可誘導的CRISPRon或CRISPRi小鼠胚胎干細胞及其應用的制作方法

本發明涉及基因表達調控領域，特別涉及一種可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞及其應用。
背景技術：
：rna干擾(rnai)或者基因過表達(overexpression，oe)是基因功能研究的常用方法。然而，rnai是一種轉錄后調控，并且容易出現脫靶的現象；過表達(oe)往往利用克隆載體啟動子促進外源基因的表達，在不同細胞類型中啟動子的活性不穩定、不可控。規律成簇的間隔短回文重復crispr與內切酶cas9的組合，可以在引導rna(sgrna)的指引下，靶標并切割入侵者的dna遺傳物質。2012年研究者們利用這一特點，將crispr系統制成了強大的基因組編輯工具(jinek,m.等人，2012；cong,l.等人，2013)。但是傳統的crispr/cas9方法對基因的編輯可能造成在細胞基因組中預期之外的插入或刪除等。進一步的研究發現，cas9兩個氨基酸點突變會導致酶活性喪失，稱之為dcas9。如果dcas9連接轉錄輔因子，在引導rna(sgrna)的指引下，無需切割dna就可以有效地進行dna序列特異性的調控。比如，如果dcas9串聯轉錄抑制輔因子如krab，則可以實現轉錄抑制(crispri)；如果dcas9串聯轉錄激活輔因子如vp64，則可以實現轉錄激活(crispron或者crispractivation)(dominguez,a.a.等人，2016)。利用這一方法，可以動態操縱絕大多數基因的轉錄。但該方法借助于轉座酶系統的隨機插入，可能會引起意外的基因組變化。技術實現要素：為解決上述問題，本發明實施例公開了一種可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞。技術方案如下：一種可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞，其中小鼠胚胎干細胞是a2lox.cre細胞，其可逆地表達dcas9-vpr融合蛋白或dcas9-krab融合蛋白。在本發明的上下文中術語“a2lox.cre細胞”是指，在小鼠胚胎干細胞系e14的rosa26位點整合表達rtta，所獲得的陽性克隆按編號命名為a17。在a17的小鼠胚胎干細胞中的組成性表達的次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hprt)基因的5'端整合插入tre-loxp-cre-loxp-δneo序列，所得的陽性克隆命名a2lox.cre(iacovino,m.等人，2011)。tre即四環素應答元件，rtta與之結合后抑制下游基因轉錄，加入強力霉素(doxycline，簡稱dox)或者四環素的情況下則使rtta改變構象而激活下游基因轉錄。cre重組酶是細菌噬菌體p1的i型拓撲異構酶，被誘導表達以后可以催化loxp位點間的dna進行位點特異性重組。δneo是缺少啟動子和起始密碼子的新霉素neomycin編碼基因(neo)，因此neo無法表達，此時該細胞不具備g418抗性。在本發明的上下文中術語“dcas9-vpr”是指，三個已知的轉錄激活蛋白vp64-p65-rta(vpr)串聯后與無活性的dcas9的融合蛋白。通常斜體“dcas9-vpr”表示編碼這三個轉錄激活蛋白的與無活性dcas9的融合蛋白的核酸。在本發明的上下文中術語“dcas9-krab”是指，已知的轉錄抑制蛋白krab與無活性的dcas9的融合蛋白。通常斜體“dcas9-krab”表示編碼轉錄抑制蛋白krab的與無活性dcas9的融合蛋白的核酸。在本發明的一個具體實施方案中，a2lox.cre細胞的基因組整合了dcas9-vpr基因或dcas9-krab基因。在本發明的另一個具體實施方案中，dcas9-vpr基因或所述dcas9-krab基因被整合到所述a2lox.cre細胞基因組中hprt基因的5'端。本發明還提供了可誘導的crispron或crispri小鼠胚胎干細胞的制備方法，其包括以下步驟：(1)分別以dcas9-vpr和dcas9-krab表達載體(addgene#63800和#50917)為模板進行pcr擴增dcas9-vpr基因或dcas9-krab基因，并構建到含有loxp位點的載體上，得到構建體質粒；(2)在a2lox.cre細胞中加入強力霉素，誘導后，分別轉染步驟(1)中得到的構建體質粒，再加強力霉素誘導；誘導完成后，加入g418進行篩選；(3)將步驟(2)篩選得到的細胞擴增后加入強力霉素誘導，誘導后，篩選出可誘導的crispron或crispri小鼠胚胎干細胞。在本發明的一個優選的實施方案中，步驟(1)中，pcr擴增dcas9-vpr基因或dcas9-krab基因，并構建到pcr-entry載體(購自于invitrogen公司)上，然后通過lr反應(invitrogentmgatewaytm克隆系統)同源重組到含有loxp位點的p2lox-flag載體(mazzoni,e.o.等人，2010)上，得到構建體質粒p2lox-flag-dcas9-vpr或p2lox-flag-dcas9-krab。在本發明的上下文中術語“lr反應”屬于gatewaytm技術，gatewaytm技術是克隆和亞克隆dna序列的一項新穎的通用系統，便于功能基因的分析和蛋白質的表達。一旦進入這個多功能的操作系統，dna片段可以通過位點特異的重組在載體之間轉移。gatewaytm技術是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌體位點特異重組系統(attbxattp→attlxattr)。bp和lr兩個反應就構成了gatewaytm技術。bp反應利用一個attbdna片段或表達克隆和一個attp供體載體之間的重組反應，創建一個入門克隆。lr反應是一個attl入門克隆和一個attr目的載體之間的重組反應。lr反應用來在在平行的反應中轉移目的序列到一個或更多個目的載體。本發明還提供了一種調控基因表達的方法，其包括(1)設計靶向目的基因的sgrna序列；(2)將sgrna克隆到plx-sgrna載體；(3)包裝慢病毒；(4)用攜帶有sgrna的慢病毒感染所述的可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞。在本發明的一個優選的實施方案中，其中sgrna靶向目的基因的調控序列，所述目的基因的調控序列優選為啟動子或增強子。在本發明的另一個優選的實施方案中，其中通過改變強力霉素的濃度來調控基因表達水平。在本發明的另一個優選的實施方案中，強力霉素的濃度優選為0-1000ng/ml。本發明還提供了一種調控基因表達的試劑盒，其包含可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞和/或靶向目的基因的sgrna。本發明還提供了一種功能基因的篩選方法，其包括設計并合成sgrna文庫，利用所述sgrna文庫在所述的可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞或者其特定的分化細胞類型中進行基因篩選，確定各sgrna所對應基因的功能。本發明提供的可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞在a2lox.cre細胞基礎上構建，同源重組效率高，得到的穩定克隆陽性率高達90％以上。本發明提供的可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞實現了定點整合，dcas9-krab和dcas9-vpr整合到hprt基因的5'端，在管家基因的位置上表達穩定、效率高，并且不同于以往的轉座酶系統的隨機插入，不會引起意外的基因組變化。本發明首次在小鼠胚胎干細胞中實現了定點整合的可誘導體系。傳統crispr/cas9方法對基因的編輯可能造成在細胞基因組中預期之外的插入或刪除等，而本發明提供的基因表達調控的方法不編輯基因組序列，直接激活或者抑制基因表達。相對于基因功能研究中常用的基因過表達和rnai，本發明提供的可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞對目的基因特異性的激活或者抑制是一種內源性的轉錄調控。本發明提供的可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞中實現了融合蛋白可誘導和可逆地表達。根據改變強力霉素濃度，可以靈活控制dcas9融合蛋白的表達量和不同程度的轉錄激活或者抑制。本發明提供的可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞可以待細胞分化到特定階段加入強力霉素而實現特定時期的轉錄調控。通過靶向基因調控區不同區段的特異sgrna，也可以不同程度地開啟或關閉基因表達。本發明提供的可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞可以通過特異sgrna的靶向作用，研究潛在dna調控序列比如啟動子、增強子等轉錄調控功能。并且短時間的誘導可以實現在細胞命運不發生改變的情況下的轉錄調控，避免了細胞命運改變而繼發的不必要的干擾。在本發明的上下文中“rt-qpcr”是指實時熒光定量pcr，就是通過對pcr擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量pcr反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著pcr反應的進行，pcr反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。當然，實施本發明的任一產品或方法必不一定需要同時達到以上所述的所有優點。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1顯示了crispron和crispri小鼠胚胎干細胞基因組構建的示意圖；圖2顯示了dcas9-vpr基因和dcas9-krab基因整合進小鼠胚胎干細胞a2lox.cre基因組的驗證結果；圖3顯示了強力霉素可逆地誘導dcas9-krab和dcas9-vpr融合蛋白的表達；圖4a和4b顯示了不同濃度的強力霉素不同程度地誘導dcas9-krab和dcas9-vpr融合蛋白的表達；圖4c顯示了隨著強力霉素濃度的增加，nkx2.5基因的mrna表達水平增加。圖5顯示了選取靶向基因啟動子的特異sgrna，強力霉素誘導相應基因不同程度的轉錄激活或者抑制效應；圖6顯示了靶向特異基因增強子(近端增強子pe或者遠端增強子de)的sgrnas，強力霉素誘導相應基因不同程度的轉錄激活或者抑制效應。具體實施方式下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。實施例1可誘導的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞的制備分別以dcas9-vpr和dcas9-krab表達載體(addgene#63800和#50917)為模板進行pcr。pcr反應引物參見表1。表1pcr引物引物名稱序列(5’-3’)seqidno.dcas9-vpr上游引物atggacaagaagtactccattgg1dcas9-vpr下游引物ttaaaacaaacttgtgtcaaata2dcas9-krab上游引物atggacaagaagtactccattgg3dcas9-krab下游引物ttataccagccaaggttcttccc4pcr反應體系：加入10μleasytaq酶72℃延伸20min。將上述兩個pcr片段分別構建到pcr8-entry載體(invitrogen)上，然后通過lr反應(invitrogentmgatewaytm克隆系統)同源重組到含有loxp位點的p2lox-flag載體(mazzoni,e.o.等人，2010)上，得到的構建體質粒分別命名為p2lox-flag-dcas9-vpr和p2lox-flag-dcas9-krab。在a2lox.cre細胞中加入500ng/ml終濃度的強力霉素，誘導24小時后分別轉染質粒p2lox-flag-dcas9-vpr或p2lox-flag-dcas9-krab，再加入500ng/ml終濃度的強力霉素誘導24小時。表達的cre酶對loxp位點進行同源重組，將轉入質粒的基因組片段整合到tre啟動子的下游；同時把質粒中pgk啟動子和起始密碼atg整合到了δneo上游，使neo基因得以表達，細胞因而獲得g418抗性。轉染24小時后加入g418(300μg/ml)進行篩選。圖1示出了本發明的crispron和crispri小鼠胚胎干細胞基因組構建的示意圖。通過pcr進行基因組驗證，pcr反應引物參見表2。表2基因組驗證所用的pcr引物引物名稱序列(5’-3’)seqidno.dcas9基因組驗證上游引物ttaccactccctatcagtgatag5dcas9基因組驗證下游引物aggaagctctcttccagcctatg6基因組驗證所用的pcr反應體系：基因組驗證pcr反應條件：驗證結果見圖2，該結果驗證了dcas9-vpr和dcas9-krab分別插入到tre序列的下游，a2.lox.cre為陰性對照，a2lox.cre-crispron為dcas9-vpr和tre序列pcr的結果，a2.lox.cre-crispri為dcas9-krab和tre序列pcr的結果。測序結果同樣驗證了克隆的正確性。dcas9-vpr基因的序列如seqidno.7所示，dcas9-krab基因的序列如seqidno.8所示。對篩選所得的單克隆細胞，分別進行細胞增殖，然后加入500ng/ml終濃度的強力霉素誘導，通過常規的westernblot法檢測dcas9-vpr或者dcas9-krab融合蛋白的表達，誘導后穩定表達的即為陽性小鼠胚胎干細胞克隆，分別命名為tre-dcas9-vpr和tre-dcas9-krab，然后進行細胞增殖以備用。westernblot法是本領域的常規技術，具體步驟可以參見例如《分子克隆實驗指南(第三版)》，在此不做贅述。實施例2dcas9-vpr或dcas9-krab融合蛋白表達的可誘導性和可逆性將實施例1獲得的小鼠胚胎干細胞克隆tre-dcas9-vpr或tre-dcas9-krab在小鼠胚胎干細胞培養基(gmem培基，15％胎牛血清，0.1mmβ-巰基乙醇，2mm谷氨酰胺，0.1mm非必需氨基酸，1％青霉素/鏈霉素，1mm丙酮酸鈉，5ng/mllif(白血病抑制因子)，小鼠胚胎干細胞所用的培養皿要用0.1％的明膠提前包被)中培養，加入500ng/ml終濃度的強力霉素，培養24小時后撤出強力霉素，換上不含強力霉素的小鼠胚胎干細胞培養基再分別培養24、48、72小時；以β-肌動蛋白作為內參。用westernblot法檢測dcas9-krab和dcas9-vpr融合蛋白的表達量，結果如圖3所示，dcas9-krab和dcas9-vpr融合蛋白在加入強力霉素的10小時左右即開始表達，并且在強力霉素存在的情況下會持續表達；撤去強力霉素48小時以后融合蛋白就會消失。采用一系列梯度濃度(20ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)的強力霉素，將實施例1獲得的小鼠胚胎干細胞克隆tre-dcas9-vpr或tre-dcas9-krab處理12小時后收獲細胞，用westernblot法檢測dcas9-krab和dcas9-vpr融合蛋白的表達量，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)作為內參，結果如圖4a和4b所示，不同濃度的強力霉素不同程度地誘導dcas9-krab和dcas9-vpr融合蛋白的表達。實施例3通過靶向基因的sgrna調控目的基因表達(1)根據轉錄起始位點附近的序列設計靶向nkx2.5的sgrna，其序列為seqidno.5：cgggcggcgggcaccatgcg。sgrna的設計方法是本領域的常規技術，本領域技術人員也可以選擇sgrna設計軟件或在線設計(如http://www.e-crisp.org/e-crisp/，http://crispr.mit.edu/等)來設計相應的sgrna，在此不做贅述。將該sgrna克隆到plx-sgrna載體(addgene#50662)，包裝慢病毒，感染實施例一制備的tre-dcas9-vpr和tre-dcas9-krab細胞，兩天后加入blasticidin(4μg/ml)進行篩選。篩選4-6天后存活的細胞中加入500ng/ml終濃度的強力霉素，孵育48小時后通過rt-qpcr檢測相應目的基因相對于不誘導細胞的nkx2.5的mrna表達水平變化。rt-qpcr是本領域的常規技術，在此不做贅述。由圖4c可知，隨著強力霉素濃度的增加，nkx2.5基因的mrna表達水平增加。實施例4通過靶向基因啟動子的sgrna調控目的基因表達設計靶向基因nkx2.5、oct4和kdm2b啟動子的sgrna：nkx2.5-sgrna#1、nkx2.5-sgrna#2、oct4-sgrna#1、oct4-sgrna#2、kdm2b-sgrna#1、kdm2b-sgrna#2，這些sgrna的序列參見表3。表3一些靶向基因啟動子的sgrna的序列將表3中示出的sgrna分別克隆到plx-sgrna載體，包裝慢病毒，分別感染實施例1制備的tre-dcas9-vpr或tre-dcas9-krab小鼠胚胎干細胞，兩天后加入殺稻瘟菌素(4μg/ml)進行篩選。篩選4-6天后存活的細胞中加入500ng/ml終濃度的強力霉素，孵育48小時后通過rt-qpcr檢測相應目的基因相對于不誘導細胞的nkx2.5的mrna表達水平變化。圖5分別示出了加入強力霉素前后nkx2.5、oct4、kdm2b三種基因轉錄水平的變化，可見dcas9-vpr融合蛋白激活nkx2.5基因的轉錄起始區誘導基因轉錄上調，dcas9-krab抑制oct4、kdm2b基因的轉錄起始區誘導基因轉錄下調。實施例5通過靶向基因增強子的sgrna調控目的基因表達設計靶向特異基因增強子即近端增強子pe和遠端增強子de的sgrna：nkx2.5pe-sgrna#1、nkx2.5pe-sgrna#2、sox2de-sgrna#1、sox2de-sgrna#2，這些sgrna的序列參見表4。表4一些靶向特異基因增強子的sgrna的序列sgrna序列名稱序列(5’-3’)seqidno.nkx2.5pe-sgrna#1ggttcgggcagtgactcttg15nkx2.5pe-sgrna#2cgccgcaccatctttttctt16sox2de-sgrna#1acccaacgtacatgtttttg17sox2de-sgrna#2gctataaagtcacctggtgc18將表4中示出的sgrna分別克隆到plx-sgrna載體，包裝慢病毒，分別感染實施例1制備的tre-dcas9-vpr或tre-dcas9-krab小鼠胚胎干細胞，兩天后加入殺稻瘟菌素(4μg/ml)進行篩選。篩選4-6天后存活的細胞中加入500ng/ml終濃度的強力霉素，孵育48小時后通過rt-qpcr檢測相應目的基因相對于不誘導細胞的nkx2.5的mrna表達水平變化。圖6分別示出了加入強力霉素前后nkx2.5、sox2兩種基因轉錄水平的變化，可見融合蛋白dcas9-vpr激活nkx2.5近端增強子區誘導基因轉錄上調，融合蛋白dcas9-krab抑制sox2遠端增強子區誘導基因轉錄下調。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并非用于限定本發明的保護范圍。凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換、改進等，均包含在本發明的保護范圍內。參考文獻1.jinek,m.,etal.,aprogrammabledual-rna-guideddnaendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.science,2012.337(6096):p.816-21.2.cong,l.,etal.,multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.science,2013.339(6121):p.819-23.3.dominguez,a.a.,w.a.lim,andl.s.qi,beyondediting:repurposingcrispr-cas9forprecisiongenomeregulationandinterrogation.natrevmolcellbiol,2016.17(1):p.5-15.4.iacovino,m.,etal.,induciblecassetteexchange:arapidandefficientsystemenablingconditionalgeneexpressioninembryonicstemandprimarycells.stemcells,2011.29(10):p.1580-8.5.mazzoni,e.o.,etal.,embryonicstemcell-basedmappingofdevelopmentaltranscriptionalprograms.natmethods,2011.8(12):p.1056-8.序列表<110>天津醫科大學<120>可誘導的crispron或crispri小鼠胚胎干細胞及其應用<130>pp170468<160>18<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9-vpr上游引物<400>1atggacaagaagtactccattgg23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9-vpr下游引物<400>2ttaaaacaaacttgtgtcaaata23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9-krab上游引物<400>3atggacaagaagtactccattgg23<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9-krab下游引物<400>4ttataccagccaaggttcttccc23<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9基因組驗證上游引物<400>5ttaccactccctatcagtgatag23<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9基因組驗證下游引物<400>6aggaagctctcttccagcctatg23<210>7<211>5700<212>dna<213>人工序列<220><223>dcas9-vpr基因<400>7atggacaagaagtactccattggcctcgccatcggaacaaatagcgtgggctgggctgtc60atcacagatgagtacaaggtgcctagcaagaaatttaaggtgctgggaaatacagacaga120catagcatcaagaagaacctcattggcgctctcctgtttgactccggcgaaacagccgaa180gctaccagactcaagagaaccgctaggagaaggtacaccagaaggaaaaacaggatttgc240tacctgcaggaaattttttccaacgagatggccaaggtggacgattccttcttccatagg300ctggaagagagcttcctcgtggaggaagacaagaaacacgagaggcatcctatttttggc360aatattgtggatgaggtcgcctaccatgagaagtatcccacaatctatcatctgagaaaa420aaactggtggatagcaccgacaaggccgatctcaggctcatttatctcgctctggctcac480atgatcaagtttaggggccacttcctgatcgaaggcgacctgaatcccgacaactccgac540gtggacaaactgttcatccagctcgtccagacctacaatcaactcttcgaggagaacccc600atcaatgct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