本發明公開了一種親水性多肽純化的方法，屬于蛋白質與多肽純化領域。
背景技術：
所謂多肽，它是分子結構介于氨基酸和蛋白質之間的一種化合物。它由氨基酸構成，但與蛋白質又有所不同，屬于它們之間的中間物質。氨基酸能夠彼此以肽鍵相互連接的化合物稱作肽。一種肽含有的氨基酸少于10個就被稱為寡肽，超過的就稱為多肽，氨基酸為50多個以上的多肽稱為蛋白質。多肽生物活性高，它能調節各種生理活動和生化反應。到現在，人們已發現和分離出100多種存在于人體的肽，對于多肽的研究和利用，在世界范圍內已經出現了一個空前的繁榮景象。
近幾十年來，對于多肽的研究取得了突飛猛進的發展，現在的科學家已經對多肽有了清醒的認識。多肽對人體具有非常重要的不可替代的調節作用，這種作用幾乎涉及到人體的所有生理活動。
在進行普通藥物動力學研究中，hplc是技術成熟，應用廣泛的分析手段。在蛋白多肽藥物的實驗研究或產業化中，hplc都是主要的分離純化工具。但鑒于蛋白多肽藥物結構的特殊性，特別一些小分子多肽。由于序列短而且很多親水性氨基酸，所以在常規hplc上幾乎沒有保留，對后期的分離純化造成一定的難度。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種親水性多肽純化的方法，主要解決現在hplc用于小分子多肽分離時存在在常規hplc上幾乎沒有保留，對后期的分離純化造成一定的難度的技術問題。本發明的思路是：采用凝膠色譜和氨基柱反相色譜兩步分離純化，從而實現最終產品的分離得到高純度的肽。
為實現上述目的，本發明的技術方案如下：一種親水性多肽純化的方法，包括以下步驟：
第一次凝膠色譜純化步驟：
（1）將多肽樣品加純入水中超聲攪拌溶解直至澄清，用微孔濾膜過濾；
（2）將多肽樣品加入到預裝好的凝膠柱中，上樣量為1-5倍柱床體積；
（3）加入無鹽水作為洗脫液，設置合適的流速洗脫分離樣品；
（4）樣品純度大于90%的收集在一起放置；
第二次氨基柱純化步驟：
（1）將上述收集的樣品上樣至反相色譜系統，洗脫流動相a相為磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，用磷酸調ph至4.2±0.02），流動相b相為乙腈；
（2）設置洗脫梯度、流速及檢測波長；
（3）收集目標餾分；
（4）將收集餾分凍干稱重。
所述微孔濾膜為0.45μm水系微孔濾膜。所述的凝膠為交聯葡聚糖，比如sephadexg的g-10、g-15等。所用氨基柱為luna氨基柱。所述多肽序列中親水氨基酸占比超過50%。所述多肽分子量不大于600da。
本發明的有益效果是：通過采用凝膠色譜和氨基柱反相色譜兩步分離純化，有效的解決了親水性多肽在反相幾乎不保留無法分離。同時有效的提高了工作效率，減少有機溶劑用量，節省成本。除了采用凝膠色譜和氨基柱反相色譜兩步分離純化這個思路，在采用具體參數設定時，是否有哪些參數設定是本領域技術人員不容易想到的，并帶來特定的技術效果。有益效果的描述多多益善，并最好用數據說話。
具體實施方式
實施例1
樣品名：(β-asp)-asp結構式：
第一次凝膠色譜純化：
（1）將樣品(β-asp)-asp加純入水中超聲攪拌溶解直至澄清，用0.45μm水系微孔濾膜過濾；
（2）將樣品加入到預裝好的凝膠柱g-10中，上樣量為2倍柱床體積；
（3）加入無鹽水作為洗脫液，設置流速為4ml/min洗脫分離樣品；
（4）樣品純度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱純化：
（1）將上述收集的樣品上樣至反相色譜系統，洗脫流動相a相為磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，用磷酸調ph至4.2±0.02），流動相b相為乙腈；
（2）設置洗脫梯度b為40-60%，30min、流速為30ml/min、檢測波長為215nm；
（3）收集目標餾分；
（4）將收集餾分凍干稱重，計算回收率為38.21%。
實施例2
樣品名：orn-asp結構式：
第一次凝膠色譜純化：
（1）將樣品orn-asp加純入水中超聲攪拌溶解直至澄清，用0.45μm水系微孔濾膜過濾；
（2）將樣品加入到預裝好的凝膠柱g-15中，上樣量為1.5倍柱床體積；
（3）加入無鹽水作為洗脫液，設置流速為4ml/min洗脫分離樣品；
（4）樣品純度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱純化：
（1）將上述收集的樣品上樣至反相色譜系統，洗脫流動相a相為磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，用磷酸調ph至4.2±0.02），流動相b相為乙腈；
（2）設置洗脫梯度b為40-60%，30min、流速為30ml/min、檢測波長為215nm；
（3）收集目標餾分；
（4）將收集餾分凍干稱重，計算回收率為37.56%。
實施例3
樣品名：β-asp-orn結構式：
第一次凝膠色譜純化：
（1）將樣品β-asp-orn加純入水中超聲攪拌溶解直至澄清，用0.45μm水系微孔濾膜過濾；
（2）將樣品加入到預裝好的凝膠柱g-10中，上樣量為2.5倍柱床體積；
（3）加入無鹽水作為洗脫液，設置流速為4ml/min洗脫分離樣品；
（4）樣品純度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱純化：
（1）將上述收集的樣品上樣至反相色譜系統，洗脫流動相a相為磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，用磷酸調ph至4.2±0.02），流動相b相為乙腈；
（2）設置洗脫梯度b為40-60%，30min、流速為30ml/min、檢測波長為215nm；
（3）收集目標餾分；
（4）將收集餾分凍干稱重，計算回收率為39.27%。
實施例4
樣品名：β-asp-δ-orn結構式：
第一次凝膠色譜純化：
（1）將樣品β-asp-δ-orn加純入水中超聲攪拌溶解直至澄清，用0.45μm水系微孔濾膜過濾；
（2）將樣品加入到預裝好的凝膠柱g-15中，上樣量為3倍柱床體積；
（3）加入無鹽水作為洗脫液，設置流速為4ml/min洗脫分離樣品；
（4）樣品純度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱純化：
（1）將上述收集的樣品上樣至反相色譜系統，洗脫流動相a相為磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，用磷酸調ph至4.2±0.02），流動相b相為乙腈；
（2）設置洗脫梯度b為40-60%，30min、流速為30ml/min、檢測波長為215nm；
（3）收集目標餾分；
（4）將收集餾分凍干稱重，計算回收率為38.68%。
實施例5
樣品名：orn-δ-orn結構式：
第一次凝膠色譜純化：
（1）將樣品orn-δ-orn加純入水中超聲攪拌溶解直至澄清，用0.45μm水系微孔濾膜過濾；
（2）將樣品加入到預裝好的凝膠柱g-15中，上樣量為5倍柱床體積；
（3）加入無鹽水作為洗脫液，設置流速為4ml/min洗脫分離樣品；
（4）樣品純度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱純化：
（1）將上述收集的樣品上樣至反相色譜系統，洗脫流動相a相為磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，用磷酸調ph至4.2±0.02），流動相b相為乙腈；
（2）設置洗脫梯度b為40-60%，30min、流速為30ml/min、檢測波長為215nm；
（3）收集目標餾分；
（4）將收集餾分凍干稱重，計算回收率為38.37%。