超載和洗脫層析的制作方法

本申請是申請日為2012年11月2日的、發明名稱為“超載和洗脫層析”的中國專利申請201280065729.6(pct/us2012/063242)的分案申請。相關申請本申請要求于2011年11月2日提交的臨時專利申請u.s.系列號61/554,898的優先權益，其通過引用全文整合到本文中。發明領域本發明提供了從包含產物和至少一種污染物的組合物中純化產物的方法，和包含通過所述方法純化的產物的制劑。發明背景陰離子交換(aex)層析被普遍用于流通模式中作為單克隆抗體(mab)的平臺精制步驟。在標準的流通條件下結合aex樹脂的某些mab可以解決設備的適應性難題。對于質量要求通常較低的早期臨床研發階段，通過使用結合和洗脫模式的aex或混合模式的樹脂純化這些非平臺性的mab。然而，由于這些樹脂的低動態結合容量(dbc)，晚期執行時將需要大小約1000l的柱子，或者在較小柱子上進行多次循環，因而限制了設備的通量。通常使用結合和洗脫層析(b/e)或流通(f/t)層析實施mab純化。目前，已經將弱分配層析(kelley,bd等，2008biotechnolbioeng101(3):553-566；美國專利申請公開號2007/0060741)和過載層析(pct/us2011/037977)分別導入到aex樹脂和陽離子交換(cex)樹脂上，以增強mab純化。下文強調了這些層析模式每者的一般機制和限制。結合和洗脫層析：在b/e層析中，通常裝載產物使層析材料的dbc最大化，然后鑒別洗滌和洗脫條件，使得洗脫液中獲得最大產物純度。b/e層析的限制是裝載密度與實際樹脂dbc的限制。流通層析：使用f/t層析，鑒別了這樣的裝載條件，在所述條件下雜質與層析材料強結合，同時產物流通。f/t層析允許對標準mab進行高裝載密度，但對非平臺性mab卻不能執行，或者能夠對那些非平臺性mab進行f/t操作的溶液條件不能在現有的生產設備中執行。弱分配層析：該操作模式通過鑒別溶液條件，增強了f/t模式，在所述溶液條件下具有mab與樹脂的弱結合(2至20g/l)。在這些條件下，雜質比在f/t模式下的結合更強，因而獲得了增強的純化。然而，裝載條件靶向具有范圍在0.1-20內的低產物分配系數(kp)。過載層析：在該層析模式下，超過層析材料對產物的動態結合容量裝載目標產物，因而被稱為過載。所述操作模式已被證實用陽離子交換(cex)基質，特別是用膜提供了mab純化。然而，該方法的限制是樹脂的低產量，因為沒有洗脫階段。將多肽大規模的、有成本效益地純化至足以用作人治療劑的純度仍然是艱巨的難題。本文引用的所有參考文獻，包括專利申請和公開都通過引用全文整合到本文中。概述本發明提供了用于從包含多肽和一種或多種污染物的組合物中純化多肽的方法，所述方法包括a)以超過層析材料對于多肽的動態結合容量的量將組合物裝載到層析材料上，b)在其中一種或多種污染物仍然與層析材料結合的條件下，從層析材料上洗脫多肽，和c)混合包含步驟a)和b)的層析流出液中的多肽的級分。在一些實施方案中，多肽是抗體或免疫粘附素。在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體；例如但不限于嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一些實施方案中，抗體是抗原結合片段；例如但不限于fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、scfv、di-scfv、bi-scfv、串聯(di,tri)-scfv、fv、sdab、三功能抗體、bite、雙抗體和三價抗體。在一些實施方案中，多肽是酶、激素、融合蛋白、含有fc的蛋白質、免疫綴合物、細胞因子或白介素。在一些實施方案中，多肽是從包含一種或多種污染物的組合物中純化的；例如，中華倉鼠卵巢蛋白(chop)、宿主細胞蛋白(hcp)、泄露的蛋白a、羧肽酶b、核酸、dna、產物變體、聚集的蛋白質、細胞培養基組分、慶大霉素、多肽片段、內毒素和病毒性污染物。在本發明的一些實施方案中，層析材料選自混合模式材料、陰離子交換材料、疏水性相互作用材料，和親和材料。在一些實施方案中，以約層析材料對于一種或多種污染物的動態結合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些實施方案中，多肽的層析材料的分配系數大于30或大于100。在一些實施方案中，方法提供了這樣的oec，其中洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的電導率的電導率。在其他實施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的電導率的電導率。在一些實施方案中，方法提供了這樣的oec，其中洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的ph的ph。在其他實施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的ph的ph。在一些實施方案中，方法的多肽在來自親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析和疏水性相互作用層析的洗出液中。在一些實施方案中，多肽在來自蛋白a層析的洗出液中。在一些實施方案中，還通過例如病毒過濾、親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析和/或疏水性相互作用層析進一步純化方法的多肽。在一些實施方案中，多肽是通過例如超濾、滲濾或超濾和滲濾的組合而進一步濃縮的。在一些實施方案中，方法的多肽還與可藥用的運載體組合。附圖簡述圖1顯示了在mab3的分批結合條件下，在captoadhere樹脂上的高通量篩選(hts)結果。圖1a顯示了mab3的kp常數值的等值線。圖1b顯示了在用樹脂嘗試80g/l產物的上清液時，mab3的實際結合容量。圖1c顯示了在用樹脂嘗試80g/l產物的上清液時，雜質(宿主細胞蛋白)的實際結合容量。所有的等值線圖都是使用源自原始數據的應答表面模型生成的。圖2顯示了優化的oec操作模式的層析圖。用于該次運行的mab3的裝載密度為180g/l。圖3顯示了使用mab3的oec模式的裝載優化。圖4顯示了具有oec操作模式的靶裝載條件的層析圖。相似的裝載和洗脫條件導致拖尾，因而導致混合物體積增加了45％。用于該次運行的mab3的裝載密度為180g/l。圖5顯示了使用mab3的oec模式的洗脫優化。圖6顯示了級分中的雜質分析和雜質的累積分析。圖7顯示了在1000g/l裝載密度的oec模式下，captoadhere樹脂的mab3chop貫穿(breakthrough)分析。圖8顯示了在從70g/l至180g/l的裝載密度范圍內試驗性規模運行的產率分析。圖9顯示了對弱分配層析操作模式和過載和洗脫層析操作模式的比較。產物是mab3，層析材料是captoadhere樹脂。圖10顯示了在150g/l裝載密度的oec操作模式下，qma樹脂的mab3chop分析。圖11顯示了在150g/l裝載密度的oec操作模式下，captoadhere樹脂的mab4chop分析。圖12顯示了在150g/l裝載密度的oec操作模式下，captommc樹脂的mab4chop分析。圖13顯示了在200g/l裝載密度的oec模式下，captoadhere樹脂的mab3chop貫穿分析。將mab3蛋白a混合物裝載到captoadhere樹脂上，至200g/l(超過產物結合容量50g/l)。chop貫穿分析顯示多至200g/lmab處理chop未貫穿。發明詳述i.定義如本文描述的術語“產物”是待通過oec純化的物質；例如，多肽。術語“多肽”或“蛋白質”在本文中可互換的使用，指任何長度的氨基酸聚合物。聚合物可以是線性的或分支的，可以包含經修飾的氨基酸，并可以被非氨基酸中斷。術語還涵蓋了被天然地或通過介入修飾的氨基酸聚合物；例如，形成二硫鍵、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他的操作或修飾，如與標記組分綴合。定義還包括了例如含有一個或多個氨基酸類似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本領域已知的其他修飾的多肽。如本文中使用的術語“多肽”和“蛋白質”具體涵蓋了抗體。“純化的”多肽(例如，抗體或免疫粘附素)意指多肽的純度增加，使所述多肽以比其在天然環境中，和/或比初始合成時，和/或比在實驗室條件下擴增時所存在的形式更純的形式存在。純度是一個相對的術語，不必然表示絕對純度。本文中使用的術語“經表位標記的”指包含與“標簽多肽”融合的多肽的嵌合多肽。標簽多肽具有足夠多的殘基以提供可以制備抗體的表位，但也足夠短，使其不干擾與其融合的多肽的活性。標簽多肽還優選地相當獨特，使抗體基本上不與其他表位交叉反應。合適的標簽多肽一般具有至少6個氨基酸殘基，并且通常在約8至50個氨基酸殘基之間(優選在約10至20個氨基酸殘基之間)。用于本文目的的“活性的”或“活性”指保留了天然或天然存在的多肽的生物學和/或免疫學活性的多肽形式，其中“生物學”活性指由天然或天然存在的多肽導致的、除了誘導針對天然或天然存在的多肽具有的抗原性表位的抗體的生產以外的能力的生物學功能(抑制性或刺激性的)，并且“免疫學”活性指誘導針對天然或天然存在的多肽具有的抗原性表位的抗體的生產的能力。術語“拮抗劑”使用最寬泛的含義，并且包括部分或完全阻斷、抑制或中和天然多肽的生物學活性的任何分子。類似的，術語“激動劑”使用最寬泛的含義，并且包括模擬天然多肽的生物學活性的任何分子。合適的激動劑或拮抗劑分子具體包括激動劑或拮抗劑抗體或抗體片段、天然多肽的片段或氨基酸序列變體等。用于鑒別多肽的激動劑或拮抗劑的方法可包括將多肽與候選激動劑或拮抗劑分子接觸，并測量通常與多肽相關的一種或多種生物學活性的可檢測的改變。“補體依賴性細胞毒性”或“cdc”指在存在補體的條件下分子裂解靶的能力。補體激活通路是由補體系統的第一組分(c1q)結合與同族抗原復合的分子(例如，多肽(例如抗體))而起始的。為了評估補體激活，可以實施cdc測定法，例如，如gazzano-santoro等，j.immunol.methods202:163(1996)中所述。“結合”目標抗原(例如，腫瘤相關多肽抗原靶)的多肽是以足夠的親和力結合抗原的多肽，使得所述多肽可用作靶向表達所述抗原的細胞或組織中的診斷劑和/或治療劑，且不與其他多肽顯著地交叉反應。在這類實施方案中，如通過熒光激活的細胞分選(facs)分析或放射性免疫沉淀(ria)所測定的，多肽與“非靶”多肽的結合程度將少于多肽與其特定靶多肽結合的約10％。關于多肽與靶分子的結合，術語“特異的結合”或“特異性地結合于”或特別多肽或特別多肽靶上的表位“特異性的”意指在測量上不同于非特異性的相互作用的結合。可以通過例如確定分子的結合與對照分子的結合的比較，來測量特異的結合，所述對照分子一般是不具有結合活性的結構相似的分子。例如，可以通過與類似于靶的對照分子競爭，例如，過量的未標記的靶，來確定特異的結合。在此情況下，如果標記的靶與探針的結合被過量的未標記的靶競爭性抑制，則表示了特異的結合。本文中的術語“抗體”使用最寬泛的含義，具體覆蓋了單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，和抗體片段只要其表現出理想的生物學活性。術語“免疫球蛋白”(ig)在本文中可與抗體互換的使用。抗體是天然存在的免疫球蛋白分子，具有全部基于免疫球蛋白折疊的可變結構。例如，igg抗體具有通過二硫鍵合以形成功能性抗體的2條“重”鏈和2條“輕”鏈。每條重鏈和輕鏈本身包含“恒定區”(c)和“可變區”(v)。v區確定了抗體的抗原結合特異性，同時c區提供了結構支持和與免疫效應子的非抗原特異性相互作用中的功能。抗體或抗體的抗原結合片段的抗原結合特異性是抗體與特別抗原特異性結合的能力。通過v區的結構特征確定抗體的抗原結合特異性。變異性并非均勻的分布在可變結構域的110個氨基酸跨度中。相反，v區由15-30個氨基酸的被稱為框架區(fr)的相對不變的片段組成，所述框架區被每個為9-12個氨基酸長的被稱為“超變區”的高度變異性的較短區域分隔開。天然重鏈和輕鏈的可變結構域每者包含4個fr，主要采用β-片層構象，由3個超變區連接，所述超變區形成環狀連接，并且在一些情況下形成β-片層結構的部分。每條鏈中的超變區通過fr與來自其他鏈的超變區緊密的靠在一起，對形成抗體的抗原結合位點作貢獻(參見kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。恒定結構域不直接參與抗體與抗原的結合，但卻表現出多種效應子功能，如抗體參與的抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)。每個v區通常包含3個互補決定區(cdr，每個cdr含有“超變環”)和4個框架區。抗體結合位點，以實質的親和力與特定的理想抗原結合所必需的最小結構單元，將因此通常包括3個cdr和至少3個、優選4個框架區散布其中，以恰當的構象保持和呈遞cdr。經典的四鏈抗體具有由配合的vh和vl結構域定義的抗原結合位點。某些抗體，如駱駝和鯊魚抗體，缺少輕鏈，僅依賴于由重鏈形成的結合位點。可以制備單結構域改造的免疫球蛋白，其中在缺少vh和vl之間配合的情況下，由重鏈或輕鏈單獨形成結合位點。術語“可變”指這樣的事實，即，可變結構域的某些部分的序列在抗體之間顯著不同，并用于每個特定抗體與其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性并非均勻的分布在抗體的整個可變結構域。而是集中在輕鏈和輕鏈可變結構域中被稱為超變區的3個區段中。可變結構域的更加高度保守的部分被稱為框架區(fr)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域每者包含4個fr，主要采用β-片層構象，由3個超變區連接，所述超變區形成環狀連接，并且在一些情況下則形成β-片層結構的部分。每條鏈中的超變區通過fr與來自其他鏈的超變區緊密的靠在一起，對形成抗體的抗原結合位點作貢獻(參見kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。恒定結構域不直接參與抗體與抗原的結合，但卻表現出多種效應子功能，如抗體參與的抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)。術語“超變區”當用于本文中時，指抗體中負責抗原結合的氨基酸殘基。超變區可包含來自“互補決定區”或“cdr”的氨基酸殘基(例如，大概是vl中的殘基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)，和vh中的約31-35b(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)(kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))和/或來自“超變環”的那些殘基(例如，vl中的殘基26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)，和vh中的26-32(h1)、52a-55(h2)和96-101(h3)(chothia和leskj.mol.biol.196:901-917(1987))。“框架”或“fr”殘基是本文定義的超變區殘基以外的那些可變結構域殘基。“抗體片段”包含完整抗體的部分，優選地包含其抗原結合區。抗體片段的例子包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；雙抗體；串聯雙抗體(tadb)、線性抗體(例如，美國專利號5,641,870，實施例2；zapata等，proteineng.8(10):1057-1062(1995))；單臂抗體、單可變結構域抗體、微抗體(minibodies)、單鏈抗體分子；由抗體片段形成的多特異性抗體(例如，包括但不限于：db-fc、tadb-fc、tadb-ch3、(scfv)4-fc、di-scfv、bi-scfv或串聯(di,tri)-scfv)；和雙特異性t細胞募召劑(bite)。木瓜蛋白酶消化抗體產生2個相同的抗原結合片段，被稱為“fab”片段，每個都具有單個抗原結合位點，和剩余的“fc”片段，該片段的名稱反映了片段易于結晶的能力。胃蛋白酶處理產生了具有2個抗原結合位點并仍然能夠交聯抗原的f(ab')2片段。“fv”是含有完整的抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。該區由處于緊密、非共價締合的1條重鏈和1條輕鏈可變結構域的二聚體組成。在該構象中，每個可變結構域的3個超變區相互作用，在vh-vl二聚體的表面定義了抗原結合位點。綜上所述，6個超變區賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單可變結構域(或僅包含抗原特異性的3個超變區的一半fv)也具有識別和結合抗原的能力，雖然比整個結合位點的親和力低。fab片段還含有輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域(ch1)。fab’片段與fab片段不同，區別在于在重鏈ch1結構域的羧基末端添加了若干殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。fab'-sh是本文中對其中恒定結構域的半胱氨酸殘基具有至少一個游離巰基的fab'的命名。f(ab')2抗體片段最初是作為之間具有鉸鏈半胱氨酸的成對fab'片段生產的。抗體片段的其他化學偶聯也是已知的。來自任何脊椎動物的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可以分為兩類明顯不同的類型之一，稱為kappa(κ)和lambda(λ)，基于其恒定結構域的氨基酸序列。根據其重鏈的恒定結構域的氨基酸序列，抗體可以分為不同的類型。有五大類完整的抗體：iga、igd、ige、igg和igm，其中一些還進一步分為亞類(同種型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。對應不同類型的抗體的重鏈恒定結構域分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型的免疫球蛋白的亞基結構和三維構象是普遍已知的。“單鏈fv”或“scfv”抗體片段包含抗體的vh和vl結構域，其中這些結構域存在于單個多肽鏈中。在一些實施方案中，fv多肽還在vh和vl結構域之間包含多肽接頭，所述多肽接頭使scfv能夠形成用于抗原結合的理想的結構。關于scfv的綜述，參見thepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，rosenburgandmoore編著，springer-verlag,newyork，第269-315頁(1994)中的plückthun。術語“雙抗體”指具有2個抗原結合位點的小抗體片段，所述片段包含與在同一多肽鏈中的輕鏈可變結構域(vl)相連的重鏈可變結構域(vh)(vh-vl)。通過使用太短以至于不允許在同一鏈的2個結構域之間配對的接頭，強迫結構域與另一條鏈的互補結構域配對，并生成2個抗原結合位點。雙抗體更詳細地描述在例如ep404,097；wo93/11161；和hollinger等，proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)中。術語“多特異性抗體”使用最寬泛的含義，具體覆蓋了具有多表位特異性的抗體。這類多特異性抗體包括但不限于：包含重鏈可變結構域(vh)和輕鏈可變結構域(vl)的抗體，其中vhvl單元具有多表位特異性；具有2個或多個vl和vh結構域的抗體，每個vhvl單元結合不同的表位；具有2個或多個單可變結構域的抗體，每個單可變結構域結合不同的表位；全長抗體、抗體片段如fab、fv、dsfv、scfv、雙抗體、雙特異性雙抗體、三價抗體、三功能抗體、共價或非共價連接的抗體片段。“多表位特異性”指特異性結合相同或不同的靶上的兩個或多個不同的表位的能力。“單一特異性”指僅結合一個表位的能力。根據一個實施方案，多特異性抗體是以5μm至0.001pm、3μm至0.001pm、1μm至0.001pm、0.5μm至0.001pm或0.1μm至0.001pm的親和力結合每個表位的igg抗體。表達方式“單結構域抗體”(sdab)或“單可變結構域(svd)抗體”一般指這樣的抗體，所述抗體中的單個可變結構域(vh或vl)可以賦予抗原結合。換言之，單可變結構域不需要為了識別靶抗原而與另一個可變結構域相互作用。單結構域抗體的例子包括源自駱駝科動物(羊駝和駱駝)和軟骨魚(例如護士鯊)的抗體，和通過重組方法源自人和小鼠抗體的抗體(nature(1989)341:544-546；devcompimmunol(2006)30:43-56；trendbiochemsci(2001)26:230-235；trendsbiotechnol(2003):21:484-490；wo2005/035572；wo03/035694；febslett(1994)339:285-290；wo00/29004；wo02/051870)。術語“單克隆抗體”在本文中用于指從基本均質的抗體的群體中獲得的抗體，即，構成群體的單個抗體是相同的和/或結合相同表位，除了可能在生產單克隆抗體的過程中產生的可能的變體外，這類變體一般以少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品相反，每個單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。除了其特異性外，單克隆抗體的優點還在于不被其他的免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”表示抗體的特征是從基本均質的抗體群體獲得的，并不理解為要求通過任何特定的方法生產抗體。例如，待根據本文提供的方法使用的單克隆抗體可以通過kohler等，nature256:495(1975)首次描述的雜交瘤方法或者可以通過重組dna方法制備(參見例如，美國專利號4,816,567)。還可以使用例如clackson等，nature352:624-628(1991)和marks等，j.mol.biol.222:581-597(1991)中描述的技術，從噬菌體抗體文庫中分離“單克隆抗體”。本文中的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分是與源自特定物種的抗體的相應序列相同或同源的，或者屬于特定的抗體類型或亞類，而鏈的其余部分是與源自另一種物種的抗體的相應序列相同或同源的，或者屬于另一種抗體類型或亞類，以及這類抗體的片段，只要所述片段表現出理想的生物學活性(美國專利號4,816,567；morrison等，proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855(1984))。本文中的目標嵌合抗體包括“靈長類化的”抗體，所述抗體包含源自非人靈長類(例如，舊世界猴，如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可變結構域抗原結合序列和人恒定區序列(美國專利號5,693,780)。非人(例如，鼠)抗體的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗體。在絕大部分情況下，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體超變區的殘基被具有理想特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)，如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的超變區殘基取代。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(fr)殘基被相應的非人殘基取代。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發現的殘基。進行這些修飾以進一步改善抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上全部的至少1個，通常2個可變結構域，其中，所有的或基本上所有的超變環都對應于非人免疫球蛋白的超變環，并且所有的或基本上所有的fr都是人免疫球蛋白序列的fr，除了如上述的fr取代。人源化抗體任選地還包含免疫球蛋白恒定區的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區。更多細節參見jones等，nature321:522-525(1986)；riechmann等，nature332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。出于本文的目的，“完整抗體”是包含重鏈和輕鏈可變結構域以及fc區的抗體。恒定結構域可以是天然序列恒定結構域(例如，人天然序列恒定結構域)或其氨基酸序列變體。優選的，完整抗體具有一個或多個效應子功能。“天然抗體”通常是約150,000道爾頓的異四聚化的糖蛋白，由2條相同的輕(l)鏈和2條相同的重(h)鏈組成。每條輕鏈通過1個共價的二硫鍵與重鏈相連，而不同的免疫球蛋白同種型的重鏈之間的二硫鍵數量也不同。每條重鏈和輕鏈還具有規律間隔的鏈內二硫橋。每條重鏈在一個末端具有可變結構域(vh)，之后具有多個恒定結構域。每條輕鏈在一端具有可變結構域(vl)，在另一端具有恒定結構域；輕鏈的恒定結構域與重鏈的第一恒定結構域對齊，輕鏈的可變結構域與重鏈的可變結構域對齊。特定的氨基酸殘基被認為形成了輕鏈和重鏈可變結構域之間的界面。“裸露的抗體”是未與異源分子(如細胞毒性部分或放射性標記)綴合的抗體(如本文定義)。在一些實施方案中，抗體的“效應子功能”指歸因于抗體的fc區(天然序列fc區或氨基酸序列變體fc區)的那些生物學活性，且隨抗體同種型而不同。抗體效應子功能的例子包括：c1q結合和補體依賴性細胞毒性；fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)；吞噬作用；細胞表面受體的下調。“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”和“adcc”指細胞介導的反應，在所述反應中，表達fc受體(fcr)的非特異性細胞毒性細胞(例如，天然殺傷(nk)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別在靶細胞上結合的抗體，然后導致靶細胞裂解。用于介導adcc的主要細胞，nk細胞，僅表達fcγriii，而單核細胞表達fcγri、fcγrii和fcγriii。ravetch和kinet,annu.rev.immunol9:457-92(1991)的第464頁的表3概括了在造血細胞上的fcr表達。為了評估目標分子的adcc活性，可以實施體外adcc測定法，如美國專利號5,500,362或5,821,337所述。用于這類測定法的效應子細胞包括外周血單核細胞(pbmc)和天然殺傷(nk)細胞。可選的或額外的，可以在體內評估目標分子的adcc活性，例如在動物模型中，如clynes等，proc.natl.acad.sci.(usa)95:652-656(1998)中公開的動物模型。“人效應子細胞”是表達一種或多種fcr并實施效應子功能的白細胞。在一些實施方案中，細胞至少表達fcγriii并執行adcc效應子功能。介導adcc的人白細胞的例子包括外周血單核細胞(pbmc)、天然殺傷(nk)細胞、單核細胞、細胞毒性t細胞和嗜中性粒細胞；pbmc和nk細胞是優選的。術語“fc受體”或“fcr”用于描述與抗體的fc區結合的受體。在一些實施方案中，fcr是天然序列的人fcr。此外，優選的fcr是結合igg抗體的fcr(γ受體)，包括fcγri、fcγrii和fcγriii亞類的受體，包括這些受體的等位變體和備選地可變剪切形式。fcγrii受體包括fcγriia(活化型受體)和fcγriib(抑制型受體)，其具有差別主要在于其胞質結構域中的類似的氨基酸序列。活化型受體fcγriia在其胞質結構域中含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(itam)。抑制型受體fcγriib在其胞質結構域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(itim)。(參見annu.rev.immunol.15:203-234(1997))。ravetch和kinet,annu.rev.immunol9:457-92(1991)；capel等，immunomethods4:25-34(1994)；和dehaas等，j.lab.clin.med.126:330-41(1995)中對fcr進行了綜述。其他fcr，包括將來待鑒定的那些，都被本文中的術語“fcr”涵蓋。該術語還包括新生兒受體fcrn，這是負責母體igg向胎兒轉移的受體(guyer等，j.immunol.117:587(1976)和kim等，j.immunol.24:249(1994))。本文使用的術語“順序”涉及層析時指第一層析后接第二層析。在第一層析和第二層析之間也可以包括其他步驟。本文使用的術語“連續”涉及層析時指具有直接相連的，或允許在兩種層析材料之間連續流動的一些其他機制的第一層析材料和第二層析材料。“污染物”指與理想的多肽產物不同的材料。污染物包括但不限于：宿主細胞材料，如chop；泄露的蛋白a；核酸；理想多肽的變體、片段、聚集物或衍生物；另一種多肽；內毒素；病毒性污染物；細胞培養基組分等。在一些例子中，污染物可以是宿主細胞蛋白質(hcp)，來自例如但不限于細菌細胞，如大腸桿菌細胞、昆蟲細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞。層析材料的“動態結合容量”是在未結合產物顯著的貫穿出現前，材料在實際的流動條件下將要結合的產品(例如多肽)的量。本文使用的“分配系數”kp指產物(例如多肽)在靜止相中的摩爾濃度除以產物在移動相中的摩爾濃度。“裝載密度”指與一定體積的層析材料(例如數升)接觸的組合物的量，例如克。在一些例子中，裝載密度用g/l表示。本文中提及“約”一定數值或參數時，包括(描述了)對于數值或參數本身的變異。例如，涉及“約x”的描述包括了對“x”的描述。如本文和所附權利要求中使用的，單數形式“a”或“the”包括了復數指代，除非語境中另外明確指出。應理解，本文描述的本發明的方面和變異包括了“由方面和變異組成”和/或“基本由方面和變異組成”。ii.純化方法本文提供了使用過載和洗脫層析(oec)從包含產物和至少一種污染物的組合物中純化產物(如多肽)的方法。oec提供了這樣的操作模式，其中在單種層析模式中實現不同的層析模式提供的好處。oec可以在多種樹脂上執行，同時提供增強的雜質去除和顯著的生產優勢，如更小的柱體積，更好的設備適合度和更低的成本。oec的操作模式可以分解為3種不同的組分。1.過載–將組合物裝載到層析材料上，使產物(如多肽)裝載到層析材料上的量超過材料對于產物的動態結合容量(dbc)。在一些實施方案中，確定雜質與層析材料強烈結合的裝載條件，如ph和電導率。在一些實施方案中，選擇層析條件，使得即使產物貫穿，絕大多數，如果不是所有的雜質不貫穿。在一些實施方案中，組合物的裝載量是或者接近材料對于一種或多種污染物的dbc。過載模式允許所利用的層析材料超過材料對于產物的典型dbc。2.混合–洗脫液中的產物，如多肽的混合開始于產物貫穿。由于裝載條件是使雜質在貫穿期間繼續結合，因此可以在層析的裝載階段在洗脫液中獲得清潔的產物混合物。3.洗脫–在結束將組合物裝載到層析材料后，使用經鑒別的洗脫條件，從層析材料上洗脫產物(如多肽)，所述洗脫條件使得洗脫結合的產物，同時大部分的雜質仍然與層析材料結合。在一些方面，oec顯著增加層析材料利用，超過材料對于產物的dbc，從而提供相比其他層析方法的好處。例如，高10倍的層析材料利用可以導致顯著更低的成本。與其中優化層析材料的裝載以最大化產物(如多肽)與層析樹脂的結合的傳統的結合和洗脫層析不同，可以優化oec裝載條件以最大化污染物與層析材料的結合而并非產物與層析材料的結合。在一些方面，向層析材料裝載的組合物的量超過層析材料對于多肽的動態結合容量。在裝載層析材料的過程中，一些產物將在洗滌中貫穿，而一些產物仍然與層析材料結合。在結束裝載后，可以從層析材料中洗脫與層析材料結合的剩余產物。在一些上述實施方案中，層析材料是層析柱。在一些上述實施方案中，層析材料是層析膜。在本發明的一些方面，以約層析材料對組合物中的一種或多種污染物的動態結合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些實施方案中，以超過層析材料對產物的結合容量的量將組合物裝載到層析材料上。在一些實施方案中，以約層析材料對一種或多種污染物的動態結合容量并超過層析材料對產物的結合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些實施方案中，以層析材料對產物的dbc的20倍將組合物裝載到層析材料上。在一些實施方案中，以層析材料對產物的dbc的100倍將組合物裝載到層析材料上。在一些實施方案中，以約層析材料對組合物中的所有污染物的動態結合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些實施方案中，以約層析材料對組合物中的所有污染物的動態結合容量并超過層析材料對產物的結合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些實施方案中，以少于層析材料對所有污染物的動態結合容量并超過層析材料對產物的結合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些上述實施方案中，層析材料位于層析柱中。在一些實施方案中，層析柱是工業規模的層析柱。在一些上述實施方案中，層析材料是層析膜。可以通過確定特定層析材料的產物或污染物的分配系數(kp)作為ph和反離子濃度的函數，估算層析材料對產物和一種或多種污染物的動態結合容量。例如，可以確定層析材料(例如混合模式樹脂)對多肽的動態結合容量。可以通過用過量的產物和/或污染物挑戰結合，確定在具體的ph和反離子濃度組合條件下，層析材料對產物或污染物的實際結合容量。在一些實施方案中，當產物(例如多肽)的kp大于約30時實施oec。在一些實施方案中，當產物的kp大于約50時實施oec。在一些實施方案中，當產物的kp大于約75時實施oec。在一些實施方案中，當產物的kp大于約100時實施oec。可以通過測量特定層析材料在不同的ph和反離子濃度下的kp和動態結合容量，確定包含產物(如多肽)和污染物的特定組合物的oec條件。可以進行高通量篩選以確定這樣的oec條件，其中污染物結合高且可以在不洗脫絕大部分如果不是全部的污染物的條件下洗脫產物。例如，可以在高通量系統中，在多種ph和反離子濃度的緩沖液中孵育組合物與層析材料；例如在多孔板的孔中。在孵育期之后，分離層析材料和上清液，確定上清液中的產物或污染物的量。在一些實施方案中，使用低濃度的組合物確定kp。在一些實施方案中，使用高濃度的組合物確定動態結合容量。除了提供關于層析材料對特定產物和污染物的kp和動態結合容量的信息外，高通量篩選在ph和反離子濃度方面對于裝載和洗脫條件提供了指導。例如，在一些實施方案中，通過高通量篩選選擇裝載緩沖液的ph和反離子濃度，使污染物與層析材料的結合最大化，也還使洗出液中的產物(例如多肽)量最大化，同時使洗出液中的污染物，例如宿主細胞蛋白質的量最小化。在一些實施方案中，在通過高通量篩選確定的ph和電導率下，將組合物裝載到層析材料上，其中組合物中約所有的污染物都結合在層析材料上。在一些實施方案中，在通過高通量篩選確定的ph和電導率下，從層析材料上洗脫產物，其中從層析材料上洗脫了約所有的產物，而約所有的污染物仍然結合在層析材料上。在一些實施方案中，本發明提供了(例如，通過使用高通量篩選技術)用于鑒別操作條件的方法，所述操作條件導致層析材料結合最大量的污染物，而不論每ml層析材料結合的產物的量。篩選步驟用于鑒別這樣的洗脫條件，所述洗脫條件使結合的產物從層析材料上洗脫而雜質仍然與層析材料緊密結合。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，層析材料是包含能夠進行一種或多種下列功能的官能團的混合模式材料：陰離子交換、陽離子交換、形成氫鍵和疏水性相互作用。在一些實施方案中，混合模式材料包含能夠進行陰離子交換和疏水性相互作用的官能團。混合模式材料可含有n-苯甲基-n-甲基乙醇胺、4-巰基-乙基-吡啶,己胺或苯丙胺作為配體，或含有交聯的聚丙烯胺。混合模式材料的例子包括captoadhere樹脂、qma樹脂、captommc樹脂、mephypercel樹脂、heahypercel樹脂、ppahypercel樹脂或chromasorb膜或sartobindstic。在一些實施方案中，混合模式材料是captoadhere樹脂。在一些上述實施方案中，混合模式材料是混合模式層析柱。在一些上述實施方案中，混合模式材料是混合模式膜。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，層析材料是離子交換層析材料；例如，陰離子交換層析材料或陽離子交換層析材料。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，層析材料是陰離子交換材料。在一些實施方案中，陰離子交換層析材料是帶正電且具有用于交換流過或流通固相的含水溶液中的陰離子的自由的陰離子的固相。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，陰離子交換材料可以是膜、棒狀或樹脂。在一個實施方案中，陰離子交換材料可以是樹脂。在一些實施方案中，陰離子交換材料可包含伯胺、仲銨、叔胺或季銨離子官能團、多胺官能團或二乙氨乙基官能團。在一些上述實施方案中，陰離子交換層析材料是陰離子交換層析柱。在一些上述實施方案中，陰離子交換層析材料是陰離子交換層析膜。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，層析材料是陽離子交換材料。在一些實施方案中，陽離子交換材料是帶負電且具有用于交換流過或流通固相的含水溶液中的陽離子的自由的陽離子的固相。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，陽離子交換材料可以是膜、棒狀或樹脂。在一些實施方案中，陽離子交換材料可以是樹脂。陽離子交換材料可包含羧酸官能團或磺酸官能團，例如但不限于磺酸鹽、羧酸、羧甲基磺酸、磺異丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺酰基、磺氧乙基或正磷酸鹽。在一些上述實施方案中，陽離子交換層析材料是陽離子交換層析柱。在一些上述實施方案中，陽離子交換層析材料是陽離子交換層析膜。在本發明的一些實施方案中，層析材料不是陽離子交換層析材料。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，離子交換材料可利用常規的層析材料或對流的層析材料。常規的層析材料包括例如：灌注性材料(例如，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)樹脂)和擴散性材料(例如，交聯的瓊脂糖樹脂)。在一些實施方案中，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)樹脂可以是poros樹脂。在一些實施方案中，交聯的瓊脂糖樹脂可以是磺丙基-sepharosefastflow(spsff)樹脂。對流層析材料可以是膜(例如，聚醚砜)或棒狀材料(例如，交聯的聚合物)。聚醚砜膜可以是mustang。交聯的聚合物棒狀材料可以是交聯的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯-二甲基丙烯酸乙二醇酯共聚物。陰離子交換材料的例子是本領域已知的，包括但不限于：poroshq50、porospi50、porosd、mustangq、qsepharoseff和deaesepharose。陽離子交換材料的例子是本領域已知的，包括但不限于：mustangs、sartobinds、so3monolith、sceramichyperd、porosxs、poroshs50、poroshs20、spsff、sp-sepharosexl(spxl)、cmsepharosefastflow、captos、fractogelsehicap、fractogelso3或fractogelcoo。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，陽離子交換材料是poroshs50。在一些實施方案中，poroshs樹脂可以是poroshs50μm或poroshs20μm顆粒。在本發明的一些方面，層析材料是疏水性相互作用層析材料。疏水性相互作用層析(hic)是液相層析技術，其根據疏水性分離生物分子。hic層析材料的例子包括但不限于：toyopearlhexyl650、toyopearbutyl650、toyopearlphenyl650、toyopearlether650、source、resource、sepharosehi-trap、octylsepharose、phenylsepharose。在一些上述實施方案中，hic層析材料是hic層析柱。在一些上述實施方案中，hic層析材料是hic層析膜。在本發明的一些方面，層析材料是羥磷灰石(hap)層析材料。羥磷灰石層析材料的例子包括但不限于haultrogel和cht羥磷灰石。在一些上述實施方案中，hap層析材料是hap層析柱。在一些上述實施方案中，hap層析材料是hap層析膜。在本發明的一些方面，層析材料是親和層析材料。親和層析材料的例子包括但不限于用蛋白a或蛋白g衍生的層析材料。親和層析材料的例子包括但不限于：prosep-va、prosep-vaultraplus、proteinasepharosefastflow、tyopearlproteina、mabselect、mabselectsure和mabselectsurelx。在一些上述實施方案中，親和層析材料是親和層析柱。在一些上述實施方案中，親和層析材料是親和層析膜。可以優化組合物在層析材料上的裝載，用于通過oec分離產物和污染物。在一些實施方案中，產物是多肽。在一些實施方案中，優化組合物在層析材料上的裝載，用于污染物與層析材料的結合。例如，可以在多種不同的ph的裝載緩沖液中，將組合物裝載到層析材料(例如層析柱)上，而裝載緩沖液的電導率是恒定的。可選的，可以在多種不同的電導率的裝載緩沖液中，將組合物裝載到層析材料上，而裝載緩沖液的ph是恒定的。在結束將組合物裝載到層析材料上和從層析材料上洗脫產物至混合級分中之后，混合級分中的污染物的量提供了關于對于給定的ph或電導率的產物和污染物的分離的信息。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，以大于約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l、2000g/l或5000g/l層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到層析材料上。在一些實施方案中，以約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l或2000g/l層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到層析材料上。可以約30g/l和2000g/l之間、30g/l和1000g/l之間、30g/l和200g/l之間、30g/l和180g/l之間、50g/l和2000g/l之間、50g/l和1000g/l之間、50g/l和200g/l之間、50g/l和180g/l之間、150g/l和2000g/l之間、150g/l和1500g/l之間、150g/l和1000g/l之間、200g/l和1000g/l之間、200g/l和1500g/l之間、300g/l和1500g/l之間、400g/l和1000g/l之間或500g/l和1000g/l之間的層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到層析材料上。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，以大于約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l、2000g/l或5000g/l混合模式層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到混合模式層析材料上。在一些實施方案中，以約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l或2000g/l混合模式層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到混合模式層析材料上。可以約30g/l和2000g/l之間、30g/l和1000g/l之間、30g/l和200g/l之間、30g/l和180g/l之間、50g/l和2000g/l之間、50g/l和1000g/l之間、50g/l和200g/l之間、50g/l和180g/l之間、150g/l和2000g/l之間、150g/l和1500g/l之間、150g/l和1000g/l之間、200g/l和1000g/l之間、200g/l和1500g/l之間、300g/l和1500g/l之間、400g/l和1000g/l之間或500g/l和1000g/l之間的混合模式層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到混合模式層析材料上。在一些實施方案中，以70g/l至180g/l的密度將多肽裝載到層析材料上。在本發明的一些實施方案中，混合模式層析是captoadhere樹脂。在一些實施方案中，以70g/l至180g/l的密度將多肽裝載到captoadhere層析材料上。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是抗體或其片段。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，以大于約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l、2000g/l或5000g/l陰離子交換層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到陰離子交換層析材料上。在一些實施方案中，以約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l或2000g/l陰離子交換層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到陰離子交換層析材料上。可以約30g/l和2000g/l之間、30g/l和1000g/l之間、30g/l和200g/l之間、30g/l和180g/l之間、50g/l和2000g/l之間、50g/l和1000g/l之間、50g/l和200g/l之間、50g/l和180g/l之間、150g/l和2000g/l之間、150g/l和1500g/l之間、150g/l和1000g/l之間、200g/l和1000g/l之間、200g/l和1500g/l之間、300g/l和1500g/l之間、400g/l和1000g/l之間或500g/l和1000g/l之間的陰離子交換層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到陰離子交換層析材料上。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，以大于約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l、2000g/l或5000g/l陽離子交換層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到陽離子交換層析材料上。在一些實施方案中，以約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l或2000g/l陽離子交換層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到陽離子交換層析材料上。可以約30g/l和2000g/l之間、30g/l和1000g/l之間、30g/l和200g/l之間、30g/l和180g/l之間、50g/l和2000g/l之間、50g/l和1000g/l之間、50g/l和200g/l之間、50g/l和180g/l之間、150g/l和2000g/l之間、150g/l和1500g/l之間、150g/l和1000g/l之間、200g/l和1000g/l之間、200g/l和1500g/l之間、300g/l和1500g/l之間、400g/l和1000g/l之間或500g/l和1000g/l之間的陽離子交換層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到陽離子交換層析材料上。上述方法還可以包括裝載到蛋白a親和層析材料的步驟。在一些實施方案中，多肽產物是在oec之前首先通過蛋白a親和層析純化的抗體或其片段。裝載到蛋白a親和層析材料的步驟一般但不必需是在其他層析步驟之前實施的。在一些實施方案中，裝載到蛋白a親和層析材料的步驟可以與過載的交換和洗脫層析的順序步驟組合。在一些實施方案中，順序步驟是連續的。在一些實施方案中，連續純化使用相同的流速、電導率和/或ph。可以優化在oec模式下產物(如多肽)從層析材料上的洗脫，用于產生具有最少污染物和處于最小混合體積的產物。例如，可以在裝載緩沖液中將組合物裝載到層析材料(例如層析柱)上。在結束裝載后，可以在多種不同ph的緩沖液中洗脫產物，而洗脫緩沖液的電導率是恒定的。可選的，可以在多種不同電導率的緩沖液中洗脫產物，而洗脫緩沖液的ph是恒定的。在結束從層析材料上洗脫產物之后，混合級分中的污染物的量提供了關于對于給定的ph或電導率的產物和污染物的分離信息。大數量的級分(例如，8倍柱體積)的產物洗脫表示洗脫譜“拖尾”。在本發明的一些實施方案中，使洗脫拖尾最小化。可以根據例如緩沖液的理想ph、緩沖液的理想電導率、目標蛋白質的特征和純化方法，使用多種緩沖液。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，方法包括使用緩沖液。緩沖液可以是裝載緩沖液、平衡緩沖液或洗滌緩沖液。在一些實施方案中，裝載緩沖液、平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液中的一種或多種是相同的。在一些實施方案中，裝載緩沖液、平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液是不同的。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，緩沖液包含鹽。裝載緩沖液可包含氯化鈉、醋酸鈉或其混合物。在一些實施方案中，裝載緩沖液是氯化鈉緩沖液。在一些實施方案中，裝載緩沖液是醋酸鈉緩沖液。本文使用的裝載是將組合物裝載到層析材料上。裝載緩沖液是用于將包含目標產物的組合物裝載到層析材料上的緩沖液。可以在裝載待純化的組合物之前，用平衡緩沖液平衡層析材料。在一些例子中，在將組合物裝載到層析材料上之后和從固相上洗脫目標多肽之前，使用洗滌緩沖液。然而，可以通過洗滌緩沖液從層析材料上去除一些目標產物(例如多肽)(例如，與流通型模式相似)。本文使用的洗脫是從層析材料上去除產物(例如多肽)。洗脫緩沖液是用于從層析材料上洗脫多肽或其他目標產物的緩沖液。在許多情況下，洗脫緩沖液具有不同于裝載緩沖液的物理特征。例如，洗脫緩沖液可具有不同于裝載緩沖液的電導率或不同于裝載緩沖液的ph。在一些實施方案中，洗脫緩沖液具有低于裝載緩沖液的電導率。在一些實施方案中，洗脫緩沖液具有高于裝載緩沖液的電導率。在一些實施方案中，洗脫緩沖液具有低于裝載緩沖液的ph。在一些實施方案中，洗脫緩沖液具有高于裝載緩沖液的ph。在一些實施方案中，洗脫緩沖液具有不同于裝載緩沖液的電導率和ph。洗脫緩沖液可以具有更高或更低電導率和更高或更低ph的任意組合。電導率指含水溶液在兩個電極之間傳導電流的能力。在溶液中，電流通過離子運輸而流動。因此，伴隨含水溶液中存在的離子量增加，溶液將具有更高的電導率。測量電導率的基礎單位是siemen(或姆歐)、姆歐(ms/cm)，可以使用電導儀測量，如多種模型的orion電導儀。由于電解電導率是溶液中的離子攜帶電流的容量，因此可以通過改變其中的離子濃度改變溶液的電導率。例如，可以改變溶液中的緩沖劑濃度和/或鹽(例如，氯化鈉、醋酸鈉或氯化鉀)濃度以獲得理想的電導率。優選地，修飾多種緩沖液的鹽濃度來獲得理想的電導率。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，裝載緩沖液具有大于約4.0ms/cm、4.5ms/cm、5.0ms/cm、5.5ms/cm、6.0ms/cm、6.5ms/cm、7.0ms/cm、7.5ms/cm、8.0ms/cm、8.5ms/cm、9.0ms/cm、9.5ms/cm或10ms/cm中的任一的電導率。電導率可以在約4ms/cm和17ms/cm之間、4ms/cm和10ms/cm之間、4ms/cm和7ms/cm之間、5ms/cm和17ms/cm之間、5ms/cm和10ms/cm之間或5ms/cm和7ms/cm之間中的任一。在一些實施方案中，電導率是約4ms/cm、4.5ms/cm、5.0ms/cm、5.5ms/cm、6.0ms/cm、6.5ms/cm、7.0ms/cm、7.5ms/cm、8.0ms/cm、8.5ms/cm、9.0ms/cm、9.5ms/cm或10ms/cm中的任一。在一個方面，電導率是裝載緩沖液、平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液的電導率。在一些實施方案中，裝載緩沖液、平衡緩沖液和洗滌緩沖液中的一種或多種的電導率是相同的。在一些實施方案中，裝載緩沖液的電導率不同于洗滌緩沖液和/或平衡緩沖液的電導率。在一些實施方案中，在具有約5.5ms/cm的電導率的緩沖液中，將組合物裝載到混合模式層析材料上。在一些實施方案中，多肽是抗體或其片段。在一些實施方案中，洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的電導率的電導率。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，洗脫緩沖液具有小于約0.0ms/cm、0.5ms/cm、1.0ms/cm、1.5ms/cm、2.0ms/cm、2.5ms/cm、3.0ms/cm、3.5ms/cm、4.0ms/cm、4.5ms/cm、5.0ms/cm、5.5ms/cm、6.0ms/cm、6.5ms/cm或7.0ms/cm中的任一的電導率。電導率可以在約0ms/cm和7ms/cm之間、1ms/cm和7ms/cm之間、2ms/cm和7ms/cm之間、3ms/cm和7ms/cm之間或4ms/cm和7ms/cm之間、0ms/cm和5.0ms/cm之間、1ms/cm和5ms/cm之間、2ms/cm和5ms/cm之間、3ms/cm和5ms/cm之間或4ms/cm和5ms/cm之間中的任一。在一些實施方案中，洗脫緩沖液的電導率是約0.0ms/cm、0.5ms/cm、1.0ms/cm、1.5ms/cm、2.0ms/cm、2.5ms/cm、3.0ms/cm、3.5ms/cm、4ms/cm、4.5ms/cm、5.0ms/cm、5.5ms/cm、6.0ms/cm、6.5ms/cm或7.0ms/cm中的任一。在一些實施方案中，上述洗脫緩沖液用于混合模式oec、陰離子交換oec、陽離子交換oec、親和oec或hicoec。在一些實施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的電導率的電導率。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，洗脫緩沖液具有大于約5.5ms/cm、6.0ms/cm、6.5ms/cm、7.0ms/cm、7.5ms/cm、8.0ms/cm、8.5ms/cm、9.0ms/cm、9.5ms/cm、10ms/cm、11ms/cm、12ms/cm、13ms/cm、14ms/cm、15ms/cm、16ms/cm、17.0ms/cm、18.0ms/cm、19.0ms/cm、20.0ms/cm、21.0ms/cm、22.0ms/cm、23.0ms/cm、24.0ms/cm或25.0ms/cm中的任一的電導率。電導率可以在約5.5ms/cm和17ms/cm之間、6.0ms/cm和17ms/cm之間、7ms/cm和17ms/cm之間、8ms/cm和17ms/cm之間、9ms/cm和17ms/cm之間或10ms/cm和17ms/cm之間中的任一。在一些實施方案中，洗脫緩沖液的電導率是約5.5ms/cm、6.0ms/cm、6.5ms/cm、7.0ms/cm、7.5ms/cm、8.0ms/cm、8.5ms/cm、9.0ms/cm、9.5ms/cm、10ms/cm、11ms/cm、12ms/cm、13ms/cm、14ms/cm、15ms/cm、16ms/cm或17.0ms/cm中的任一。在一些實施方案中，上述洗脫緩沖液用于混合模式oec、陰離子交換oec、陽離子交換oec、親和oec或hicoec。在一些實施方案中，在約4至約1ms/cm的電導率中，從混合模式層析上洗脫多肽。在一些實施方案中，在約4至約1ms/cm的電導率中，從captoadhere層析上洗脫多肽。在一些實施方案中，在約4ms/cm至約1ms/cm的電導率中，從captoadhere層析上洗脫抗體或其片段。在任何上述實施方案的一些方面，通過階梯梯度或線性梯度，洗脫緩沖液的電導率改變自裝載和/或洗滌緩沖液的電導率。在本發明的一些實施方案中，在具有約5.5ms/cm電導率的緩沖液中，將包含多肽的組合物裝載到層析材料上，并在具有約4ms/cm電導率的洗脫緩沖液中從層析材料上洗脫多肽。在一些實施方案中，裝載緩沖液具有約5.5ms/cm的電導率并且洗脫緩沖液具有約3ms/cm的電導率。在一些實施方案中，裝載緩沖液具有約5.5ms/cm的電導率并且洗脫緩沖液具有約2ms/cm的電導率。在一些實施方案中，裝載緩沖液具有約5.5ms/cm的電導率并且洗脫緩沖液具有約1ms/cm的電導率。在上述實施方案的其他實施方案中，層析材料是captoadhere樹脂。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是抗體或其片段。在任何上述實施方案的一些方面，通過階梯梯度或通過線性梯度，洗脫緩沖液的電導率改變自裝載和/或洗滌緩沖液的電導率。在一些實施方案中，在約5.5ms/cm將包含多肽的組合物裝載到captoadhere層析上，并通過從約5.5ms/cm至約1ms/cm的線性電導率梯度在約5倍柱體積(cv)中從captoadhere層析上洗脫目標多肽。在一些實施方案中，在約5.5ms/cm將包含多肽的組合物裝載到captoadhere層析上，并通過從約5.5ms/cm至約1ms/cm的線性電導率梯度在10.0cv中從captoadhere層析上洗脫目標多肽。在一些實施方案中，在約10ms/cm將包含多肽的組合物裝載到captoadhere層析上，并通過從約10.0ms/cm至約1ms/cm的線性電導率梯度在約5cv中從captoadhere層析上洗脫目標多肽。在一些實施方案中，在約10ms/cm將包含多肽的組合物裝載到captoadhere層析上，并通過從約10.0ms/cm至約1ms/cm的線性電導率梯度在約10cv中從captoadhere層析上洗脫目標多肽。在一些實施方案中，在約10ms/cm將包含多肽的組合物裝載到captoadhere層析上，并通過從約10.0ms/cm至約1ms/cm的線性電導率梯度在約15cv中從captoadhere層析上洗脫目標多肽。在任何上述實施方案的一些方面，通過階梯梯度或通過線性梯度，洗脫緩沖液的電導率改變自裝載和/或洗滌緩沖液的電導率。在一些實施方案中，在約5.5ms/cm將包含多肽的組合物裝載到層析材料上，并通過在5.5ms/cm至1ms/cm之間的線性電導率梯度在5倍柱體積中，5.5ms/cm至1ms/cm在10倍柱體積中，從層析材料上洗脫目標多肽。在一些實施方案中，在約10ms/cm將包含多肽的組合物裝載到層析材料上，并通過在10.0ms/cm至1ms/cm之間的線性電導率梯度在5倍柱體積中，10.0ms/cm至約1ms/cm在10倍柱體積中，10.0ms/cm至1ms/cm在15倍柱體積中，從層析材料上洗脫目標多肽。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，裝載緩沖液具有小于約10、9、8、7、6或5中任一的ph。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，裝載緩沖液具有大于約4、5、6、7、8或9中任一的ph。裝載緩沖液可具有在約4和9之間、4和8之間、4和7之間、5和9之間、5和8之間、5和7之間、5和6之間中任一的ph。在一些實施方案中，裝載緩沖液的ph是約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8中的任一。ph可以是裝載緩沖液、平衡緩沖液或洗滌緩沖液的ph。在一些實施方案中，裝載緩沖液、平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液中的一種或多種的ph是相同的。在一些實施方案中，裝載緩沖液的ph不同于平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液的ph。在一些實施方案中，洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的ph的ph。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，洗脫緩沖液具有小于約8、7、6、5、4、3或2中的任一的ph。洗脫緩沖液的ph可以是在約4和9之間、4和8之間、4和7之間、4和6之間、4和5之間、5和9之間、5和8之間、5和7之間、5和6之間、6和9之間、6和8之間、6和7之間中的任一。在一些實施方案中，洗脫緩沖液的ph是約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0中的任一。在一些實施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的ph的ph。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，洗脫緩沖液具有大于約5、6、7、8或9中的任一的ph。洗脫緩沖液的ph可以是在約4和9之間、5和9之間、6和9之間、7和9之間、8和9之間、4和8之間、5和8之間、6和8之間、7和8之間、4和7之間、5和7之間，和6和7之間中的任一。在一些實施方案中，洗脫緩沖液的ph是約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0中的任一。在任何上述實施方案的一些方面，通過階梯梯度或線性梯度，洗脫緩沖液的ph改變自裝載和/或洗滌緩沖液的ph。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，流速小于約50cv/hr、40cv/hr或30cv/hr中的任一。流速可以是在約5cv/hr和50cv/hr之間、10cv/hr和40cv/hr之間，或18cv/hr和36cv/hr之間中的任一。在一些實施方案中，流速是約9cv/hr、18cv/hr、25cv/hr、30cv/hr、36cv/hr或40cv/hr中的任一。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，流速小于約100cm/hr、75cm/hr或50cm/hr中的任一。流速可以是在約25cm/hr和150cm/hr之間、25cm/hr和100cm/hr之間、50cm/hr和100cm/hr之間或65cm/hr和85cm/hr之間中的任一。床高度是所使用的層析材料的高度。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，床高度大于約3cm、10cm或15cm中的任一。床高度可以是在約3cm和35cm之間、5cm和15cm之間、3cm和10cm之間，或5cm和8cm之間中的任一。在一些實施方案中，床高度是約3cm、5cm、10cm，或15cm中的任一。在一些實施方案中，床高度是基于負載中的多肽或污染物的量決定的。在一些實施方案中，層析是在具有大于約1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、40ml、50ml、75ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml、800ml、900ml、1l、2l、3l、4l、5l、6l、7l、8l、9l、10l、25l、50l、100l、200l、300l、400l、500l、600l、700l、800l、900l或100l的體積的容器柱中。在本發明的一些實施方案中，從層析中收集級分。在一些實施方案中，收集的級分大于約0.01cv、0.02cv、0.03cv、0.04cv、0.05cv、0.06cv、0.07cv、0.08cv、0.09cv、0.1cv、0.2cv、0.3cv、0.4cv、0.5cv、0.6cv、0.7cv、0.8cv、0.9cv、1.0cv、2.0cv、3.0cv、4.0cv、5.0cv、6.0cv、7.0cv、8.0cv、9.0cv或10.0cv。在一些實施方案中，混合含有產物(例如多肽)的級分。在一些實施方案中，混合含有來自負載級分和來自洗脫級分的多肽的級分。本領域技術人員可以確定級分中的多肽的量；例如，可以通過uv光譜確定級分中的多肽的量。在一些實施方案中，混合含有可檢測的多肽片段的級分。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，至少一種污染物是宿主細胞材料，如chop；泄露的蛋白a；核酸；理想多肽的變體、片段、聚集物或衍生物；另一種多肽；內毒素；病毒性污染物；細胞培養基組分、羧肽酶b、慶大霉素等中的任何一種或多種。在一些例子中，污染物可以是來自例如但不限于細菌細胞，如大腸桿菌細胞、昆蟲細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞的宿主細胞蛋白質(hcp)。宿主細胞蛋白質(hcp)是來自生產多肽的細胞的蛋白質。例如，chop是來自宿主細胞的蛋白質，即，中華倉鼠卵巢蛋白質。可以通過酶聯免疫吸附測定法(“elisa”)或mesoscalediscovery(“mso”)測量chop的量。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，hcp(例如，chop)的量降低大于約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一。hcp的量可以降低約10％和99％之間、30％和95％之間,30％和99％之間、50％和95％之間,50％和99％之間、75％和99％之間，或85％和99％之間中的任一。在一些實施方案中，hcp的量可以降低約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或98％中的任一。在一些實施方案中，通過比較從(一個或多個)純化步驟回收的組合物中的hcp的量和在(一個或多個)純化步驟之前的組合物中的hcp的量，確定降低。聚集的多肽可以是高分子量(hmw)蛋白質。在一些實施方案中，聚集的多肽是目標多肽的多聚物。hmw蛋白質可以是二聚體，多至8x單體，或更大的目標多肽。用于測量聚集的蛋白質(例如，hmw蛋白質)的方法是本領域已知的，并描述在實施例章節中。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，聚集的蛋白質的量降低大于約5％,10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一。聚集的蛋白質的量可以降低約10％和99％之間、30％和95％之間、30％和99％之間、50％和95％之間、50％和99％之間、75％和99％之間，或85％和99％之間中的任一。聚集的蛋白質的量可以降低約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一。在一些實施方案中，通過比較從(一個或多個)純化步驟回收的組合物中的聚集的蛋白質(例如，hmw蛋白質)的量和在(一個或多個)純化步驟之前的組合物中的聚集的蛋白質(例如，hmw蛋白質)的量，確定降低。片段多肽可以是低分子量(lmw)蛋白質。在一些實施方案中，片段化多肽是目標多肽的片段。lmw蛋白質的例子包括但不限于：fab(片段抗原結合)、fc(片段，可結晶)區或目標抗體的兩種或任何隨機片段化部分的組合。測量片段化蛋白質(例如，lmw蛋白質)的方法是本領域已知的，并描述在實施例章節中。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，lmw蛋白質的量降低大于約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一。lmw蛋白質的量可以降低約10％和99％之間、30％和95％之間、30％和99％之間、50％和95％之間、50％和99％之間、75％和99％之間，或85％和99％之間中的任一。lmw蛋白質的量可以降低約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一。在一些實施方案中，通過比較從(一個或多個)純化步驟回收的組合物中的片段化蛋白質(例如，lmw蛋白質)的量和在(一個或多個)純化步驟之前的組合物中的片段化蛋白質(例如，lmw蛋白質)的量，確定降低。泄露的蛋白a是從其所結合的固相上脫離或洗下的蛋白a。例如，泄露的蛋白a可以是從蛋白a層析柱上泄露的。可以通過例如elisa測量蛋白a的量。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，泄露的蛋白a的量降低大于約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一。泄露的蛋白a的量可以降低約10％和99％之間、30％和95％之間、30％和99％之間、50％和95％之間、50％和99％之間、75％和99％之間，或85％和99％之間中的任一。在一些實施方案中，泄露的蛋白a的量降低約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一。在一些實施方案中，通過比較從(一個或多個)純化步驟回收的組合物中的泄露的蛋白a的量和在(一個或多個)純化步驟之前的組合物中的泄露的蛋白a的量，確定降低。測量dna(如宿主細胞dna)的方法是本領域已知的，并描述在實施例章節中。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，dna的量降低大于約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一。dna的量可以降低約10％和99％之間、30％和95％之間、30％和99％之間、50％和95％之間、50％和99％之間、75％和99％之間，或85％和99％之間中的任一。dna的量可以降低約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％中的任一。在一些實施方案中，通過比較從(一個或多個)純化步驟回收的組合物中的dna的量和在(一個或多個)純化步驟之前的組合物中的dna的量，確定降低。細胞培養基組分指存在于細胞培養基中的組分。細胞培養基可以是在收獲細胞時的細胞培養基。在一些實施方案中，細胞培養基組分是慶大霉素。可以通過elisa測量慶大霉素的量。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，細胞培養基組分的量降低大于約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一。細胞培養基組分的量可以降低約10％和99％之間、30％和95％之間、30％和99％之間、50％和95％之間、50％和99％之間、75％和99％之間，或85％和99％之間中的任一。在一些實施方案中，細胞培養基組分的量降低約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％中的任一。在一些實施方案中，通過比較從(一個或多個)純化步驟回收的組合物中的細胞培養基組分的量和在(一個或多個)純化步驟之前的組合物中的細胞培養基組分的量，確定降低。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，方法還可以包括在本文所述的任何oec之前或之后的一個或多個的純化步驟。其他純化流程包括例如，離子交換層析，如陰離子交換層析和陽離子交換層析、親和層析，如蛋白a層析和蛋白g層析、混合模式層析,羥磷灰石層析；凝膠過濾層析；親和層析；凝膠電泳；透析；乙醇沉淀；逆相hplc；硅膠層析；層析聚焦；sds-page；硫酸銨沉淀；和金屬螯合柱以結合多肽的表位標記形式。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，方法還包括回收純化的多肽。在一些實施方案中，純化的多肽是從本文所述的任何純化步驟中回收的。層析步驟可以是陽離子交換層析、混合模式層析或蛋白a層析。在一些實施方案中，oec層析是混合模式層析，并且其他層析是陰離子交換層析。在一些實施方案中，oec層析是混合模式層析，并且其他層析是陽離子交換層析。在一些實施方案中，oec層析是混合模式層析，并且其他層析是hic層析。在一些實施方案中，oec層析是陰離子交換層析，并且其他層析是陽離子交換層析。在一些實施方案中，oec層析是陰離子交換層析，并且其他層析是混合模式層析。在一些實施方案中，oec層析是陰離子交換層析，并且其他層析是hic層析。在一些實施方案中，oec層析是陽離子交換層析，并且其他層析是陰離子交換層析。在一些實施方案中，oec層析是陽離子交換層析，其他層析是混合模式層析。在一些實施方案中，oec層析是陽離子交換層析，并且其他層析是hic層析。在一些實施方案中，oec層析是hic層析，并且其他層析是混合模式層析。在一些實施方案中，oec層析是hic層析，并且其他層析是陰離子交換層析。在一些實施方案中，oec層析是hic層析，并且其他層析是陽離子交換層析。在一些實施方案中，在oec后，通過病毒過濾進一步純化多肽。病毒過濾是去除多肽純化補料流中的病毒性污染物。病毒過濾的例子包括超濾和微濾。在一些實施方案中，使用細小病毒濾器純化多肽。在一些實施方案中，在用oec模式層析后濃縮多肽。濃縮方法的例子是本領域已知的，包括但不限于超濾和滲濾。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，方法還包括組合純化方法純化的多肽與可藥用的運載體。在一些實施方案中，本發明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約6.5的ph和約5.3ms/cm至約5.6ms/cm的電導率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到captoadhere樹脂上，裝載密度為每升captoadhere樹脂150-200g抗體；b)用約6.5的ph和約1ms/cm的電導率的包含100mm2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)的洗脫緩沖液，從樹脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實施方案中，本發明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約6.5的ph和約5.3ms/cm至約5.6ms/cm的電導率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到在1.6-10.8l柱中的captoadhere樹脂上，裝載密度為每升captoadhere樹脂70-180g抗體；b)用約6.5的ph和約1ms/cm的電導率的包含100mmmes的洗脫緩沖液，從樹脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實施方案中，本發明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約8.6的ph和小于約6ms/cm的電導率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到captoadhere樹脂上，裝載密度為每升captoadhere樹脂約200g抗體；b)用約6.5的ph和約1ms/cm的電導率的20mmmes的洗脫緩沖液，從樹脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實施方案中，本發明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約6.1的ph和小于約6ms/cm的電導率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到captoadhere樹脂上，裝載密度為每升captoadhere樹脂約200g抗體；b)用約6.0的ph和約0.65ms/cm的電導率的20mmmes的洗脫緩沖液，從樹脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實施方案中，本發明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約5.5的ph和小于約6ms/cm的電導率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到captoadhere樹脂上，裝載密度為每升captoadhere樹脂約200g抗體；b)用約4.9的ph和約1.1ms/cm的電導率的20mmmes的洗脫緩沖液，從樹脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實施方案中，本發明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約6.5的ph和小于約6ms/cm的電導率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到captoadhere樹脂上，裝載密度為每升captoadhere樹脂約200g抗體；b)用約6.5的ph和約1ms/cm的電導率的20mmmes的洗脫緩沖液，從樹脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實施方案中，本發明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約6.5的ph和小于約5.5ms/cm的電導率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到qma樹脂上，裝載密度為每升qma樹脂約103g抗體；b)用約6.5的ph和約1ms/cm的電導率的20mmmes的洗脫緩沖液，從樹脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實施方案中，本發明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約5.5的ph和小于約6ms/cm的電導率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到porosxs樹脂上，裝載密度為每升porosxs樹脂約200g抗體；b)用ph約5.5的50-350mm醋酸洗脫緩沖液，從樹脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實施方案中，本發明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約7.0的ph和小于約6ms/cm的電導率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到captommc樹脂上，裝載密度為每升captommc樹脂約147g抗體；b)用約6.5的ph和約1ms/cm的電導率的20mmmes的洗脫緩沖液，從樹脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。iii.多肽提供的多肽用于純化多肽的任何方法和包含通過本文所述方法純化的多肽的制劑中。在一些實施方案中，本發明提供了通過使用過載和洗脫層析，純化多肽的方法。在一些實施方案中，多肽是治療性多肽。在一些實施方案中，多肽是拮抗劑。在一些實施方案中，多肽是激動劑。在一些實施方案中，多肽是抗體。在一些實施方案中，多肽是經表位標記的。在一些實施方案中，多肽保留生物學和/或免疫學活性。在一些實施方案中，多肽是拮抗劑。在一些實施方案中，多肽啟動補體依賴性細胞毒性。在一些實施方案中，多肽是抗體或免疫粘附素。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是通過使用混合模式層析基質的oec純化的。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是通過使用陰離子交換層析基質的oec純化的。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是通過使用陽離子交換層析基質的oec純化的。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是通過使用hic層析基質的oec純化的。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是通過使用hap層析基質的oec純化的。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是通過使用親和層析基質的oec純化的。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是通過使用不是，或不包括陽離子交換層析的層析基質的oec純化的。在一些實施方案中，多肽具有大于約5,000道爾頓、10,000道爾頓、15,000道爾頓、25,000道爾頓、50,000道爾頓、75,000道爾頓、100,000道爾頓、125,000道爾頓或150,000道爾頓中任一的分子量。多肽可具有約50,000道爾頓至200,000道爾頓之間、或100,000道爾頓至200,000道爾頓之間中任一的分子量。可選的，本文使用的多肽可具有約120,000道爾頓或約25,000道爾頓的分子量。pi是等電點，是特定分子或表面不帶任何電荷的ph。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，多肽的pi可以是在約6至10之間、7至9之間，或8至9之間中的任一。在一些實施方案中，多肽具有約6、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10中任一的pi。待使用本文所述方法純化的多肽一般是使用重組技術生產的。用于生產重組蛋白質的方法描述在例如美國專利號5,534,615和4,816,567中，通過引用具體整合到本文中。在一些實施方案中，目標蛋白質是在cho細胞中生產的(參見例如wo94/11026)。當使用重組技術時，多肽可以在胞內生產、在周質空間生產或直接分泌到培養基中。可以從培養基或從宿主細胞裂解液中回收多肽。可以通過多種物理或化學的方法破裂用于表達多肽的細胞，如凍融循環、超聲、機械破裂或細胞裂解劑。如果多肽是在胞內生產的，作為第一步驟，通過例如離心或超濾去除宿主細胞或裂解的片段的微粒殘渣。carter等，bio/technology10：163-167(1992)描述了用于分離分泌到大腸桿菌周質空間中的多肽的流程。簡而言之，在存在醋酸鈉(ph3.5)、edta和苯甲磺酰氟(pmsf)的條件下，使細胞漿融解約30min。可以通過離心去除細胞殘渣。當多肽是分泌到培養基中時，一般首先使用可商購的多肽濃縮濾器，例如amicon或milliporepellicon超濾單元，濃縮來自這類表達體系的上清液。上述步驟中的任一步都可以包括蛋白酶抑制劑，如pmsf，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素，以抑制外來污染物的生長。可通過本發明方法純化的多肽的例子包括但不限于免疫球蛋白、免疫粘附素、抗體、酶、激素、融合蛋白、含有fc的蛋白質、免疫綴合物、細胞因子和白介素。多肽的例子包括但不限于：哺乳動物蛋白質，如腎素；激素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素a-鏈；胰島素b-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝血因子如因子viiic、因子ix、組織因子和vonwillebrands因子；抗凝血因子，如蛋白c；心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖維蛋白溶酶原激活劑，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-pa)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；rantes(受激活調節正常t細胞表達和分泌因子)；人巨噬細胞炎性蛋白(mip-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；muellerian-抑制性物質；松弛素a-鏈；松弛素b-鏈；原松弛素；小鼠促性腺激素相關肽；酶；微生物蛋白質，如β-內酰胺酶；dna酶；ige；細胞毒性t-淋巴細胞相關抗原(ctla)，如ctla-4；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(vegf)；激素或生長因子的受體；蛋白a或d；類風濕因子；神經營養因子如骨源性神經營養因子(bdnf)、神經營養因子-3、-4、-5或-6(nt-3、nt-4、nt-5或nt-6)或神經生長因子如ngf-b；血小板源性生長因子(pdgf)；成纖維細胞生長因子，如afgf和bfgf；表皮生長因子(egf)；轉化生長因子(tgf)，如tgf-α和tgf-β，包括tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、tgf-β4或tgf-β5；胰島素樣生長因子-i和-ii(igf-i和igf-ii)；des(1-3)-igf-i(腦igf-i)、胰島素樣生長因子結合蛋白質(igfbp)；細胞因子；cd蛋白，如cd3、cd4、cd8、cd19和cd20；紅細胞生成素；骨誘導性因子；免疫毒素；融合多肽，即，包含兩個或多個異源多肽或其片段并由重組核酸編碼的多肽；含有fc的多肽，例如包含與第二多肽融合的免疫球蛋白fc區或其片段的融合蛋白；免疫綴合物；骨形態生成蛋白(bmp)；干擾素，如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(csf)，例如m-csf、gm-csf和g-csf；白介素(il)，例如il-1至il-10；超氧化物歧化酶；t-細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒性抗原，例如aids衣殼的一部分；運輸蛋白；歸巢受體；地址素；調控蛋白；整聯蛋白如cd11a、cd11b、cd11c、cd18、icam、vla-4和vcam；腫瘤相關抗原，如ca125(卵巢癌抗原)或her2、her3或her4受體；免疫粘附素；和任何上述蛋白質的片段和/或變體，以及與蛋白質，包括例如任何上述蛋白質結合的抗體，包括抗體片段。(a)抗體在本文所述的任何方法的一些實施方案中，用于純化多肽的任何方法和包含通過本文所述方法純化的多肽的制劑中的多肽是抗體。抗體的分子靶包括cd蛋白及其配體，例如但不限于：(i)cd3、cd4、cd8、cd19、cd11a、cd20、cd22、cd34、cd40、cd79α(cd79a)和cd79β(cd79b)；(ii)erbb受體家族的成員，如egf受體、her2、her3或her4受體；(iii)細胞粘附分子，如lfa-1、mac1、p150,95、vla-4、icam-1、vcam和αv/β3整聯蛋白，包括其α或β亞基(例如，抗cd11a、抗cd18或抗cd11b抗體)；(iv)生長因子，如vegf；ige；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(ob)受體；mpl受體；ctla-4；蛋白c、br3、c-met、組織因子、β7等；和(v)細胞表面和跨膜腫瘤相關抗原(taa)，如美國專利號7,521,541中所述。其他示例性抗體包括選自但不限于：抗雌激素受體抗體、抗孕激素受體抗體、抗p53抗體、抗her-2/neu抗體、抗egfr抗體、抗組織蛋白酶d抗體、抗bcl-2抗體、抗e-鈣粘素抗體、抗ca125抗體、抗ca15-3抗體、抗ca19-9抗體、抗c-erbb-2抗體、抗p-糖蛋白抗體、抗cea抗體、抗視網膜母細胞瘤蛋白抗體、抗ras原癌蛋白抗體、抗lewisx抗體、抗ki-67抗體、抗pcna抗體、抗cd3抗體、抗cd4抗體、抗cd5抗體、抗cd7抗體、抗cd8抗體、抗cd9/p24抗體、抗cd10抗體、抗cd11a抗體、抗cd11c抗體、抗cd13抗體、抗cd14抗體、抗cd15抗體、抗cd19抗體、抗cd20抗體、抗cd22抗體、抗cd23抗體、抗cd30抗體、抗cd31抗體、抗cd33抗體、抗cd34抗體、抗cd35抗體、抗cd38抗體、抗cd41抗體、抗lca/cd45抗體、抗cd45ro抗體、抗cd45ra抗體、抗cd39抗體、抗cd100抗體、抗cd95/fas抗體、抗cd99抗體、抗cd106抗體、抗泛素抗體、抗cd71抗體、抗c-myc抗體、抗細胞角蛋白抗體、抗波形蛋白抗體、抗hpv蛋白質抗體、抗κ輕鏈抗體、抗λ輕鏈抗體、抗黑色素體抗體、抗前列腺特異性抗原抗體、抗s-100抗體、抗τ抗原抗體、抗纖維蛋白抗體、抗角蛋白抗體和抗tn-抗原抗體。(i)多克隆抗體在一些實施方案中，抗體是多克隆抗體。多克隆抗體優選由多次皮下(sc)或腹腔內(ip)注射相關抗原和佐劑的動物內產生。可使用雙功能劑或衍生劑，例如，馬來酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基綴合)、n-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、socl2，或r1n＝c＝nr，其中r和r1是不同的烷基，綴合相關抗原與對待免疫物種是免疫原性的多肽，例如鑰孔蟲血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過組合例如100μg或5μg多肽或綴合物(分別用于兔或小鼠)和3倍體積的弗氏完全佐劑，并在多個位點皮內注射所述溶液，來用抗原、免疫原性綴合物或衍生物免疫動物。1個月后，通過在多個位點皮下注射肽或綴合物的原始量的1/5至1/10和弗氏完全佐劑，強化動物。7至14天后，將動物放血，測定血清的抗體滴度。加強動物，直到滴度平臺。在一些實施方案中，用相同抗原與不同多肽綴合，和/或通過不同交聯劑綴合的綴合物加強動物。還在重組細胞培養物中作為多肽融合物生產綴合物。此外，恰當的使用聚集劑，如明礬，來增強免疫應答。(ii)單克隆抗體在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體。單克隆抗體是從基本均質的抗體群體中獲得的，即，構成群體的單個抗體是相同的和/或結合相同表位，除了在生產單克隆抗體的過程中產生的可能的變體外，這類變體一般只存在微量。因此，修飾語“單克隆”表示抗體的特征不是不同的或多克隆抗體的混合物。例如，單克隆抗體可以通過使用首先由kohler等，nature256:495(1975)描述的雜交瘤方法制備，或者可以由重組dna方法制備(美國專利號4,816,567)。在雜交瘤方法中，如本文所述接種小鼠或其他恰當的宿主動物，如田鼠，引發生產或能夠生產特異性結合用于免疫接種的多肽的抗體的淋巴細胞。可選的，可以在體外免疫淋巴細胞。然后，使用合適的融合劑(如聚乙二醇)，將淋巴細胞與骨髓瘤融合，形成雜交瘤細胞(goding,monoclonalantibodies：principlesandpractice，第59-103頁(academicpress,1986))。將如此制備的雜交瘤細胞接種并生長在合適的培養基中，所述培養基優選含有一種或多種抑制未融合的親代骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hgprt或hprt)，則用于雜交瘤的培養基一般將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(hat培養基)，上述物質阻止hgprt缺陷型細胞的生長。在一些實施方案中，骨髓瘤細胞是高效融合、支持選擇的抗體生產細胞的抗體的穩定高水平生產的那些細胞，并且對于培養基如hat培養基敏感。其中，在一些實施方案中，骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，如源自可獲得自salkinstitutecelldistributioncenter,sandiego,californiausa的mopc-21和mpc-11小鼠腫瘤，和可獲得自美國典型培養物收藏中心(americantypeculturecollection,rockville,marylandusa)的sp-2或x63-ag8-653細胞的細胞系。還描述了人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細胞系用于生產人單克隆抗體(kozbor,j.immunol.133:3001(1984)；brodeur等，monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications，第51-63頁(marceldekker,inc.,newyork,1987))。測定生長雜交瘤細胞的培養基生產針對抗原的單克隆抗體。在一些實施方案中，通過免疫沉淀或體外結合測定，如放射性免疫測定(ria)或酶聯免疫吸附測定(elisa)，確定雜交瘤細胞生產的單克隆抗體的結合特異性。可以通過munson等，anal.biochem.107:220(1980)的scatchard分析，確定單克隆抗體的結合親和力。在鑒別出生產具有理想的特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，可以通過極限稀釋法亞克隆所述克隆，并通過標準方法生長(goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice，第59-103頁(academicpress,1986))。用于該目的的合適培養基包括例如，d-mem或rpmi-1640培養基。此外，雜交瘤細胞可以作為動物的腹水腫瘤在體內生長。通過常規的免疫球蛋白純化工藝，例如，多肽a-sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，從培養基、腹水或血清中合適地分離由亞克隆分泌的單克隆抗體。使用常規方法(例如，通過使用能夠特異結合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)，對編碼單克隆抗體的dna方便地分離和測序。在一些實施方案中，雜交瘤細胞充當這類dna的來源。一經分離，就可以將dna放入表達載體中，然后將所述載體轉染到否則不生產免疫球蛋白多肽的宿主細胞中，如大腸桿菌細胞、猿類cos細胞、中華倉鼠卵巢(cho)細胞或骨髓瘤細胞，以在重組的宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。關于編碼抗體的dna在細菌中的重組表達的綜述包括skerra等，curr.opinioninimmunol.5:256-262(1993)和plückthun,immunol.revs.,130:151-188(1992)。在另一實施方案中，可以從使用mccafferty等，nature348:552-554(1990)描述的技術生成的抗體噬菌體文庫中，分離抗體或抗體片段。clackson等，nature352:624-628(1991)和marks等，j.mol.biol.222:581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。后續出版物描述了通過鏈改組生產高親和力(nm范圍)的人抗體(marks等，bio/technology10:779-783(1992))，以及組合感染和體內重組作為構建非常大的噬菌體文庫的對策(waterhouse等，nuc.acids.res.21:2265-2266(1993))。因此，這些技術是用于分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行的備選方案。dna也可以是修飾的，例如，通過用人重鏈和輕鏈恒定結構域的編碼序列替代同源的鼠序列(美國專利號4,816,567；morrison等，proc.natlacad.sci.usa81:6851(1984))，或者通過共價連接免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列。通常，這類非免疫球蛋白多肽取代抗體的恒定結構域，或者取代抗體的1個抗原組合位點的可變結構域，以生成包含具有對抗原的特異性的1個抗原組合位點和具有對不同抗原的特異性的另一個抗原組合位點的嵌合二價抗體。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，抗體是iga、igd、ige、igg或igm。在一些實施方案中，抗體是igg單克隆抗體。(iii)人源化抗體在一些實施方案中，抗體是人源化抗體。本領域已描述了用于人源化非人抗體的方法。在一些實施方案中，人源化抗體具有從非人來源導入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，通常來自“輸入”的可變結構域。人源化基本可以按照winter及其同事(jones等，nature321:522-525(1986)；riechmann等，nature332:323-327(1988)；verhoeyen等，science239:1534-1536(1988))的方法實施，通過用人抗體的相應序列取代超變區序列。因此，這類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中基本上少于整個人可變結構域被來自非人物種的相應序列取代。在實踐上，人源化抗體通常是這樣的人抗體，其中一些超變區殘基以及可能一些fr殘基被來自嚙齒類抗體的類似位點上的殘基取代。對于降低抗原性而言，待用于制備人源化抗體的輕鏈和重鏈的人可變結構域的選擇是非常重要的。根據所謂的“最適”方法，針對已知的人可變結構域序列的完整文庫，篩選嚙齒類抗體的可變結構域序列。接受與嚙齒類最近似的人序列作為人源化抗體的人框架區(fr)(sims等，j.immunol.151:2296(1993)；chothia等，j.mol.biol.196:901(1987))。另一種方法使用源自輕鏈或重鏈可變區的特定亞組的所有人抗體的共有序列的特定框架區。相同的框架可以用于若干種不同的人源化抗體(carter等，proc.natl.acad.sci.usa89:4285(1992)；presta等，j.immunol.151:2623(1993))。更重要的是，將要人源化的抗體保留了對抗原的高親和力和其他有利的生物學特性。為了實現這一目標，在方法的一些實施方案中，通過使用親代和人源化序列的三維模型分析親代序列和多種概念性的人源化產物的方法，制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是本領域技術人員可常規獲得的和熟知的。可獲得示例和展示選定的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構象結構的計算機程序。對這些展示物的觀察允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，即，分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力的殘基。藉此，可以從受體和輸入序列選擇和組合fr殘基，從而實現理想的抗體特征，如對于(一種或多種)靶抗原增加的親和力。一般而言，超變區殘基直接且大部分實質地參與影響抗原結合。(v)人抗體在一些實施方案中，抗體是人抗體。作為人源化的備選方案，可以生成人抗體。例如，現在可以生產轉基因動物(例如，小鼠)，所述轉基因動物在免疫接種后能夠在缺少內源性免疫球蛋白生產的條件下，生產完全的人抗體庫。例如，已描述了在嵌合和種系突變體小鼠中純合缺失抗體重鏈連接區(jh)基因導致對內源性抗體生產的完整抑制。在這類種系突變體小鼠中轉移人種系免疫球蛋白基因陣列將導致在抗原刺激后生產人抗體。參見例如jakobovits等，proc.natl.acad.sci.usa90:2551(1993)；jakobovits等，nature362:255-258(1993)；bruggermann等，yearinimmuno.7:33(1993)；和美國專利號5,591,669；5,589,369；和5,545,807。可選的，可以使用噬菌體展示技術(mccafferty等，nature348:552-553(1990))，從來自未免疫接種的供體的免疫球蛋白可變(v)結構域基因庫中，體外生產人抗體和抗體片段。根據該技術，將抗體v結構域基因符合讀框地克隆到絲狀噬菌體(如m13或fd)的主要或次要外殼多肽基因中，并作為功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面。由于絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈dna拷貝，基于抗體功能特性的選擇也導致選擇編碼表現出這些特性的抗體的基因。因此，噬菌體模擬了b細胞的一些特性。可以以多種方式實施噬菌體展示；其綜述參見例如johnson,kevins.和chiswell,davidj.,currentopinioninstructuralbiology3:564-571(1993)。v-基因區段的若干來源可用于噬菌體展示。clackson等，nature352:624-628(1991)從源自經免疫接種的小鼠的脾臟的v基因的小隨機組合文庫中，分離出抗惡唑酮抗體的多種陣列。可以構建來自未經免疫接種的人供體的v基因庫，并基本上按照marks等，j.mol.biol.222:581-597(1991)或griffith等，emboj.12:725-734(1993)描述的技術分離針對抗原(包括自身抗原)的多種陣列的抗體。還參見美國專利號5,565,332和5,573,905。還可以通過體外活化的b細胞生成人抗體(參見美國專利5,567,610和5,229,275)。(v)抗體片段在一些實施方案中，抗體是抗體片段。已研發了多種用于生產抗體片段的技術。傳統上，這些片段是經由對完整抗體的蛋白水解消化得到的(參見例如，morimoto等，journalofbiochemicalandbiophysical方法24:107-117(1992)和brennan等，science229:81(1985))。然而，現在可以通過重組宿主細胞直接生產這些片段。例如，可以從如上所述的抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。可選的，可以直接從大腸桿菌中回收fab'-sh片段，并化學偶聯形成f(ab')2片段(carter等，bio/technology10:163-167(1992))。根據另一種方法，可以直接從重組宿主細胞培養物中分離f(ab')2片段。用于生產抗體片段的其他技術對本領域技術人員是顯而易見的。在其他實施方案中，選擇的抗體是單鏈fv片段(scfv)。參見wo93/16185；美國專利號5,571,894；和美國專利號5,587,458。抗體片段還可以是“線性抗體”，例如美國專利5,641,870所述。這類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。在一些實施方案中，提供了本文所述的抗體的片段。在一些實施方案中，抗體片段是抗原結合片段。在一些實施方案中，抗原結合片段選自由fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、scfv、fv和雙抗體組成的組。(vi)雙特異性抗體在一些實施方案中，抗體是雙特異性抗體。雙特異性抗體是具有對于至少2種不同的表位的結合特異性的抗體。示例性雙特異性抗體可結合2種不同的表位。可選的，雙特異性抗體結合臂可以與結合白細胞上的觸發分子的臂組合，所述觸發分子如t細胞受體分子(例如cd2或cd3)，或igg的fc受體(fcγr)，如fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)和fcγriii(cd16)，從而對細胞聚焦細胞防御機制。雙特異性抗體可以作為全長抗體或抗體片段(例如，f(ab')2雙特異性抗體)制備。用于制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統生產方法是基于共表達2條免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中2條鏈具有不同的特異性(millstein等，nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機搭配，這些雜交瘤(四價體瘤(quadroma))生產潛在的10種不同抗體分子的混合物，其中僅1種具有正確的雙特異性結構。通常通過親和層析步驟純化正確的分子，是非常麻煩的，產率也低。類似的方法公開在wo93/08829和traunecker等，emboj.,10:3655-3659(1991)中。根據不同的方法，融合具有理想的結合特異性的抗體可變結構域(抗體-抗原組合位點)和免疫球蛋白恒定結構域序列。在一些實施方案中，所述融合是與包含鉸鏈、ch2和ch3區的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定結構域融合。在一些實施方案中，含有輕鏈結合必需的位點的第一重鏈恒定區(ch1)存在于至少一種融合體中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及需要時，免疫球蛋白輕鏈的dna，插入到獨立的表達載體中，并共轉染到合適的宿主生物中。當在構建中使用的不等比例的3種多肽鏈提供了最佳產率時，這為調節實施方案中的3種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，當等比例的至少2種多肽鏈的表達獲得高產率時，或者當比例并非特別重要時，可以將2條或全部3條多肽鏈的編碼序列插入到1個表達載體中。在該方法的一些實施方案中，雙特異性抗體由在一臂中的具有第一結合特異性的雜合的免疫球蛋白重鏈，和在另一臂中的雜合的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。發現該不對稱結構協助從不需要的免疫球蛋白鏈的組合中分離理想的雙特異性化合物，因為僅一半的雙特異性分子存在免疫球蛋白輕鏈，提供了促進分離的方式。該方法公開在wo94/04690中。生成雙特異性抗體的其他細節參見例如suresh等，methodsinenzymology121:210(1986)。根據美國專利號5,731,168中描述的另一種方法，可以改造在一對抗體分子之間的界面，使從重組細胞培養物中回收的異二聚體百分比最大化。在一些實施方案中，界面至少包括抗體恒定結構域的ch3結構域的一部分。在該方法中，用較大的側鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)取代來自第一抗體分子的界面中的一個或多個小氨基酸側鏈。通過用較小的氨基酸側鏈(例如，丙氨酸或蘇氨酸)取代大的氨基酸側鏈，在第二抗體分子的界面上生成與(一個或多個)大側鏈相同或相似大小的補償性“空洞”。這為增加異二聚體相比其他不需要的終產物(如同二聚體)的產率提供了機制。雙特異性抗體包括交聯的或“異源綴合的”抗體。例如，異源綴合物中的抗體之一可以與抗生物素蛋白偶聯，另一個與生物素偶聯。已經提出這類抗體例如將免疫系統細胞靶向至不想要的細胞(美國專利號4,676,980)，和用于治療hiv感染(wo91/00360、wo92/200373和ep03089)。可以使用任何方便的交聯方法制備異源綴合抗體。合適的交聯劑是本領域普遍已知的，公開在美國專利號4,676,980中，還公開了多種其他的交聯技術。文獻中還描述了從抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如，可以使用化學連接制備雙特異性抗體。brennan等，science229：81(1985)描述了這樣的方法，其中完整抗體被蛋白水解切割以生成f(ab')2片段。在存在二巰基化物絡合劑亞砷酸鈉的條件下，還原這些片段，以穩定鄰位的二巰基化物，阻止形成分子間二硫鍵。然后，生成的fab'片段被轉化成硫代硝基苯甲酸鹽(thionitrobenzoate)(tnb)衍生物。然后，通過用巰基乙胺還原，將fab'-tnb衍生物中的一種再轉化為fab'-巰基，并與等摩爾量的其他fab'-tnb衍生物混合以形成雙特異性抗體。生產的雙特異性抗體可用作用于酶的選擇性固定的活性劑。還描述了用于制備和從重組細胞培養物中直接分離雙特異性抗體片段的多種技術。例如，使用亮氨酸拉鏈生產雙特異性抗體。kostelny等，j.immunol.148(5):1547-1553(1992)。通過基因融合，連接來自fos和jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與2個不同抗體的fab'部分。在鉸鏈區還原抗體同二聚體形成單體，并然后重新氧化形成抗體異二聚體。該方法還可用于生產抗體同二聚體。hollinger等，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)描述的“雙抗體”技術提供了用于制備雙特異性抗體片段的備選機制。片段包含通過接頭與輕鏈可變結構域(vl)相連的重鏈可變結構域(vh)，所述接頭太短以至不允許同一鏈上的2個結構域配對。因此，強迫1個片段的vh和vl結構域與另一個片段的的互補的vl和vh結構域配對，從而形成2個抗原結合位點。還報道了另一種通過使用單鏈fv(sfv)二聚體制備雙特異性抗體片段的對策。參見gruber等，j.immunol.152:5368(1994)。考慮具有二價以上的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。tutt等，j.immunol.147：60(1991)。(vii)多價抗體在一些實施方案中，抗體是多價抗體。多價抗體可以比二價抗體更快地被表達抗體所結合的抗原的細胞內化(和/或異化)。本文提供的抗體可以是具有3個或多個抗原結合位點(例如，四價抗體)的多價抗體(是除igm類以外的)，其可以通過重組表達編碼抗體多肽鏈的核酸而方便的生產。多價抗體可包含二聚化結構域和3個或多個抗原結合位點。優選的二聚化結構域包含fc區或鉸鏈區(或由之組成)。在該方案中，抗體將包含fc區和3個或多個在fc區氨基末端的抗原結合位點。本文中優選的多價抗體包含3個至約8個，但優選4個抗原結合位點(或由之組成)。多價抗體至少包含一條多肽鏈(并優選2條多肽鏈)，其中(一條或多條)多肽鏈包含2個或更多個可變結構域。例如，(一條或多條)多肽鏈可包含vd1-(x1)n-vd2-(x2)n-fc，其中vd1是第一可變結構域，vd2是第二可變結構域，fc是fc區中的1條多肽鏈，x1和x2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，(一條或多條)多肽鏈可包含：vh-ch1-柔性接頭-vh-ch1-fc區鏈；或vh-ch1-vh-ch1-fc區鏈。本文中的多價抗體優選還包含至少2條(并優選4條)輕鏈可變結構域多肽。本文中的多價抗體可例如包含從約2條至約8條輕鏈可變結構域多肽。本文考慮的輕鏈可變結構域多肽包含輕鏈可變結構域，和任選地還包含cl結構域。在一些實施方案中，抗體是多特異性抗體。多特異性抗體的例子包括但不限于：包含重鏈可變結構域(vh)和輕鏈可變結構域(vl)的抗體，其中vhvl單元具有多表位特異性；具有2個或多個vl和vh結構域的抗體，每個vhvl單元結合不同的表位；具有2個或多個單可變結構域的抗體，每個單可變結構域結合不同的表位；已經共價或非共價連接的全長抗體、抗體片段，如fab、fv、dsfv、scfv、雙抗體、雙特異性雙抗體、三價抗體、三功能抗體、抗體片段。在一些實施方案中，抗體具有多表位特異性；例如特異性結合位于相同或不同靶位上的2個或更多個不同表位的能力。在一些實施方案中，抗體是單特異性的；例如，僅結合1個表位的抗體。根據一個實施方案，多特異性抗體是以5μm至0.001pm、3μm至0.001pm、1μm至0.001pm、0.5μm至0.001pm，或0.1μm至0.001pm的親和力結合每個表位的igg抗體。(viii)其他的抗體修飾理想的是關于效應子功能修飾本文提供的抗體，從而例如增強抗體的抗原依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)和/或補體依賴性細胞毒性(cdc)。這可以是通過在抗體的fc區中導入一個或多個氨基酸替換實現的。可選的或額外的，可以在fc區中導入(一個或多個)半胱氨酸殘基，從而允許在該區形成鏈間二硫鍵。因而生成的同二聚體抗體可具有改善的內化能力和/或增加的補體介導的細胞殺傷和抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)。參見caron等，j.expmed.176:1191-1195(1992)和shopes,b.j.,immunol.148:2918-2922(1992)。還可以使用wolff等，cancerresearch53:2560-2565(1993)所述的異雙功能交聯接頭，制備具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體。可選的，具有雙重fc區的抗體可被改造，并從而可具有增強的補體介導的裂解和adcc能力。參見stevenson等，anti-cancerdrugdesign3:219-230(1989)。為了增加抗體的血清半衰期，可以如us2006/0067930所述在抗體中產生氨基酸改變，其通過引用全文整合到本文中。(b)多肽變體和修飾本文所述的多肽，包括抗體的(一種或多種)氨基酸序列修飾可用于純化本文所述的多肽(例如，抗體)的方法。(i)變體多肽“多肽變體”意指這樣的多肽，優選活性多肽，所述多肽如本文定義與多肽的全長天然序列、缺少信號肽的多肽序列、多肽的有或無信號肽的胞外結構域具有至少約80％的氨基酸序列同一性。這類多肽變體包括例如這樣的多肽，其中在全長天然氨基酸序列的n或c-末端添加或缺失了一個或多個氨基酸殘基。通常，tat多肽變體將與全長天然序列多肽序列、缺少信號肽的多肽序列、多肽的有或無信號肽的胞外結構域具有至少約80％氨基酸序列同一性，可選的至少約85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一的氨基酸序列同一性。任選的，相比天然的多肽序列，變體多肽將具有不超過1個的保守氨基酸替換，可選的，相比天然的多肽序列，不超過約2、3、4、5、6、7、8、9或10個中任一的保守氨基酸替換。變體多肽可以在n端或c端截短，或者可缺少內部殘基，例如相比全長天然多肽時。某些變體多肽可缺少對理想的生物學活性不必需的氨基酸殘基。可以通過多種常規技術中的任一種制備這些具有截短、缺失和插入的變體多肽。理想的變體多肽可以是化學合成的。另一種合適的技術涉及分離和通過聚合酶鏈式反應(pcr)擴增編碼理想的變體多肽的核酸片段。在pcr中的5'和3'引物處應用定義核酸片段的理想的末端的寡核苷酸。優選的，變體多肽與本文公開的天然多肽共享至少一種生物學和/或免疫學活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合物，長度范圍從1個殘基至含有上百個或更多個殘基的多肽，以及在序列內插入單個或多個氨基酸殘基。末端插入的例子包括具有n-末端甲硫氨酰殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體。抗體分子的其他插入變體包括抗體的n-或c-末端與酶或多肽的融合體，所述酶或多肽增加了抗體的血清半壽期。例如，理想的是改善多肽的結合親和力和/或其他生物學特性。通過向抗體核酸中導入恰當的核苷酸改變，或通過肽合成，制備多肽的氨基酸序列變體。這類修飾包括例如在多肽的氨基酸序列中缺失和/或插入和/或替換殘基。在最終構建體中實現刪除、插入和替換的任意組合，只要最終構建體具有理想的特征。氨基酸改變也可以改變多肽(例如，抗體)的翻譯后過程，如改變糖基化位點的數量或位置。可以通過比較多肽序列與同源的已知多肽分子的序列并使高同源性區域中發生的氨基酸序列改變的數量最小化，發現用于確定可以插入、替換或缺失哪個氨基酸殘基而對理想活性沒有負面影響的指導條例。用于鑒別多肽(例如，抗體)的某些殘基或區是用于誘變的優選的位置的有效方法被稱為“丙氨酸篩選誘變”，如cunningham和wells,science244:1081-1085(1989)中所述。在本文中，鑒別了殘基或靶殘基的組(例如，帶電殘基，如arg、asp、his、lys和glu)，并通過中性或帶負電的氨基酸(最優選丙氨酸或苯丙氨酸)取代，影響氨基酸與抗原的相互作用。然后，通過在，或對于取代位點導入另外的或其他的變體，細化那些對替換表現出功能敏感性的氨基酸位置。因此，盡管用于導入氨基酸序列變異的位點是預先確定的，突變的本質本身是不需要預先確定的。例如，為了分析在給定位點突變的表現，在靶密碼子或區進行ala篩選或隨機誘變，并篩選具有理想活性的表達的抗體變體。另一種變體類型是氨基酸替換變體。這些變體的抗體分子中具有至少一個氨基酸殘基被不同的殘基取代。替換誘變最感興趣的位點包括超變區，但也考慮fr改變。下表1在“優選替換”的標題下顯示了保守替換。如果這類替換導致生物學活性的改變，則可以導入更實質性的改變(在表1中命名為“示例性替換”)或如下文參照氨基酸類別時進一步所述，并篩選產物。表1.原始殘基示例性替換優選替換ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；asp,lys；argglnasp(d)glu；asnglucys(c)ser；alasergln(q)asn；gluasnglu(e)asp；glnaspgly(g)alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leuleu(l)正亮氨酸；ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)trp；leu；val；ile；ala；tyrtyrpro(p)alaalaserthrthrthr(t)val；sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸leu通過選擇這樣的替換，實現對多肽生物學特性的實質性修飾，所述替換維持(a)替換區域中的多肽骨架結構，例如，作為片層或螺旋構象；(b)分子在靶位點的電荷或疏水性；或(c)側鏈體積的效果顯著不同。可以根據其側鏈特性的相似性對氨基酸分組(a.l.lehninger,biochemistry，第2版，第73-75頁，worthpublishers,newyork(1975))：(1)非極性：ala(a)、val(v)、leu(l)、ile(i)、pro(p)、phe(f)、trp(w)、met(m)(2)不帶電的極性：gly(g)、ser、thr(t)、cys(c)、tyr(y)、asn(n)、gln(q)(3)酸性：asp(d)、glu(e)(4)堿性：lys(k)、arg(r)、his(h)可選的，可以基于共同的側鏈特性，將天然存在的殘基分組：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)堿性：his、lys、arg；(5)影響鏈取向的殘基：gly、pro；(6)芳香族：trp、tyr、phe。非保守替換限定為將上述類型之一的成員交換為另一種類型。還可以替換不參與維持抗體的正確構象的任何半胱氨酸殘基，一般是用絲氨酸，以改善分子的氧化穩定性，并阻止異常交聯。相反，可以向多肽添加(一個或多個)半胱氨酸鍵，以改善穩定性(特別的是當抗體是抗體片段，如fv片段時)。特別優選的替換變體類型涉及替換親代抗體(例如，人源化抗體)的一個或多個超變區殘基。一般而言，所獲得的選定用于進一步研發的(一種或多種)變體將具有相對于生成其的親代抗體改善的生物學特性。用于生成這類替換變體的常規方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡而言之，突變若干超變區位點(例如，6-7個位點)，以在每個位點生成所有的可能的氨基替換。如此生成的抗體變體以絲狀噬菌體顆粒的單價形式展示，作為與包裝在每個顆粒中的m13的基因iii產物的融合物。然后，如本文公開的篩選經噬菌體展示的變體的生物學活性(例如，結合親和力)。為了鑒別用于修飾的候選超變區位點，可以實施丙氨酸掃描誘變，鑒別對抗原結合有顯著貢獻的超變區殘基。可選的或額外的，有利的是分析抗原-抗體復合物的晶體結構以鑒別抗體和靶之間的接觸點。這類接觸殘基和臨近的殘基是根據本文所述技術進行替換的候選物。一旦生成這類變體，就將變體組進行本文所述的篩選，并可以選擇在一個或多個相關測定法中具有優秀特性的抗體用于進一步研發。多肽的另一種類型的氨基酸變體改變了抗體的原始糖基化模式。多肽可包含非氨基酸部分。例如，多肽可以是糖基化的。這類糖基化可以在宿主細胞或宿主生物表達多肽的過程中天然發生，或者可以是由人為干預產生的故意的修飾。改變意指刪除多肽中可見的一個或多個碳水化合物部分，和/或添加多肽中不存在的一個或多個糖基化位點。多肽糖基化通常是n-連接的或o-連接的。n-連接的指碳水化合物部分連接到天冬酰胺殘基的側鏈。三肽序列天冬酰胺-x-絲氨酸和天冬酰胺-x-蘇氨酸，其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸，是用于酶促連接碳水化合物部分和天冬酰胺側鏈的識別序列。因此，多肽中存在這些三肽序列之一產生了潛在的糖基化位點。o-連接糖基化指連接糖n-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥基氨基酸，最常見是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。通過改變氨基酸序列使其含有上述三肽序列中的一種或多種，方便地實現向多肽添加糖基化位點(用于n-連接的糖基化位點)。還可以通過對原始抗體的序列添加或替換一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基進行改變(用于o-連接的糖基化位點)。可以化學地、或酶促地、或通過突變替換編碼作為糖基化靶的氨基酸殘基的密碼子，實現去除存在于多肽上的碳水化合物部分。可以通過使用多種內切和外切糖苷酶，實現酶促切割多肽上的碳水化合物部分。其他修飾包括分別將谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基脫酰胺為相應的谷氨酰和天冬氨酰殘基，脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰和蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈的α-氨基的甲基化，n-末端胺的乙酰化，和任何c-末端羧基的酰胺化。(ii)嵌合多肽可以以形成包含與另一種異源多肽或氨基酸序列融合的多肽的嵌合分子的方式修飾本文描述的多肽。在一些實施方案中，嵌合分子包含多肽與標簽多肽的融合物，所述標簽多肽提供了抗標簽抗體可以選擇性結合的表位。表位標簽一般位于多肽的氨基或羧基末端。可以使用針對標簽多肽的抗體檢測多肽的這類經表位標記的形式的存在。此外，提供表位標簽使多肽能夠通過親和純化而方便的純化，所述親和純化使用抗標簽抗體或另一種類型的結合表位標簽的親和基質。在可選的實施方案中，嵌合分子可包含多肽與免疫球蛋白或與免疫球蛋白的特定區的融合物。嵌合分子的二價形式被稱為“免疫粘附素”。如本文中使用的，術語“免疫粘附素”表示組合了異源多肽的結合特異性與免疫球蛋白恒定結構域的效應子功能的抗體樣分子。在結構上，免疫粘附素包含具有理想的結合特異性的、除了抗體的抗原識別和結合位點以外的(即，是“異源的”)氨基酸序列與免疫球蛋白恒定結構域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是連續的氨基酸序列，至少包含受體或配體的結合位點。免疫粘附素的免疫球蛋白恒定結構域序列可以獲得自任何免疫球蛋白，如igg-1、igg-2、igg-3或igg-4亞型、iga(包括iga-1和iga-2)、ige、igd或igm。ig融合體優選包括用多肽的可溶的形式(刪除或失活了跨膜結構域)替換ig分子內的至少一個可變區。在特別優選的實施方案中，免疫球蛋白融合體包括igg1分子的鉸鏈、ch2和ch3，或鉸鏈、ch1、ch2和ch3區。(iii)多肽綴合物用于多肽制劑中的多肽可以與細胞毒性劑綴合，如化療劑、生長抑制劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性綴合物)。可以使用用于生成這類綴合物的化療劑。此外，可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉毒素a鏈、白喉毒素的非結合的活性片段、內毒素a鏈(來自綠膿假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素a鏈、相思豆毒素a鏈、塑蓮根毒素a鏈、α-帚曲霉素、油桐(aleuritesfordii)蛋白,石竹素蛋白、美洲商陸(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、石堿草(sapaonariaofficinalis)抑制劑、白樹毒素、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依諾霉素和tricothecene。可利用多種放射性核苷酸生產放射綴合的多肽。例子包括212bi、131i、131in、90y和186re。使用多種雙功能蛋白質偶聯劑，如n-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二巰基)丙酯(spdp)、亞氨基硫烷(it)、酰亞胺酯的雙功能衍生物(如二亞胺代己二酸二甲酯hcl)、活性酯(如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛類(如戊二醛)、雙疊氮化合物(如雙(對疊氮苯甲酰)己二胺)、雙重氮衍生物(如雙-(對重氮苯甲酰)-乙二胺)、二異氰酸鹽(如tolyene2,6-二異氰酸)和雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制備多肽和細胞毒性劑的綴合物。例如，可以如vitetta等，science238：1098(1987)所述制備蓖麻毒素免疫毒素。碳-14-標記的1-異硫氰基苯甲基3-甲基二乙烯三胺五乙酸(mx-dtpa)是示例性的用于綴合放射性核苷酸與多肽的螯合劑。本文還考慮了多肽與一種或多種小分子毒素(如加利車霉素、美登木素生物堿(maytansinoid)、trichothene和cc1065)以及這些毒素的具有毒素活性的衍生物的綴合物。美登木素生物堿是有絲分裂抑制劑，其通過抑制微管蛋白聚合發揮作用。美登素是從東非灌木齒葉美登木(maytenusserrata)中首次分離的。之后發現某些微生物也生產美登木素生物堿，如美登醇和c-3美登醇酯。還考慮合成的美登醇及其衍生物和類似物。存在許多本領域已知的用于制備多肽-美登木素生物堿綴合物的連接基團，包括例如在美國專利號5,208,020中公開的。連接基團包括二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定型基團、光不穩定型基團、肽酶不穩定型基團，或酯酶不穩定型基團，如上述專利中公開的，優選二硫化物和硫醚基團。接頭可以在多個位置與美登木素生物堿分子連接，取決于連接的類型。例如，可以通過使用常規的偶聯技術，通過與羥基反應形成酯鍵。反應可以發生在具有羥基的c-3位置、用羥甲基修飾的c-14位置、用羥基修飾的c-15位置和具有羥基的c-20位置。在優選的實施方案中，在美登醇或美登醇類似物的c-3位成鍵。另一種目標綴合物包含與一個或多個加利車霉素分子綴合的多肽。抗生素的加利車霉素家族能夠在亞皮摩爾濃度下產生雙鏈dna破裂。關于制備加利車霉素家族的綴合物，參見例如美國專利號5,712,374。可使用的加利車霉素的結構類似物包括但不限于：γ1i、α2i、α3i、n-乙酰-γ1i、psag和θ1i。抗體可以綴合的另一種抗腫瘤藥物是qfa，其是抗葉酸劑。加利車霉素和qfa都具有胞內作用位點，且都不易于越過細胞膜。因此，這些活性劑通過多肽(例如，抗體)介導的內化作用的細胞攝入，極大地增強了它們的細胞毒性效應。其他可與本文所述的多肽綴合的抗腫瘤劑包括bcnu、鏈脲霉素、長春新堿和5-氟尿嘧啶，被統稱為ll-e33288復合物的活性劑的家族，以及埃斯波霉素。在一些實施方案中，多肽可以是在多肽和具有核酸裂解活性的化合物(例如，核酶或dna內切核酸酶，如脫氧核糖核酸酶；dna酶)之間的綴合物。在另一個實施方案中，多肽(例如，抗體)可以與“受體”(如鏈霉親和素)綴合用于腫瘤預靶向，其中將多肽受體綴合物施用給患者，隨后使用清除劑從循環中去除未結合的綴合物，然后施用與細胞毒性劑(例如，放射性核苷酸)綴合的“配體”(例如，抗生物素蛋白)。在一些實施方案中，多肽可以與前藥活化酶綴合，所述酶將前藥(例如，肽類化療劑)轉化為活性抗癌藥。免疫綴合物的酶組分包括任何能夠作用于前藥，使其轉化為更高活性的細胞毒性形式的酶。有用的酶包括但不限于：可用于將含有磷酸鹽的前藥轉化為游離藥物的堿性磷酸酶；可用于將含有硫酸鹽的前藥轉化為游離藥物的芳基硫酸酯酶；可用于將無毒的5-氟胞嘧啶轉化為抗癌藥物，5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可用于將含有肽的前藥轉化為游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶b和l)；可用于轉化含有d-氨基酸取代基的前藥的d-丙氨酰羧肽酶；可用于將糖基化的前藥轉化為游離藥物的碳水化合物切割酶，如β-半乳糖苷酶和神經氨酸酶；可用于將用β-內酰胺衍生的藥物轉化為游離藥物的β-內酰胺酶；和可分別用于將用苯氧乙酰基或苯乙酰基在氨基氮處衍生的藥物轉化為游離藥物的青霉素酰胺酶，如青霉素v酰胺酶或青霉素g酰胺酶。可選的，可以使用具有酶促活性的抗體，在本領域也被稱為“抗體酶(abzyme)”，將前藥轉化為游離的活性藥物。(iv)其他多肽的另一種類型的共價修飾包含連接多肽與多種非蛋白質類聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。還可以將多肽包埋在微膠囊中，所述微膠囊是通過例如凝聚技術或通過界面聚合(分別例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)，在膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)中，或在粗乳液中制備的。這類技術公開在remington’spharmaceuticalsciences，第18版，gennaro,a.r.,編,(1990)中。iv.獲得用于制劑和方法中的多肽可以使用本領域普遍已知的方法獲得用于本文所述方法中的多肽，包括重組方法。下列章節提供了對這些方法的指導。(a)多核苷酸“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互換的使用，指任何長度的核苷酸聚合物，并且包括dna和rna。可以從任何來源獲得編碼多肽的多核苷酸，包括但不限于：從認為具有多肽mrna并以可檢測的水平表達所述mrna的組織制備的cdna文庫。因此，可以從來自人組織制備的cdna文庫中便利的獲得編碼多肽的多核苷酸。還可以從基因組文庫或者通過已知的合成方法(例如，自動化的核酸合成)獲得多肽編碼基因。例如，多核苷酸可以編碼整個免疫球蛋白分子鏈，如輕鏈或重鏈。完整的重鏈不僅包括重鏈可變區(vh)，還包括重鏈恒定區(ch)，所述重鏈恒定區通常包含3個恒定結構域：ch1、ch2和ch3；和“鉸鏈”區。在一些情況下，存在恒定區是理想的。可以由多核苷酸編碼的其他多肽包括結合抗原的抗體片段，如單結構域抗體(“dab”)、fv、scfv、fab'和f(ab')2和“微抗體(minibody)”。微抗體(通常)是二價的抗體片段，從中切除了ch1和ck或cl結構域。由于微抗體小于常規抗體，因此，其應該在臨床/診斷用途中實現更好的組織滲透性，但由于二價，其應該保持比單價抗體片段(如dab)更高的結合親和力。因此，除非上下文另外指出，否則本文使用的術語“抗體”不僅涵蓋完整的抗體分子，還涵蓋上述類型的結合抗原的抗體片段。優選地，存在于編碼的多肽中的每個框架區將包含相對于相應的人受體框架的至少一個氨基酸替換。因此，例如，框架區可包含相對于受體框架區的共計3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸替換。適當地，本文所述的多核苷酸可以是分離的和/或純化的。在一些實施方案中，多核苷酸是分離的多核苷酸。術語“分離的多核苷酸”意指分子是從其通常的或天然的環境中移出的或分離的，或者生產所述分子的方式使其不存在于其通常的或天然的環境中。在一些實施方案中，多核苷酸是純化的多核苷酸。術語“純化的”意指已經去除了至少一些污染分子或物質。適當地，多核苷酸是基本純化的，使相關的多核苷酸構成了組合物中存在的主要(即，最高豐度的)多核苷酸。(b)表達多核苷酸下列說明主要涉及通過培養用含有編碼多肽的多核苷酸的載體轉化或轉染的細胞生產多肽。當然，也考慮本領域普遍已知可用于制備多肽的備選方法。例如，可以通過使用固相技術的直接肽合成(參見例如，stewart等，solid-phasepeptidesynthesisw.h.freemanco.,sanfrancisco,calif.(1969)；merrifield,j.am.chem.soc.85:2149-2154(1963))，生產恰當的氨基酸序列或其部分。可以使用手工技術或通過自動化，實施體外蛋白質合成。可以使用例如appliedbiosystems肽合成儀(fostercity,calif.)和生產商的說明，實現自動化合成。多肽的多個部分可以單獨化學合成并使用化學或酶促方法組合以生產理想的多肽。將本文所述的多核苷酸插入到(一個或多個)表達載體中，用于生產多肽。術語“控制序列”指在特定的宿主生物中，表達有效連接的編碼序列所必需的dna序列。控制序列包括但不限于：啟動子(例如，天然相關的或異源啟動子)、信號序列、增強子元件和轉錄終止序列。當多核苷酸處于與另一種多核苷酸序列的功能性關系之中時，所述多核苷酸是“有效連接的”。例如，前序列或分泌先導序列的核酸是與多肽的核酸有效連接的如果其表達為參與多肽分泌的前蛋白；啟動子或增強子是與編碼序列有效連接的如果其影響序列的轉錄；或者核糖體結合位點是與編碼序列有效連接的如果其位置協助翻譯。一般而言，“有效連接的”意指連接的核酸序列是連續的，而在分泌先導序列的情況下，連接的核酸序列是連續的，并位于閱讀相中。然而，增強子不必是連續的。連接是通過在方便的限制性位點連接實現的。如果不存在這類位點，則根據常規實踐使用合成的寡核苷酸適體或接頭。對于抗體，輕鏈和重鏈可以克隆到相同或不同的表達載體中。編碼免疫球蛋白鏈的核酸片段是與(一個或多個)表達載體中的控制序列有效連接的，所述控制序列確保免疫球蛋白多肽的表達。可以通過普遍已知的方法，將含有多核苷酸序列(例如，可變重鏈和/或可變輕鏈編碼序列，和任選的表達控制序列)的載體轉移到宿主細胞中，所述方法取決于細胞宿主的類型而不同。例如，氯化鈣轉染是常用于原核細胞的，而磷酸鈣處理、電穿孔、脂質體轉染、生物微粒轟擊或基于病毒的轉染也可用于其他的細胞宿主(一般參見sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual(coldspringharborpress，第2版，1989)。用于轉化哺乳動物細胞的其他方法包括使用凝聚胺(polybrene)、原生質體融合、脂質體、電穿孔和顯微注射。對于生產轉基因動物，可以將轉基因顯微注射到受精卵中，或者可以摻入到胚胎干細胞的基因組中，和將這類細胞的核轉移到去核卵細胞中。(c)載體術語“載體”包括表達載體、轉化載體和穿梭載體。術語“表達載體”意指能夠在體內或體外表達的構建體。術語“轉化載體”意指能夠從一個對象轉移到另一個對象的構建體，所述對象可以是相同物種，或者可以是不同物種。如果構建體能夠從一種物種轉移到另一物種中，如從大腸桿菌(escherichiacoli)質粒轉移到細菌(如芽孢桿菌屬細菌)中，則轉化載體有時也被稱為“穿梭載體”。構建體甚至能夠從大腸桿菌質粒轉移到農桿菌(agrobacterium)，再到植物中。可以將載體轉化到如下所述的提供多肽的表達的合適的宿主細胞中。多種載體是可公開獲得的。載體可以是例如質粒、粘粒、病毒顆粒或噬菌體的形式。可以通過多種方法將合適的核酸序列插入到載體中。一般而言，使用本領域已知的技術，將dna插入到(一個或多個)恰當的限制性內切核酸酶位點中。構建含有一種或多種上述組分的合適載體應用了本領域技術人員已知的標準連接技術。載體可以是例如質粒、病毒或噬菌體載體，其提供了復制起點，任選用于表達所述多核苷酸的啟動子和任選所述啟動子的調控子。載體可含有本領域普遍已知的一個或多個可選擇的標志物基因。這些表達載體在宿主生物中通常是可復制的，作為附加體或作為宿主染色體dna的整合部分。(d)宿主細胞宿主細胞可以是例如細菌、酵母或其他真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細胞。被遺傳改造的轉基因多細胞宿主生物可用于生產多肽。生物可以是例如轉基因哺乳動物(例如，轉基因山羊或小鼠品系)。合適的原核生物包括但不限于真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸桿菌科(enterobacteriaceae)，如大腸桿菌。多種大腸桿菌菌株是可公眾獲得的，如大腸桿菌k12菌株mm294(atcc31,446)；大腸桿菌x1776(atcc31,537)；大腸桿菌菌株w3110(atcc27,325)和k5772(atcc53,635)。其他合適的原核宿主細胞包括腸桿菌科，如埃希氏菌(escherichia)，如大腸桿菌、腸桿菌屬(enterobacter)、歐文氏菌屬(erwinia)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙門氏菌屬(salmonella)，如鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬(serratia)，如粘質沙雷氏菌(serratiamarcescans)和志賀氏菌屬(shigella)，以及芽孢桿菌屬(bacilli)，如枯草芽孢桿菌(b.subtilis)和地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)(例如，地衣芽孢桿菌41p)、假單胞菌屬(pseudomonas)，如綠膿假單胞菌(p.aeruginosa)和鏈霉菌屬(streptomyces)。這些例子是示例性的，而非限制性的。菌株w3110是一個特別優選的宿主或親代宿主，因為它是用于重組多核苷酸產物發酵的通常的宿主菌株。優選地，宿主細胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，可以修飾菌株w3110，以在編碼宿主內源性多肽的基因中產生遺傳突變，這類宿主的例子包括大腸桿菌w3110菌株1a2，其具有完整的基因型tona；大腸桿菌w3110菌株9e4，其具有完整的基因型tonaptr3；大腸桿菌w3110菌株27c7(atcc55,244)，其具有完整的基因型tonaptr3phoae15(argf-lac)169degpomptkan'；大腸桿菌w3110菌株37d6，其具有完整的基因型tonaptr3phoae15(argf-lac)169degpomptrbs7ilvgkan'；大腸桿菌w3110菌株40b4，其是具有非卡那霉素抗性degp缺失突變的菌株37d6；和具有突變的周質蛋白酶的大腸桿菌菌株。可選的，體外克隆方法，例如pcr或其他核酸聚合酶反應是合適的。在這些原核宿主中，可以制備表達載體，所述表達載體通常含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如復制起點)。此外，可以存在任意數量的多種普遍已知的啟動子，如乳糖啟動子系統、色氨酸(trp)啟動子系統、β-內酰胺酶啟動子系統，或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常控制表達，任選地具有操縱子序列，和具有核糖體結合位點序列等，用于起始和完成轉錄和翻譯。可使用真核微生物表達。真核微生物，如絲狀真菌或酵母是多肽編碼載體的合適的克隆或表達宿主。釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其他的包括粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)；克魯維酵母屬(kluyveromyces)宿主，例如乳酸克魯維酵母(k.lactis)(mw98-8c、cbs683、cbs4574)、脆壁克魯維酵母(k.fragilis(atcc12,424))、保加利亞克魯維酵母(k.bulgaricus(atcc16,045))、威克克魯維酵母(k.wickeramii(atcc24,178))、k.waltii(atcc56,500)、果蠅克魯維酵母(k.drosophilarum(atcc36,906))、耐熱克魯維酵母(k.thermotolerans)和馬克思克魯維酵母(k.marxianus)；耶氏酵母屬(yarrowia(ep402,226))；巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)；假絲酵母屬(candida)；里氏木霉(trichodermareesia)；粗糙脈孢霉(neurosporacrassa)；許旺酵母屬(schwanniomyces)，如西方許旺酵母(schwanniomycesoccidentalis)；和絲狀真菌，如脈孢霉屬(neurospora)、青霉屬(penicillium)、彎頸霉屬(tolypocladium)和曲霉屬(aspergillus)宿主，如構巢曲霉(a.nidulans)和黑曲霉(a.niger)。甲基營養缺陷型酵母在本文中是合適的，包括但不限于：能夠在甲醇中生長的酵母，選自漢森酵母屬(hansenula)、假絲酵母屬、克勒克酵母屬(kloeckera)、畢赤酵母屬(pichia)、酵母屬(saccharomyces)、球擬酵母屬(torulopsis)和紅酵母屬(rhodotorula)組成的屬。酵母屬是優選的酵母宿主，其具有合適的載體，所述載體具有理想的表達控制序列(例如啟動子)、復制起點、終止序列等。典型的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。誘導型酵母啟動子尤其包括來自醇脫氫酶、異細胞色素c和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子等。除微生物以外，也可以使用哺乳動物組織細胞培養物表達和生產本文所述的多肽，且在一些情況下是優選的(參見winnacker,fromgenestoclonesvchpublishers,n.y.,n.y.(1987))。對于一些實施方案，真核細胞是優選的，因為本領域中已經研發了多種能夠分泌異源多肽(例如，整個免疫球蛋白)的合適的宿主細胞系，包括cho細胞系、多種cos細胞系、hela細胞，優選骨髓瘤細胞系或經轉化的b細胞或雜交瘤。在一些實施方案中，哺乳動物宿主細胞是cho細胞。在一些實施方案中，宿主細胞是脊椎動物宿主細胞。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子是用sv40(cos-7，atcccrl1651)轉化的猴腎cv1細胞系；人胎腎細胞系(293或亞克隆用于在懸浮培養物中生長的293細胞)；胎鼠腎細胞(bhk，atccccl10)；中華倉鼠卵巢細胞/-dhfr(cho或cho-dp-12細胞系)；小鼠支持細胞；猴腎細胞(cv1atccccl70)；非洲綠猴腎細胞(vero-76，atcccrl-1587)；人宮頸癌細胞(hela，atccccl2)；犬腎細胞(mdck，atccccl34)；布法羅大鼠肝細胞(brl3a，atcccrl1442)；人肺細胞(w138，atccccl75)；人肝細胞(hepg2,hb8065)；小鼠乳腺腫瘤(mmt060562，atccccl51)；tri細胞；mrc5細胞；fs4細胞；和人肝細胞瘤細胞系(hepg2)。v.制劑和制備制劑的方法本文還提供了包含通過本文所述方法純化的多肽(例如，抗體)的制劑，和制備制劑的方法。例如，純化的多肽可以與可藥用的運載體組合。在一些實施方案中，通過混合具有理想純度的多肽與任選的可藥用的運載體、賦形劑或穩定劑(remington’spharmaceuticalsciences，第16版，osol、a.編著(1980))，可以制備多肽制劑用于以凍干制劑或含水溶液的形式儲藏。本文使用的“運載體”包括可藥用的運載體、賦形劑或穩定劑，其對在應用的劑量和濃度下暴露于其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理上可接受的運載體是含水的ph緩沖溶液。可接受的運載體、賦形劑或穩定劑在所用劑量和濃度下對受體是無毒的，并且包括緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如，十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；烷基對羥基苯甲酸酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；雷鎖酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如edta；糖類，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽的反離子，如鈉；金屬復合物(例如，zn-蛋白質復合物)和/或非離子型表面活性劑，如tweentm、pluronicstm或聚乙二醇(peg)。在一些實施方案中，多肽制劑中的多肽保持了功能性活性。用于體內施用的制劑必須是無菌的。可以通過無菌濾膜過濾方便的實現。本文中的制劑還可含有對治療的特定適應癥所必需的一種以上的活性化合物，優選地是具有并不不利地影響彼此的互補活性的那些化合物。例如，除多肽外，理想的是在一個制劑內包括額外的多肽(例如，抗體)。可選的或額外的，組合物還可包含化療劑、細胞毒性劑、細胞因子、生長抑制劑、抗激素劑和/或心血管保護劑。這類分子合適的以對預期目的有效的量的組合存在。v.制品由本文所述的方法純化的多肽和/或包含通過本文所述方法純化的多肽的制劑可以包含在制品中。制品可包含含有多肽和/或多肽制劑的容器。優選地，制品包含：(a)容器，所述容器在容器中包含含有本文所述的多肽或多肽制劑的組合物；和(b)具有用于向對象施用制劑的說明的包裝說明書。制品包含容器，和位于容器上或與容器相連的標簽或包裝說明書。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以用多種材料制成，如玻璃或塑料。容器持有或含有制劑，并可具有無菌的進口(例如，容器可以是靜脈溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶)。組合物中的至少一種活性劑是多肽。標簽或包裝說明書說明了組合物在對象中的用途，對所提供的多肽和任何其他藥物的給藥劑量和時間間隔給予具體指導。制品還可以包括其他從商業和用戶角度有利的材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。在一些實施方案中，容器是注射器。在一些實施方案中，注射器還包含在注射裝置中。在一些實施方案中，注射裝置是自動注射器。“包裝說明書”用于指習慣性地包含在治療性產物的商業包裝中的說明書，含有關于適應癥、用法、劑量、施用、禁忌癥候，與包裝產物組合的其他治療性產物的信息，和/或對使用這類治療性產物的警告。vi.示例性實施方案在一些實施方案中，本發明提供了用于從包含多肽和一種或多種污染物的組合物中純化多肽的方法，所述方法包括a)以超過層析材料對于多肽的動態結合容量的量將組合物裝載到層析材料上，b)在其中一種或多種污染物仍然與層析材料結合的條件下，從層析材料上洗脫多肽，和c)混合包含步驟a)和b)的層析流出液中的多肽的級分。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是抗體或免疫粘附素。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是免疫粘附素。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是抗體。在上述實施方案的其他實施方案中，抗體是單克隆抗體。在上述實施方案的另一實施方案中，單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在上述實施方案的其他實施方案中，單克隆抗體是igg單克隆抗體。在上述實施方案的其他實施方案中，抗體是抗原結合片段。在上述實施方案的另一實施方案中，抗原結合片段選自fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、scfv、di-scfv、bi-scfv、串聯(di,tri)-scfv、fv、sdab、三功能抗體、bite、雙抗體或三價抗體。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽選自酶、激素、融合蛋白、含有fc的蛋白質、免疫綴合物、細胞因子或白介素。在上述實施方案的其他實施方案中，至少一種污染物是中華倉鼠卵巢蛋白(chop)、宿主細胞蛋白(hcp)、泄露的蛋白a、羧肽酶b、核酸、dna、產物變體、聚集的蛋白質、細胞培養基組分、慶大霉素、多肽片段、內毒素和病毒性污染物中的任何一種或多種。在上述實施方案的其他實施方案中，層析材料選自混合模式材料、陰離子交換材料、疏水性相互作用材料和親和材料。在上述實施方案的其他實施方案中，裝載密度在約50g/l至約2000g/l之間。在上述實施方案的另一實施方案中，裝載密度在約200g/l至約1000g/l之間。在上述實施方案的其他實施方案中，以約層析材料對于一種或多種污染物的動態結合容量將組合物裝載到層析材料上。在上述實施方案的其他實施方案中，以層析材料對于多肽的動態結合容量的20倍將組合物裝載到層析材料上。在上述實施方案的其他實施方案中，層析材料的多肽分配系數大于30。在上述實施方案的仍然其他的實施方案中，層析材料的多肽分配系數大于100。在上述實施方案的其他實施方案中，方法還包括使用裝載緩沖液和洗脫緩沖液。在上述實施方案的其他實施方案中，洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的電導率的電導率。在上述實施方案的其他實施方案中，裝載緩沖液具有約4.0ms至約7.0ms的電導率。在上述實施方案的其他實施方案中，洗脫緩沖液具有約0.0ms至約7.0ms的電導率。在上述實施方案的其他實施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的電導率的電導率。在上述實施方案的其他實施方案中，裝載緩沖液具有約4.0ms至約7.0ms的電導率。在上述實施方案的其他實施方案中，洗脫緩沖液具有約5.5ms至約17.0ms的電導率。在上述實施方案的其他實施方案中，洗脫緩沖液的電導率在約10倍柱體積(cv)中以從約5.5ms至約1.0ms的梯度減少。在上述實施方案的其他實施方案中，洗脫緩沖液的電導率在約15cv中以從約5.5ms至約1.0ms的梯度減少。在上述實施方案的其他實施方案中，洗脫緩沖液的電導率在約5cv中以從約10.0ms至約1.0ms的梯度減少。在上述實施方案的其他實施方案中，洗脫緩沖液的電導率在約10倍cv中以從約10.9ms至約1.0ms的梯度減少。在上述實施方案的其他實施方案中，洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的ph的ph。在上述實施方案的其他實施方案中，裝載緩沖液具有約4至約9的ph。在上述實施方案的其他實施方案中，洗脫緩沖液具有約4至約9的ph。在上述實施方案的其他實施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的ph的ph。在上述實施方案的其他實施方案中，裝載緩沖液具有約4至約9的ph。在上述實施方案的其他實施方案中，洗脫緩沖液具有約4至約9的ph。在上述實施方案的其他實施方案中，組合物是來自親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析和疏水性相互作用層析的洗出液。在上述實施方案的其他實施方案中，親和層析是蛋白a層析.在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是進一步純化的。在上述實施方案的仍然其他的實施方案中，多肽是通過病毒過濾進一步純化的。在上述實施方案的仍然其他的實施方案中，多肽是通過親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析或疏水性相互作用層析中的一種或多種進一步純化的。在上述實施方案的其他實施方案中，多肽是進一步濃縮的。在上述實施方案的仍然其他的實施方案中，多肽是通過超濾、滲濾或超濾和滲濾的組合而濃縮的。在上述實施方案的其他實施方案中，方法還包括組合多肽與可藥用的運載體。本說明書中公開的所有特征都可以以任何組合方式組合。本說明書中公開的每個特征都可以被用于相同、等價或相似目的的備選特征取代。因此，除非另外明確指出，否則所公開的每個特征都只是一系列等價或相似特征的例子。下列非限制性的例子示例了本發明的其他細節。說明書中所有參考文獻的公開內容都通過引用明確整合到本文中。實施例下列實施例僅用于純粹的示例本發明，不應被視為以任何方式限制本發明。下列實施例和詳細的說明書僅供示例，而不作為限制。材料和方法除非實施例中另外指出，否則所有實施例的材料和方法都如下所示實施。mab原料所有實施例的mab原料都選自genentech(southsanfrancisco,ca,u.s.a.)的工業的、試驗性的或小規模的細胞培養批次。在細胞培養發酵期后，分離細胞，并通過蛋白a層析純化澄清的液體。蛋白a混合物用于研究雜質清除的機制。表2顯示了用于實施例中的每個mab的原料特征。表2.mab原料的特征mab定量使用uv-可見光分光光度計(8453型g1103a；agilenttechnologies；santaclara,ca,u.s.a.)或nanodrop1000型nd-1000(thermofisherscientific；waltham,ma,u.s.a.)，通過280和320nm處的吸光值，確定抗體濃度。除抗體以外的其它物質(即，雜質)濃度太低，以至于對uv吸光值沒有可見的效果。根據需要，用恰當的非干擾稀釋劑稀釋樣品至0.1–1.0吸光值單位的范圍內。對樣品制備和uv測量實施2次，記錄平均值。mab的吸收系數是在1.42至1.645/mg·ml·cm的范圍內。cho宿主細胞蛋白質(chop)定量使用elisa定量被稱為chop的宿主細胞蛋白質的水平。將抗chop抗體固定在微滴度板的孔中。在孔中孵育含有chop的樣品的稀釋液、標準和對照，再與綴合了辣根過氧化物(hrp)的抗chop抗體孵育。用對苯二胺檢測hrp酶促活性，通過在微滴度板讀板器中讀取490nm的吸光值定量chop。基于夾心elisa的原理，過氧化物酶的濃度對應于chop濃度。elisa的測定范圍通常是5–320ng/ml，測定內變異<10％。以ng/ml為單位報告chop值。可選的，用chop值除以mab濃度，并用ppm(百萬分之一；例如，ngchop/mgmab)報告結果。chopelisa可用于定量樣品中的總chop水平，但沒有定量單個蛋白質的濃度。層析操作條件captoadhere和captommccaptoadhere樹脂是從gehealthcare(uppsala,sweden)獲得的。強陽離子交換樹脂(porosxs和poros50hs)是從appliedbiosystems(address)獲得的。所有的實驗室層析實驗都是使用來自gehealthcare(uppsala,sweden)的aktafplc層析系統執行的，該系統利用unicorn軟件。實驗室柱的直徑為0.66cm，高度為10–20cm。在裝載前，將柱子平衡至指明的ph和電導率操作條件。然后，將蛋白a混合物裝載到柱子上，再用所需的洗脫緩沖液洗脫下結合的蛋白質。收集在裝載，過載和洗脫階段過程中的流通液或洗出液級分，然后分析雜質。mab的裝載密度在每升樹脂100至1000g之間改變。層析混合物分析收集在裝載、過載和洗脫階段過程中的流通混合物級分(每者1倍柱體積)，分析mab濃度、chop濃度、聚集物、泄露的蛋白a、chodna和產率。生成累積圖作為洗脫混合級分的函數。使用等式1獲得累積產率。其中，對于級分i，ci是mab濃度(mg/ml)，vi是級分的體積(ml)，mp是裝載的蛋白質的質量(mg)。大小排阻層析通過高性能大小排阻層析測定法，確定單克隆抗體的大小異質性。在環境溫度在1200系列hplc儀器(agilenttechnologies)上運行由tosohbioscience(tokyo,japan)生產的tskg3000swxlsec柱(直徑＝7.8mm，高度＝300mm；零件號08541)，用于確定mab單體對于收集的樣品的相對水平。柱的操作流速為0.3ml/min，使用200mm磷酸鉀、250mm氯化鉀ph6.2移動相。每個樣品注射20μg抗體。使用280nm處的uv吸光值監控單體、lmw蛋白質和hmw蛋白質的分離。使用chemstation軟件(agilenttechnologies)手工分析單體、lmw蛋白質和hmw蛋白質的百分比。chodna定量使用實時pcr(taqmanpcr)定量產物樣品中的chodna。首先使用qiagen’svirusbiorobot試劑盒，提取樣品和對照中的dna。在96孔板中，用abi的序列檢測系統，用pcr引物和探針對提取的樣品、對照和標準dna進行taqman實時聚合酶鏈式反應(pcr)。用中國地鼠(cricetulusgriseus)基因組中的110堿基對的重復dna序列區段定義引物。用熒光報告染料在5’端和淬滅染料在3’端標記引物。當探針完整時，報告子的發射光譜被淬滅劑抑制。聚合酶的5’核酸酶活性水解探針，并釋放出報告子，導致熒光發射增加。序列檢測儀對擴增的產物的定量與dna擴增過程中連續測量到的熒光發射光的增加成比例。dna擴增超過閾值時的循環數(ct)被計算為標準曲線。生成范圍在1pg/ml-10,000pg/ml之間的標準曲線，用于定量樣品中的dna。泄露的蛋白a定量通過夾心蛋白質-aelisa，確定蛋白a混合物中的泄露的蛋白a的水平。將雞抗葡萄球菌蛋白a抗體固定在微滴度板的孔中。樣品處理程序包括樣品稀釋和然后使用微波輔助加熱解離蛋白a/igg復合物，作為在夾心elisa上運行樣品之前的預處理步驟。如果樣品中存在蛋白a，則將與包被的抗體結合。使用綴合了辣根過氧化物酶的抗蛋白a抗體檢測結合的蛋白a。用產生比色信號的2組分的tmb底物溶液定量辣根過氧化物酶的酶促活性。原料條件作用用于本研究實驗的原料是新鮮的，或者是從冷藏(2–8℃或–70℃)中移出的，并允許其平衡至室溫。之后，必要時，用滴定劑(1.5mtris堿或1m醋酸)或稀釋劑(純水、5m氯化鈉，或5m醋酸鈉)調節ph和/或電導率。使用millipak20(millipore)、acropaktm20(pallcorporation)或真空過濾器(thermofisherscientific,rochester,ny,u.s.a.)，對全部原料進行0.2μm過濾。高通量篩選使用tecanfreedomevo200機器人(tecanus,researchtrianglepark,nc)進行液相和樹脂處理。使用96孔過濾板(seahorse800μl聚丙烯0.45μm短滴濾板，e&kscientificek-2223)孵育樹脂和蛋白質與緩沖液。在用蛋白質溶液孵育樹脂之后，在1200xg離心濾板3分鐘，分離溶液和樹脂。對于每個階段，將300ml溶液與50ml樹脂接觸，獲得6:1的相體積比。將每個孔平衡至恰當的ph和醋酸鈉濃度。ph范圍是從5.00至7.5，以0.5ph單位的間隔(使用醋酸鹽緩沖ph5.00至5.5的條件，使用mes緩沖ph6.00至6.5的條件，使用mops緩沖7.00至7.5的條件)。在室溫實施所有的實驗。將濃縮至5g/l或97mg/ml的部分純化的蛋白a混合物，交換為15mmnaoac的緩沖液作為這些實驗的裝載液。實驗中用5g/l挑戰樹脂，以確定產物kp值。然而，對于實際的產物結合容量，用97g/l挑戰樹脂。濾液被捕獲在收集平板中，然后使用infinitem200讀板器分析。之后，使用2個階段的2mnacl緩沖液從樹脂上剝離結合的蛋白質，以結束質量平衡。病毒清除研究該研究的目的是評估captoadhere對2模型病毒(mmv和x-mulv)的病毒去除能力。用幼稚樹脂裝填0.66cm直徑的柱，至20cm床高度。mab原料摻入1％病毒，然后經過captoadhere樹脂處理。立即收集混合物，并測定裝載和洗脫樣品的病毒計數。制備使用完全培養基(1:10和1:100)的混合物的多次稀釋物，以確定在緩沖液組分和病毒之間的任何潛在干擾。實施例1.高通量篩選該實施例描述了用于確定層析材料的結合容量的高通量篩選方法。在分批結合條件下，對單克隆抗體mab3在captoadhere樹脂上實施高通量篩選。圖1展示了結合條件的高通量篩選的結果。在響應表面的附圖(圖1a和1b)中，紅色表示產物結合區(圖1a的區8和圖1b的區7)，綠色為產物(例如多肽)非結合區(表示為區1)。上清液中的實際的宿主細胞蛋白(hcp)含量(ng/mg)顯示為圖1c的等值線圖。圖1a顯示了mab3的產物kp作為ph和反離子濃度的函數。將樹脂裝載至5g/l，使用響應表面模型分析原始數據。然后，使用模型估算實驗空間中對于ph和反離子濃度的任意組合的kp。數據顯示，隨著ph增加和隨著電導率增加，logkp也增加。logkp的增加反映了產物與樹脂結合的增加。為了找出樹脂上的實際產物結合容量，以組合了不同的ph和反離子濃度的48種不同條件，用80g/l挑戰樹脂(圖1b)。還分析了來自相同實驗平板的上清液的hcp(ng/mg)，數據繪制為等值線的形式(圖1c)。使用含有數千ppm的chop的部分純化的蛋白a混合物作為高通量篩選實驗的裝載物。圖中的綠色區(區1)表示上清液中chop的較低量，紅色區(圖1b的區8和圖1c的區9)表示上清液中chop的較高量。可以根據chop和結合數據的等值線圖確定最優裝載和洗脫條件的設計空間。這些圖使得能夠設計流通的操作模式或結合和洗脫的操作模式。用于完整的流通層析的裝載條件一般是這樣的條件，其中產物結合最小化，例如多肽結合，而雜質(chop)結合最大化。圖1b和1c之間完全重疊的綠色區(區1)提示能夠進行f/t模式。然而，該圖中的綠色區(區1)是電導率很低～1ms的區。該條件需要將蛋白a混合物稀釋約4倍，可能導致規模上設備適合的潛在問題。紅色區(圖1b的區7和圖1c的區8)表示mab和chop的結合區。在兩幅圖中都存在一些重疊的紅色區域。然而，圖1b顯示，在可操作的ph和反離子濃度條件下，55g/l的最大結合容量是可能的。對于～3.5g/l細胞培養物滴度的高滴度過程，需要在1000l柱上1個循環回收所有的產物(如多肽)，而在較小的柱子上則必須進行多個循環。在oec模式中，可以基于雜質(例如，chop)在柱上的行為選擇裝載條件。不太需要關注與柱子結合的mab的量，因為可以通過洗脫階段回收結合的mab。因此，有整個實驗空間以設計裝載條件，從而在不受樹脂的產物結合容量的限制下，獲得最大的雜質清除。盡管結合和洗脫模式允許55g/l裝載密度，oec允許約10倍高的裝載容量，從而允許用較小的柱子執行，這反過來可以降低每克產物的樹脂成本，提供良好的設備適應性。實施例2.優化的oec模式將hts數據用于參數確定以在oec模式中操作。基于裝載密度要求、設備適應性和雜質清除，選擇mab3的裝載條件為ph6.5和5.5ms/cm。圖2顯示的優化的層析運行的裝載密度是180g/l。在裝載階段，約50g/l多肽產物與樹脂結合。從約0.5od開始收集產物混合物，產物在樹脂上過載多至180g/l。在完成裝載階段后，使用具有1ms/cm的低電導率緩沖液(洗脫緩沖液：20mmmesph6.5)的洗脫階段，洗脫結合的蛋白質，導致相比流通層析減少10-15％混合物體積。圖3顯示了該層析運行的產率和雜質清除率。實施例3.裝載優化進行該研究比較hts數據和oec操作模式中的實際柱性能數據。在3種不同的ph對柱進行裝載。基于初始chop清除和產率數據，選擇ph6.5為最佳條件。混合物中的chop濃度范圍在900至50至400ppm，作為裝載ph的函數。根據該研究，確定ph6.5是裝載組合物的最佳條件。此外，雖然產率沒有優化，但ph6.5仍提供了最大的產率(圖3，表3)。表3.oec模式的裝載條件優化實施例4.洗脫優化進行該研究優化oec的洗脫條件。為了回收在裝載階段期間結合的產物(mab3,～50g/l)，在結束裝載階段后，將若干倍柱體積的洗滌緩沖液(50mmmes，30mm醋酸鈉，ph6.5，～5.5ms/cm)流過柱子。觀察到大量拖尾，導致裝載階段結束時的混合物體積增加。使用與裝載緩沖液具有相似ph和電導率的洗滌緩沖液時，混合物體積增加約45％。該混合物體積的增加可能導致設備適應性的問題(圖4)。洗脫優化研究的目的是獲得最大產率、最小chop和最大混合物體積減少。洗脫階段用于從柱上洗脫50g/l的結合產物。圖5顯示了層析圖的洗脫階段。較低電導率緩沖液在2倍柱體積內從柱上洗脫下產物，導致更高的產率和較低的混合物體積(表4)。另一方面，較高電導率的洗脫緩沖液導致大于8倍柱體積的拖尾。如表4所示，在所有嘗試的洗脫緩沖液中，混合物chop都小于20ppm。因此，選擇20mmmes作為洗脫緩沖液，以增加產率和最小化拖尾。表4.oec的洗脫優化實施例5.oec的雜質分析分析來自oec的級分的雜質。圖6a顯示了在裝載階段期間和洗脫階段期間收集的級分中的mab濃度和chop水平。在裝載階段期間，chop保持在20-25ppm之間，而在僅洗脫結合的mab的洗脫階段期間，級分的chop水平減少。累積分析證實chop和其他雜質在整個裝載和洗脫階段都仍然是相當一致的(圖6b)。該運行的裝載密度是180g/l。還研究了相同裝載密度的病毒清除，使用x-mulv和mmv作為模式病毒(表5)。對于該實驗，裝載ph是6.5，裝載電導率是5.5ms/cm。洗脫條件是20mmmesph6.5和電導率～1ms/cm。表5.oec模式層析的病毒清除實施例6.最大雜質結合容量確定為了找到通過oec模式用mab3裝載的樹脂的最大雜質結合容量，用1000g/l蛋白a混合物挑戰captoadhere樹脂。裝載緩沖液是ph6.5，～5.5ms/cm；洗脫緩沖液是20mmmesph6.5，～1ms/cm。收集每50g/l的混合物樣品，分析chop和蛋白質濃度(圖7)。對于高達800g/l的裝載密度，chop沒有貫穿，且洗出液中的chop小于20ng/mg。實施例7.以試驗性規模執行在大小從1.6l至10.8l的試驗性規模柱上執行oec操作模式。柱直徑范圍從10cm至25cm，床高度范圍是20-22cm(表6)。在ph6.5，～5.5ms/cm裝載樣品，并用20mmmesph6.5，～1ms/cm洗脫。試驗性規模運行中的產率顯示在圖8中。試驗性規模運行中的裝載密度覆蓋了從70至180g/l的裝載密度范圍。在全部裝載密度中，實現了94％的平均產率。在測試的裝載密度范圍內，對產率沒有影響。在所有的試驗性規模運行中，oec模式混合物chop小于25ppm，然后在下游清除至在最終的多肽產物(ufdf混合物)中<2ppmchop(表7)。平均而言，在所有的試驗性規模運行中，hmw蛋白質降低約1.1％(表8)，在所有的試驗性規模運行中，lmw蛋白質降低約0.19％(表9)。表6.用于試驗性規模運行的captoadhere柱大小試驗性規模運行bh直徑(cm)cv(l)第1次運行21101.6第2次運行21101.6第3次運行20143.1第4次運行19142.9第5次運行19142.9第6次運行222510.8第7次運行222510.8第8次運行21.5101.7第9次運行20143.1第10次運行222510.8表7.試驗性規模chop數據*在ph6.5的深度過濾后的chophccf是收獲的細胞培養液表8.在12次試驗性規模運行中的平均％hmw蛋白質降低平均％hmw蛋白質降低0.95±0.49表9.在12次試驗性規模中的平均％lmw蛋白質降低平均％lmw蛋白質降低0.19±0.08在oec后，混合物中的chodna和泄露的蛋白a低于可檢測。實施例8.以生產規模執行在大小為157l的生產規模柱(100cm直徑×20cm高度)上執行oec操作模式。在生產規模下，將柱裝載至～96g/l。生產規模的兩次運行中的％產率都≥95％。在所有的生產規模運行中，oec模式混合物chop小于17ppm(表10)，其在下游清除至小于可檢測的chop水平。平均而言，在兩此生產規模運行中，hmw降低約1.1％，lmw降低0.1％而酸性物質降低1.65％。表10.生產規模的chop(ppm)數據步驟第1次運行第2次運行hcce3050032500蛋白a混合物57496157captoadhere樹脂(oec)1617在oec后，混合物中的chodna和泄露的蛋白a低于可檢測。實施例9.oec對其他mab的適用性使用蛋白a混合物作為這些運行的裝載物。選擇裝載和洗脫條件使得能夠進行oec模式。下表顯示了裝載密度、％產率、與樹脂結合的mab(g/l)、裝載物和混合物中的雜質(表11、12、13和14)。表11.oec對其他mab的應用性：chop表12.oec對其他mab的應用性：％hmw蛋白質表13.oec對其他mab的應用性：％泄露的蛋白a*小于可檢測的表14.oec對其他mab的應用性：chodna實施例10.基于kp值的aex層析操作模式在完整的流通(f/t)層析中，kp<0.1且沒有蛋白質與樹脂結合。在弱分配層析(wpc)中，kp為0.1至20，且在產物和層析基質之間存在弱分配。在結合和洗脫模式下，產物與樹脂緊密結合，kp>100，但裝載密度限于產物結合容量。然而，在過載和洗脫型層析(mab3)中，裝載條件是使產物和雜質kp>100，并且雖然產物在達到其結合容量后仍然流通，但雜質仍保持與樹脂結合，并且沒有貫穿直到雜質達到其結合容量，所述雜質的結合容量高于產物結合容量。洗脫條件是使多肽產物kp<2。回收結合的產物，但大部分雜質仍然保持結合(雜質kp>100)。依此，該模式能夠提供良好的雜質清除率，同時提供非常高的產率(例如，～95％)(表15)。表15.mab3作為captoadhere樹脂上的模式抗體在弱分配條件(kp＝2.4)和過載和洗脫條件(kp>100)下的柱運行的層析圖展示了增加mabkp對層析圖的產物貫穿區的影響(圖9)。wpc裝載條件：ph5.5，4.4ms/cm；wpc洗滌條件：20mm醋酸鹽ph5，4.4ms/cm。oec裝載條件：ph6.5，5.5ms/cm；oec洗脫條件：20mmmesph6.5,～1ms/cm。表16.在典型的流通方法條件下，分析用于結合aex樹脂的mab的aex精細純化步驟模式抗體：mab3*假定在3.5g/l滴度收獲12,500l**ca樹脂為$3500/l實施例11.不同樹脂的oec應用性根據分子的pi，可以向下列多個模式樹脂(captoadhere、qma、mephypercel、heahypercel、ppahypercel、captommc)應用oec。結合在captoadhere樹脂上的多肽產物性質上是更疏水的，并可以通過降低洗脫緩沖液的電導率從柱上洗脫結合的產物(圖5)。然而，產物在樹脂上結合的模式和產物從樹脂上洗脫的模式不限于疏水性相互作用，因此oec操作模式還可以廣泛的用于其他的層析材料。表17展示了oec可用于其他cex樹脂和iex樹脂。除非另外指出，否則洗脫緩沖液是20mmmes。oec的潛力不限于上述樹脂，且正在進行評估。圖10顯示了mab3在qma樹脂上的貫穿分析。圖11中顯示了mab4在captoadhere樹脂上的貫穿分析。圖12顯示了mab4在captommc樹脂上的貫穿分析。圖13顯示了mab3在captoadhere樹脂上的貫穿分析。表17.不同樹脂的oec應用性**porosxsmab3裝載條件：ph5.5，<6ms/cm；洗脫條件：緩沖液a-50mm醋酸鹽ph5.5，～3ms/cm，緩沖液b-350mm醋酸鹽ph5.5，～24ms/cm，梯度：在10cv中20-85％，混合：1-8cv。實施例12.在oec上的梯度洗脫洗脫優化研究的另一個目標是評估梯度洗脫條件對captoadhere樹脂上oec模式的作用。研發了用于洗脫結合的產物的洗脫階段(表18)。在梯度洗脫運行中，可以基于要求改變移動相的離子強度、ph、組成和濃度。表18顯示了運行的條件：裝載(ph和電導率)和洗脫(ph和電導率梯度)條件。表中顯示的所有數據都是從用150g/lmab3裝載密度裝載的層析運行中獲得的。進行這些運行作為證實可以在oec層析模式下實施梯度洗脫以及可以優化梯度斜率(鹽濃度(mm)/柱體積)這一概念的證據。可見相比裝載物，％hmws平均降低38％(表18)。在5.5ms/cm電導率運行中，chop降低至<20ppm，而在10ms/cm的更高電導率運行中，獲得了～150ppm的混合物chop(表19)。表18.oec上梯度洗脫運行：％hmw數據表19.oec上梯度洗脫運行：chop數據本發明涉及如下實施方案：1、用于從包含多肽和一種或多種污染物的組合物中純化多肽的方法，所述方法包括a)以超過層析材料對于多肽的動態結合容量的量將組合物裝載到層析材料上，b)在一種或多種污染物仍然與層析材料結合的條件下，從層析材料上洗脫多肽，和c)混合包含步驟a)和b)的層析流出液中的多肽的級分。2、實施方案1的方法，其中多肽是抗體或免疫粘附素。3、實施方案2的方法，其中多肽是免疫粘附素。4、實施方案2的方法，其中多肽是抗體。5、實施方案4的方法，其中抗體是單克隆抗體。6、實施方案5的方法，其中單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體，或人抗體。7、實施方案5的方法，其中單克隆抗體是igg單克隆抗體。8、實施方案4的方法，其中抗體是抗原結合片段。9、實施方案8的方法，其中抗原結合片段是fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、scfv、di-scfv、bi-scfv、串聯(di,tri)-scfv、fv、sdab、三功能抗體、bite、雙抗體或三價抗體。10、實施方案1的方法，其中多肽是酶、激素、融合蛋白、含有fc的蛋白質、免疫綴合物、細胞因子或白介素。11、實施方案1-10中任一項的方法，其中至少一種污染物是中華倉鼠卵巢蛋白(chop)、宿主細胞蛋白(hcp)、泄露的蛋白a、羧肽酶b、核酸、dna、產物變體、聚集的蛋白質、細胞培養基組分、慶大霉素、多肽片段、內毒素和病毒性污染物中的任何一種或多種。12、實施方案1-11中任一項的方法，其中層析材料是混合模式材料、陰離子交換材料、疏水性相互作用材料，或親和材料。13、實施方案1-12中任一項的方法，其中裝載密度在約50g/l至約2000g/l之間。14、實施方案13的方法，其中裝載密度在約200g/l至約1000g/l之間。15、實施方案1-14中任一項的方法，其中以約層析材料對于一種或多種污染物的動態結合容量將組合物裝載到層析材料上。16、實施方案1-15中任一項的方法，其中以層析材料對于多肽的動態結合容量的20倍將組合物裝載到層析材料上。17、實施方案1-16中任一項的方法，其中層析材料對多肽的分配系數大于30。18、實施方案17的方法，其中層析材料對多肽的分配系數大于100。19、實施方案1-18中任一項的方法，其中方法還包括使用裝載緩沖液和洗脫緩沖液。20、實施方案19的方法，其中洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的電導率的電導率。21、實施方案20的方法，其中裝載緩沖液具有約4.0ms至約7.0ms的電導率。22、實施方案20的方法，其中洗脫緩沖液具有約0.0ms至約7.0ms的電導率。23、實施方案19的方法，其中洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的電導率的電導率。24、實施方案23的方法，其中裝載緩沖液具有約4.0ms至約10.0ms的電導率。25、實施方案23的方法，其中裝載緩沖液具有約4.0ms至約7.0ms的電導率。26、實施方案23的方法，其中洗脫緩沖液具有約5.5ms至約17.0ms的電導率。27、實施方案19的方法，其中洗脫緩沖液的電導率在約10倍柱體積(cv)中以從約5.5ms至約1.0ms的梯度減少。28、實施方案19的方法，其中洗脫緩沖液的電導率在約15cv中以從約5.5ms至約1.0ms的梯度減少。29、實施方案19的方法，其中洗脫緩沖液的電導率在約5cv中以從約10.0ms至約1.0ms的梯度減少。30、實施方案19的方法，其中洗脫緩沖液的電導率在約10倍cv中以從約10.9ms至約1.0ms的梯度減少。31、實施方案19的方法，其中洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的ph的ph。32、實施方案31的方法，其中裝載緩沖液具有約4至約9的ph。33、實施方案31的方法，其中洗脫緩沖液具有約4至約9的ph。34、實施方案19的方法，其中洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的ph的ph。35、實施方案34的方法，其中裝載緩沖液具有約4至約9的ph。36、實施方案34的方法，其中洗脫緩沖液具有約4至約9的ph。37、實施方案1-36中任一項的方法，其中組合物是來自親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析或疏水性相互作用層析的洗出液。38、實施方案37的方法，其中親和層析是蛋白a層析。39、實施方案1-38中任一項的方法，其中進一步純化多肽。40、實施方案39的方法，其中通過病毒過濾進一步純化多肽。41、實施方案39的方法，其中通過親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析和疏水性相互作用層析中的一種或多種進一步純化多肽。42、實施方案1-41中任一項的方法，其中進一步濃縮多肽。43、實施方案42的方法，其中通過超濾、滲濾或超濾和滲濾的組合濃縮多肽。44、實施方案39-43中任一項的方法，還包括組合多肽與可藥用的運載體。當前第1頁12