子信標探針的核苷酸序列如seqno.1所示；
本發明的特異性引物為：
上游引物f：5’-atagtattggaatacgttatta-3’；
下游引物f：5’-tatgcactagaatatgagtc-3’。
試驗例1
以大腸埃希菌(市售)為試驗菌株，利用普通pcr和本發明檢測系統進行檢測，結果顯示，普通pcr中的陽性率為3.5％，而本發明的陽性率為0。