一種MTGase粗酶的純化方法與流程

本發明涉及一種酶的純化方法，尤其是一種mtgase粗酶的純化方法。

背景技術：

谷氨酰胺轉胺酶（transglutaminase，簡稱tgase)是一種催化酰胺轉移反應的轉移酶，能催化蛋白質分子內與分子間發生交聯、蛋白質與氨基酸之間的連接、蛋白質分子內谷氨酰胺基的水解反應，從而直接改變蛋白質本身以及蛋白質所附著的細胞、組織等的結構與功能性質的特性，提高蛋白質的營養價值，生產出滿足人們需求的新型蛋白食品。微生物來源的tgase（mtgase）酶活性完全不依賴于鈣離子的存在，分子量小，更容易常溫保存，而功能上與動物來源的tgase相似，這些性質使得微生物谷氨酰胺轉胺酶在工業生產和應用的前景十分巨大。目前《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》僅允許茂原鏈輪絲菌來源的mtgase作為食品酶制劑使用，mtgase作為蛋白質功能改善劑廣泛運用在水產品、肉制品、乳制品、豆制品以及烘焙產品中，可改善蛋白質的凝膠特性、乳化能力、持水力、起泡性以及穩定性。

目前mtgase純化方法一般采用離子交換層析或凝膠柱層析的方法，本領域技術人員利用雙水相萃取技術進行酶的純化時，一般選擇peg4000、peg2000、peg1000等分子量較小的peg，萃取時，待純化的酶都會分配在peg富集的上相，為了使得peg與待純化的酶分開，需進行反萃取，將待純化的酶再萃取進鹽相（下相），這樣使得生產工藝復雜，成本高，存在工藝繁瑣、樣品回收率低、分離材料和設備昂貴、樣品處理量小、單一方法分離純度低等問題，難以滿足生產和應用中的需要。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種mtgase粗酶的純化方法，其純化簡便，純化分離獲得的mtgase純度較高，回收率高。

為達到上述目的，本發明的技術方案是：一種mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase粗酶粉末用水溶解，配制成1-2wt%濃度的mtgase粗酶液；

配制peg/(nh4)2so4雙水相溶液形成上層的peg相和下層的鹽相；

將mtgase粗酶液與peg/(nh4)2so4雙水相溶液混合均勻，20-40℃靜置1-2h，mtgase進入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相進行納濾膜處理，收集納濾膜處理膜內液獲得純化的mtgase。

優選所述peg/(nh4)2so4雙水相溶液的組成為：

peg15-40wt%

(nh4)2so45-20wt％

水50-80wt％。

優選所述peg/(nh4)2so4雙水相溶液的組成為：

peg25-30wt%

(nh4)2so47-13wt％

水60-68wt％。

優選所述peg為peg-6000、peg-8000或peg-10000中的任一一種和硫酸銨配合使用，可以達到比較合適的分配系數，使得mtgase的純化效果較好。

優選將所述mtgase粗酶液與peg/(nh4)2so4雙水相溶液混合均勻時，兩者的混合的質量比例為1：2-1：5,利于mtgase分散在peg/(nh4)2so4雙水相溶液中，使得mtgase的純化效果較好。

優選所述納濾膜所用的材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，納濾膜具有良好的截留效果，利于mtgase的提純和濃縮。

優選將收集的鹽相進行納濾膜處理過程中，溫度控制在20-40℃，進壓2～6bar，出壓1～5bar，利于提高mtgase的提純和濃縮的速度和效率。

本發明配制合適比例的peg和(nh4)2so4在水中能形成兩層互不相溶的均相水溶液，運用mtgase和雜質在雙水相中的分配系數不同的性質，使得mtgase和雜質分配在不同的相中。經過發明人的研究發現，當所用的peg的分子量大于等于6000，小于等于10000時，親水性的mtgase酶不再向富含peg相（上相）中聚集，而轉向鹽相（下相），并且此時的mtgase酶在下相的分配系數也足夠滿足酶的純化，酶的純化效果可以達到電泳純，回收率達到81.45-92.23%，純化后的mtgase的酶活力達到5.24-10.87u/ml。再對鹽相利用納濾膜進行過濾處理，在去除鹽相中的硫酸銨和小分子雜質的同時，對mtgase溶液進行濃縮，獲得較高純度的mtgase，利于mtgase的應用。

與本領域現有技術相比，本發明利用雙水相萃取技術進行酶的純化時，通過一次萃取就可實現酶純化，工藝更簡單，酶純度高，酶活回收率和酶活力更高。省略反萃取步驟，也可實現酶的純化，極大的簡化了利用現有雙水相萃取技術進行酶純化的工藝。

附圖說明

圖1是本發明中實施例1中純化的mtgase的sds-page電泳圖；

圖2是本發明中實施例2中純化的mtgase的sds-page電泳圖。

具體實施方式

下面結合附圖和具體的實施方式對本發明作進一步詳細說明。

下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應當理解，本發明的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。

mtgase的酶活力測定方法：取50μl待測溶液于試管中，加入500μl底物溶液，并立即混勻，37±1℃條件下準確反應10min，加入500μl顯色溶液終止反應，反應終止后，將反應混合液3000rpm離心10min，取上清，以水作對照，于525nm波長處測定其吸收值，為待測酶液吸收值。以l-谷氨酸-γ-單異羥肟酸為標準品作標準曲線。酶活力單位定義：該酶在37℃時每分鐘催化底物生成1μmol的l-谷氨酸-γ-單異羥肟酸所需要的酶量。

實施例1

mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase的粗酶粉末用水溶解，配制成2wt%的mtgase粗酶液；

配制peg-6000/(nh4)2so4雙水相溶液，組成為：

peg-600027wt%

(nh4)2so413wt％

水60wt％；

peg-6000/(nh4)2so4雙水相溶液形成上層的peg-6000相和下層的鹽相；

將mtgase粗酶液與peg-6000/(nh4)2so4雙水相溶液按照1：5的質量比混合均勻，30℃靜置1h，mtgase進入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相泵入納濾膜設備中處理，所用納濾膜材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，溫度控制在35℃，進壓4bar，出壓3bar。收集納濾膜處理膜內液即為純化的mtgase。純化的mtgase的sds-page電泳圖見圖1所示。從圖1中可以看出，mtgase粗酶液的蛋白條帶較多，說明mtgase粗酶中含有大量雜蛋白，其中最粗的條帶為mtgase。純化的mtgase為單一條帶，對應分子量約為37kda，與茂原鏈霉菌發酵的谷氨酰胺轉胺酶的分子量一致。說明經過本實施例的處理，能夠去除mtgase粗酶中的大量雜蛋白，得到純化的mtgase。mtgase的回收率為90.74%，納濾膜處理膜內液中mtgase的酶活力為5.24u/ml。

實施例2

mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase的粗酶粉末用水溶解，配制成2wt%的mtgase粗酶液；

配制peg-8000/(nh4)2so4雙水相溶液，組成為：

peg-1000030wt%

(nh4)2so412wt％

水58wt％；

peg-8000/(nh4)2so4雙水相溶液形成上層的peg-8000相和下層的鹽相；

將mtgase粗酶液與peg-8000/(nh4)2so4雙水相溶液按照1：5的質量比混合均勻，20℃靜置1h，mtgase進入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相泵入納濾膜設備中處理，所用納濾膜材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，溫度控制在30℃，進壓3bar，出壓2bar。收集納濾膜處理膜內液即為純化的mtgase。純化的mtgase的sds-page電泳圖見圖2所示。從圖2中可以看出，mtgase粗酶液的蛋白條帶較多，說明mtgase粗酶中含有大量雜蛋白，其中最粗的條帶為mtgase。純化的mtgase為單一條帶，對應分子量約為37kda，與茂原鏈霉菌發酵的谷氨酰胺轉胺酶的分子量一致。說明經過本實施例的處理，能夠去除mtgase粗酶中的大量雜蛋白，得到純化的mtgase。mtgase的回收率為83.99%，納濾膜處理膜內液中mtgase的酶活力為10.87u/ml。

實施例3

mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase的粗酶粉末用水溶解，配制成1.8wt%的mtgase粗酶液；

配制peg-10000/(nh4)2so4雙水相溶液，組成為：

peg-1000025wt%

(nh4)2so420wt％

水55wt％；

peg-10000/(nh4)2so4雙水相溶液形成上層的peg-10000相和下層的鹽相；

將mtgase粗酶液與peg/(nh4)2so4雙水相溶液按照1：3的質量比混合均勻，40℃靜置1h，mtgase進入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相泵入納濾膜設備中處理，所用納濾膜材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，溫度控制在25℃，進壓4bar，出壓3bar。收集納濾膜處理膜內液即為純化的mtgase。mtgase的回收率為84.36%，納濾膜處理膜內液中mtgase的酶活力為7.56u/ml。

實施例4

mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase的粗酶粉末用水溶解，配制成1.5wt%的mtgase粗酶液；

配制peg-6000/(nh4)2so4雙水相溶液，組成為：

peg-600040wt%

(nh4)2so410wt％

水50wt％；

peg-6000/(nh4)2so4雙水相溶液形成上層的peg-6000相和下層的鹽相；

將mtgase粗酶液與peg-6000/(nh4)2so4雙水相溶液按照1：4的質量比混合均勻，30℃靜置1h，mtgase進入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相泵入納濾膜設備中處理，所用納濾膜材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，溫度控制在30℃，進壓5bar，出壓4bar。收集納濾膜處理膜內液即為純化的mtgase。mtgase的回收率為89.12%，納濾膜處理膜內液中mtgase的酶活力為6.76u/ml。

實施例5

mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase的粗酶粉末用水溶解，配制成1.2wt%的mtgase粗酶液；

配制peg-8000/(nh4)2so4雙水相溶液，組成為：

peg-800020wt%

(nh4)2so47wt％

水73wt％；

將mtgase粗酶液與peg-8000/(nh4)2so4雙水相溶液按照1：3的質量比混合均勻，40℃靜置1h，mtgase進入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相泵入納濾膜設備中處理，所用納濾膜材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，溫度控制在40℃，進壓6bar，出壓5bar。收集納濾膜處理膜內液即為純化的mtgase。mtgase的回收率為92.23%，納濾膜處理膜內液中mtgase的酶活力為8.37u/ml。

實施例6

mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase的粗酶粉末用水溶解，配制成1wt%的mtgase粗酶液；

配制peg-10000/(nh4)2so4雙水相溶液，組成為：

peg-1000015wt%

(nh4)2so45wt％

水80wt％；

peg-10000/(nh4)2so4雙水相溶液形成上層的peg-10000相和下層的鹽相；

將mtgase粗酶液與peg-10000/(nh4)2so4雙水相溶液按照1：2的質量比混合均勻，20℃靜置1h，mtgase進入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相泵入納濾膜設備中處理，所用納濾膜材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，溫度控制在20℃，進壓2bar，出壓1bar。收集納濾膜處理膜內液即為純化的mtgase。mtgase的回收率為81.45%，納濾膜處理膜內液中mtgase的酶活力為5.88u/ml。

盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下在本發明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。