梨果實不同發育時期熒光定量內參基因的篩選及應用的制作方法

本發明涉及分子生物學研究領域，具體涉及梨果實發育過程中實時熒光定量pcr內參基因的篩選及其應用。

背景技術：

梨(pyrus)是我國的主栽果樹之一，栽培歷史悠久，栽培區域涵蓋全國各地，栽培面積和產量一直居世界首位。近年來，我國科研工作者圍繞梨從分子生物學層面開展了眾多研究，尤其2012年5月世界首個梨全基因組測序、組裝和基因注釋工作完成后，基因表達分析已經廣泛應用于揭示梨果實基因調控機理的研究中。

實時熒光定量pcr具有靈敏度高、重復性好、特異性強和高通量等特點，目前廣泛地應用于農學、醫學、微生物學等眾多研究領域。然而，rna的質量和產量、反轉錄效率的差異等因素都會對目的基因表達分析結果的準確性產生影響，因此要精確判斷特定靶基因表達的水平，需要選擇合適的內參基因對目標基因的表達水平進行校正和標準化，減小檢測樣本本身對定量結果的影響。這也進一步說明合適的內參基因是精確分析qrt-pcr結果的重要前提，篩選穩定的內參基因在基因表達分析中起著關鍵的作用。

理想的內參基因應該是不受生長階段，組織器官，以及實驗處理條件的影響。然而，大量的研究結果表明，并沒有這樣理想的穩定基因。梨樹中常用的傳統看家基因有肌動蛋白基因actin、微管蛋白基因β-tubulin、轉錄延伸因子基因ef-1α、多聚泛素蛋白基因ubiquitin等，這些基因表達較為穩定，本身拷貝數高，在不同器官、組織或者細胞中組成型表達，具有相當的保守性，表達水平能夠保持一致。但是越來越多的報道指出，在不同的生長階段或者實驗條件下，傳統的管家基因作為內參基因熒光定量pcr的結果迥異，并不能夠穩定表達，有時會導致結論相反，不能真實的反映出基因的表達水平。隨著rna-seq技術的快速發展，根據實驗目的和組織器官，篩選鑒定開發出新的穩定表達的內參基因是解決傳統看家基因弊端的有效途徑。

本發明基于rna-seq比較基因表達差異以篩選梨果實發育相關基因的研究過程，從中挖掘表達量較高并且表達穩定的基因作為梨果實候選內參基因，并通過具體的試驗驗證，以及利用genorm、normfinder、bestkeeper和refinder4種軟件從不同統計學角度分析驗證候選內參基因在果實的整個發育階段中的表達穩定性。本發明成功發現了梨果實發育過程中穩定的內參基因，并對后期通過qrt-pcr探索梨果實關鍵基因奠定了堅實的基礎。

技術實現要素：

1、要解決的技術問題

為梨果實發育過程中相關基因表達分析提供更可靠的內參基因，以克服上述背景技術中傳統看家基因的缺點和不足，更精確的驗證基因表達水平，為挖掘梨果實發育中的有意義的基因奠定基礎。

2、技術方案

本發明所解決的技術問題采用以下技術方案來實現：

梨果實不同發育時期熒光定量內參基因，包含以下(1)～(3)中的至少一種：

(1)翠冠梨果實不同發育時期熒光定量內參基因為pbr028511，該內參基因pbr028511的核苷酸序列如seqidno:1所示；

(2)豐水梨果實不同發育時期熒光定量內參基因為pbr038418，該內參基因pbr038418的核苷酸序列如seqidno:2所示；

(3)雪青梨果實不同發育時期熒光定量內參基因為pbr041114，該內參基因pbr041114的核苷酸序列如seqidno:3所示。

上述梨果實不同發育時期熒光定量內參基因的特異性引物，其在于：

(1)所述pbr028511基因的特異性引物如seqidno:4和seqidno:5所示；

(2)所述pbr038418基因的特異性引物如seqidno:6和seqidno:7所示；

(3)所述pbr041114基因的特異性引物如seqidno:8和seqidno:9所示。

上述的內參基因或上述的特異性引物在制備熒光定量試劑盒中的應用。

一種梨果實不同發育時期熒光定量試劑盒，其包含上述特異性引物中的至少一種。

上述的梨果實不同發育時期熒光定量試劑盒中還包含pcr技術常用試劑。

基因pbr028511、pbr038418和pbr041114中的至少一種作為梨果實不同發育時期熒光定量內參基因的應用，基因pbr028511的核苷酸序列如seqidno:1所示；基因pbr038418的核苷酸序列如seqidno:2所示；基因pbr041114的核苷酸序列如seqidno:3所示。

上述的應用，其在于：

(1)所述的基因pbr028511作為翠冠梨果實不同發育時期熒光定量內參基因；

(2)所述的基因pbr038418作為豐水梨果實不同發育時期熒光定量內參基因；

(3)所述的基因pbr041114作為雪青梨果實不同發育時期熒光定量內參基因。

上述的應用，其在于：

(1)所述pbr028511基因的特異性引物如seqidno:4和seqidno:5所示；

(2)所述pbr038418基因的特異性引物如seqidno:6和seqidno:7所示；

(3)所述pbr041114基因的特異性引物如seqidno:8和seqidno:9所示。

上述的內參基因pbr028511、pbr038418和pbr041114或上述的試劑盒在相對定量法實時熒光定量pcr中的應用。

上述的內參基因pbr028511、pbr038418和pbr041114或上述的試劑盒在相對定量法實時熒光定量pcr中的應用，其在于：在翠冠、豐水和雪青果實不同發育時期功能基因表達試驗中采用所述的內參基因定量，所述基因在相對定量法實時熒光定量pcr中作為內參基因使用。

本發明所述梨果實不同發育時期熒光定量內參基因的篩選過程為：

(1)結合翠冠、豐水和雪青梨品種從幼果到成熟果動態發育過程轉錄組測序結果分析，篩選在梨果實發育中表達水平相對穩定的基因作為候選內參基因；

(2)在每個測序梨品種中，選取更多發育階段的果實，利用高質量的rna逆轉錄成相同濃度的cdna，再通過熒光定量pcr檢測候選內參基因及對照的看家基因微管蛋白基因(tub)的表達量。

(3)根據每個品種的多個時期表達水平，通過genorm、normfinder和bestkeeper軟件進行各內參基因穩定性分析，最后結合分析結果運用refinder計算出候選內參基因穩定性綜合排名。

與現有技術相比，本發明具有下列優點和積極效果：

1、本發明結合梨果實動態rna-seq測序結果以及后期實驗驗證數據分析，明確了翠冠、豐水和雪青3個主栽梨品種果實發育穩定內參基因，為后期深入挖掘果實功能基因奠定了基礎。

2、篩選出適合主栽品種翠冠、豐水和雪青的內參基因，適用于果實發育過程中糖、酸以及其他功能基因的表達分析，應用廣泛，靈敏度高，穩定性好，精確度高。

3、本研究經過嚴格的內參基因篩選程序，數據真實可靠，確定了梨果實穩定的內參，明確了看家基因并不是最理想的內參基因。

附圖說明

圖1是候選內參基因及pbrtub基因引物特異性瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2是36個樣品rna逆轉錄成相同濃度的cdna瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3是候選內參基因和pbrtub在各個樣品中的ct值。

其中，折線圖a1、a2、a3分別是翠冠、豐水和雪青果實發育的候選基因的ct平均值，箱線圖b1、b2、b3分別是翠冠、豐水和雪青果實發育的候選基因整個時期ct的最大、最小和平均值。

圖4是通過genorm軟件比較每個候選內參基因的表達穩定度m值排序圖。

圖a、b、c分別為翠冠、豐水和雪青。其中，m值越大穩定度越低，最右側兩個基因是genorm分析中最穩定的兩個基因。

圖5是通過normfinder和bestkeeper軟件比較每個候選內參基因的表達穩定度排序圖。

其中，圖a1、a2、a3分別是翠冠、豐水和雪青通過normfinder軟件表達穩定值；圖b1、b2、b3分別是翠冠、豐水和雪青通過bestkeeper軟件平均stdev值。圖中，靠右排序的越穩定。

具體實施方式

本發明研究翠冠、豐水和雪青三個主栽梨品種果實發育內參基因。下面主要以翠冠(cg)梨為例，結合附圖和實施例詳細說明：

1、基于研究果實發育相關基因的研究，選取了翠冠、豐水和雪青3個品種的全部發育過程的4個階段果實進行轉錄組測序。篩選了表達量較高，并且表達水平較為穩定的9個候選內參基因。

2、將rna-seq表達譜數據庫中挑選9個表達相對穩定的基因作為候選內參基因(表2)，梨看家基因微管蛋白基因(pbrtub)為對照。根據候選內參基因的cds序列和qrt-pcr設計原則，利用primer5.0軟件設計10對特異性引物(表1)。內參基因目的片段的pcr擴增檢測(圖1)。

3、選取3個品種各個階段果實發育動態樣品(翠冠cg1-cg1010個時期樣品、豐水fs1-fs1313個時期樣品和雪青xq1-xq1313個時期樣品)，用液氮速凍，以備rna提取。采用rna試劑盒(北京天根生化科技公司)提取樣品總rna，以1μg總rna為模板，采用first-strandcdnasynthesissupermix反轉錄試劑盒(北京全式金)去除基因組dna并反轉錄合成cdna第一鏈，獲得高質量的cdna(圖2),-20保存備用。

4、內參基因熒光定量pcr擴增，使用sybrgreenmaster(roche)試劑盒，具體操作按照試劑盒說明書進行。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，65℃退火15s，72℃延伸15s，45個循環。每個樣品設3個重復。

5、實時熒光定量pcr得出各樣品ct值，每個基因在不同樣品中的表達豐度均存在差異，通過excel2010獲得翠冠果實發育的候選基因的ct平均值折線圖(圖3，a1)，以及通過r獲得翠冠果實發育的候選基因整個時期ct的最大、最小和平均值(圖3，b1)，初步內參基因穩定性進行排序(表2，翠冠，deltact)，具體排序為pbr002841、pbr028511、pbr038418、pbr016129、pbr027964、pbr041114、pbr000214、pbr016048、pbr018827、pbrtub。

6、通過genorm軟件計算每個候選內參基因的表達穩定度m值(圖4)，m值越大，表明穩定性越低；反之m值越小，穩定性越高，其中m＝1.5是上限。從而獲得兩個最穩定的基因(pbr028511，pbr027964)，并且獲得候選基因穩定性排序(圖4a；表2，翠冠，genorm)。

7、通過normfinder軟件計算ct值組內方差與組間方差來確定候選內參基因的穩定值(圖5，a1)，穩定值越小，內參基因表達就越穩定；反之不穩定。獲得候選基因穩定性排序(圖5，a1；表2，翠冠,normfinder)，具體排序為pbr002841、pbr028511、pbr038418、pbr016129、pbr027964、pbr041114、pbr000214、pbr016048、pbr018827、pbrtub。繼續通過bestkeeper軟件計算標準偏差(stdev)來篩選最穩定的內參基因(圖5，b1)，其中標準差越小，穩定性越好；反之穩定性越差。獲得候選基因穩定性排序(圖5，b1；表2，翠冠，bestkeeper)，具體排序為pbr028511、pbr002841、pbr041114、pbr016129、pbr038418、pbr027964、pbr000214、pbr016048、pbr018827、pbrtub。

8、最后我們通過refinder軟件對上述多種分析得到的穩定性排名求幾何平均值，獲得翠冠果實發育中內參基因穩定性排序(表2，翠冠，comprehensiveranking)，從而獲得了比看家基因更穩定的內參基因pbr028511，該內參基因pbr028511的核苷酸序列如seqidno:1所示。同樣方法獲得了豐水梨果實不同發育時期熒光定量內參基因為pbr038418，該內參基因pbr038418的核苷酸序列如seqidno:2所示；雪青梨果實不同發育時期熒光定量內參基因為pbr041114，該內參基因pbr041114的核苷酸序列如seqidno:3所示。

表1候選內參基因引物列表

sequencelisting

<110>南京農業大學

<120>梨果實不同發育時期熒光定量內參基因的篩選及應用

<130>2017

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1323

<212>dna

<213>翠冠梨

<221>內參基因pbr028511

<400>1

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<213>豐水梨

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<210>4

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<212>dna

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<213>人工序列

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<400>6

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<213>人工序列

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<400>7

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<210>8

<211>25

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<213>人工序列

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<400>8

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<210>9

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<213>人工序列

<221>pbr041114-r

<400>9

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