一種抗m6A單克隆抗體的制備方法與流程

本發明涉及醫學生物工程技術領域，具體地說，是一種抗m6a單克隆抗體的制備方法。

背景技術：

人類dna和蛋白質上存在著豐富的化學修飾，其動態變化發揮著重要的作用，通過參與基因表達調控，決定細胞的狀態，影響細胞的分化和發育。最新的研究表明，rna中的化學修飾與dna和蛋白質中的化學修飾相似，也在調控個體生命活動中發揮著重要的作用。其中，m6a是真核生物中最常見的rna轉錄后修飾形式，也是近年來表觀遺傳學研究的熱點。m6a是發生在堿基a第六位n原子上的甲基化修飾形式，其導致了超過80％的rna堿基甲基化。越來越多的研究證實，基于m6a修飾的rna甲基化調控通過調節mrna及mirna的剪接、轉運、代謝，參與機體發育、代謝及繁殖的整個過程，并與多種疾病密切相關。目前，人們對rna甲基化的動態變化的檢測及在轉錄組中的分布研究主要依賴于基于m6a單克隆抗體的elisa和merip技術，因此，制備具有高特異性、高親和力的m6a單克隆抗體十分重要。

m6a的分子量小于1000da，屬于僅有反應原性而無免疫原性的半抗原，難以通過常規的動物免疫制備抗體。目前，制備小分子半抗原抗體的一般方法是：通過共價鍵使半抗原與大分子質量蛋白質載體偶聯，制備人工免疫原，經動物免疫程序制備特異性抗體。其中，涉及半抗原的設計，連接臂的引入及活性基團的選擇等多個技術環節，工藝復雜。

因此，提供一種簡單、易行的適用于m6a的抗體制備方法具有重要的意義。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種抗rna表觀遺傳修飾m6a的單克隆抗體的制備方法，用于解決現有技術中通過載體蛋白偶聯m6a來制備m6a抗體技術工藝復雜成本高的問題。

本發明的第一方面，提供一種抗m6a單克隆抗體的制備方法，包括：步驟一，活化載體納米磁珠；步驟二，以所述納米磁珠為載體，通過與核苷偶聯制備免疫原；步驟三，利用所述的免疫原制備m6a抗體；

其中，所述的核苷是m6a，其化學結構如下式所示；

所述的載體納米磁珠：平均粒徑為300-1000nm；表面氨基基團含量在～200μm；磁核為fe3o4。在本發明的優選實施方式中，所述的載體納米磁珠選自由蘇州海貍生物醫學工程有限公司生產的nhs磁珠。

所述的步驟一活化載體納米磁珠的步驟包括：磁珠預處理，充分混勻磁珠后，取100μl磁珠到1mlep管中，磁吸去除上清液，用200μlpbs溶液洗滌3次，磁吸去上清；戊二醛活化，加入新鮮配制的質量體積比為15％的戊二醛溶液到ep管中，渦旋混勻，避光反應1h；活化后洗滌，磁珠活化后，磁吸去上清，用pbs緩沖液洗滌3次。

所述的步驟二納米磁珠與核苷偶聯制備免疫原的步驟包括：向裝有磁珠的ep管中加入200μgm6a，輕柔混勻，避光反應3h；將ep管置于磁分離架上磁性分離去除上清液，加入200-1000μlpbs溶液重懸磁珠，反應1h；將ep管置于雌性分離架上磁性分離去除上清液，用pbs洗滌3次后，重新懸浮于保存溶液中。

所述的步驟三利用所述的免疫原制備m6a抗體的步驟包括：將上述納米磁珠與核苷偶聯物作為免疫原免疫小鼠；獲取免疫小鼠的脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合；經過多輪篩選獲得分泌識別m6a單分子的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；通過在小鼠體內接種上述雜交瘤細胞生產腹水抗體，將腹水進行純化，得到所述的抗m6a單克隆抗體。

本發明的第二方面，提供一種m6a偶聯復合物，包括核苷及其偶聯的載體納米磁珠，其中核苷是m6a，其化學結構如下式所示；所述的載體納米磁珠：平均粒徑為300-1000nm；表面氨基基團含量在～200μm；磁核為fe3o4；

所述的m6a偶聯復合物的制備方法，包括以下步驟：

a)磁珠預處理，充分混勻磁珠后，取100μl磁珠到1mlep管中，磁吸去除上清液，用200μlpbs溶液洗滌3次，磁吸去上清；

b)戊二醛活化，加入新鮮配制的戊二醛溶液(15％)到ep管中，渦旋混勻，避光反應1h；

c)活化后洗滌，磁珠活化后，磁吸去上清，用pbs緩沖液洗滌3次；

d)向裝有磁珠的ep管中加入200μgm6a，輕柔混勻，避光反應3h；

e)將ep管置于磁分離架上磁性分離去除上清液，加入200-1000μlpbs溶液重懸磁珠，反應1h；

f)將ep管置于雌性分離架上磁性分離去除上清液，用pbs洗滌3次后，重新懸浮于保存溶液中。

本發明優點在于：

本發明提供一種制備抗rna表觀遺傳修飾m6a抗體簡易、高效、廉價的方法，通過納米磁珠偶聯的m6a來制備單克隆抗體，解決了小分子化合物免疫原性差的問題，制備了具有更加的親和力和特異性的m6a單克隆抗體。本發明方法制備的單克隆抗體可特異性識別吸附在硝酸纖維素膜上的變性狀態下的m6a分子，實現準確、靈敏地監測rna的甲基化水平的動態變化及m6a在rna轉錄物的分布，可用于研究rna甲基化修飾對人類器官發育和腫瘤發生等生理及病理過程的調控作用，對基因表達的轉錄后調控機制及相關疾病的研究具有十分重大的意義。

附圖說明

圖1是點雜交檢測圖，是純化獲得的抗體與不同稀釋濃度m6a結合的點。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明提供的具體實施方式作詳細說明。

實施例1.m6a偶聯復合物的制備：

本發明將抗原m6a與納米磁珠偶聯，以偶聯物作為免疫原，增強小分子m6a的免疫原性。具體操作步驟如下：

a)磁珠預處理，充分混勻磁珠后，取100μl磁珠到1mlep管中，磁吸去除上清液，用200μlpbs溶液洗滌3次，磁吸去上清；

b)戊二醛活化，加入新鮮配制的戊二醛溶液(15％)到ep管中，渦旋混勻，避光反應1h；

c)活化后洗滌，磁珠活化后，磁吸去上清，用pbs緩沖液洗滌3次；

d)向裝有磁珠的ep管中加入200μgm6a，輕柔混勻，避光反應3h；

e)將ep管置于磁分離架上磁性分離去除上清液，加入200-1000μlpbs溶液重懸磁珠，反應1h；

f)將ep管置于雌性分離架上磁性分離去除上清液，用pbs洗滌3次后，重新懸浮于保存溶液中。

實施例2.抗m6a的單克隆抗體的制備和純化

1.抗原混合液的制備

取25ul的m6a偶聯復合物，加入25ul的生理鹽水進行，成為50ul的抗原稀釋液，與50ul的佐劑迅速混合，即100ul的抗原混合液(此為每只babl/c小鼠的免疫用量)。

2.免疫動物

本發明所用免疫動物為balb/c小鼠，免疫佐劑為kx0210041，購自北京博奧龍免疫技術有限公司。

1)腿部肌肉注射免疫babl/c小鼠(100ul/只)。

2)每隔一個月進行重復免疫，免疫三次。

3.單克隆抗體的制備和純化

將成功獲得的抗原混合免疫鼠齡為8～12周的雌性balb/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，將3只小鼠的脾臟混合進行融合。

免疫反應最好的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞(sp2/0)進行融合，融合后的細胞經過適當稀釋，分置于96孔培養板中培養，培養10-14天進行elisa檢測，挑選od值高的孔中的細胞進行有限稀釋法亞克隆。

具體方法如下：

1)將有限稀釋的細胞培養至96孔板中，待克隆生長到全孔的1/6時，標記單克隆及多克隆，對單克隆進行elisa檢測。

2)elisa檢測后將od值最高的單克隆再有限稀釋接入96孔板中如上法所述再次亞克隆，此過程重復數次，直至陽性孔比率為100％，即認為此為單克隆。即通常認為的建株成功的細胞株。

3)將篩選得到的陽性單克隆擴大培養，細胞數按1-2×10⁶/管進行凍存。同時收集細胞安排腹水制備。

4)細胞株采用小鼠腹腔接種法制備腹水，10-14天收集腹水，elisa檢測腹水是否制備成功。

5)腹水完成后采用proteina柱純化腹水。

實施例3.抗m6a的單克隆抗體的點雜交檢測

分別將含有100μg、25μg、5μg的m6a核苷溶液點樣于硝酸纖維素膜上，待溶液吸干，加封閉液于室溫封閉至少1h；pbst洗液洗膜5次，用所制備的單克隆抗體作為一抗，4℃孵育過夜。孵育結束后用pbst洗液洗膜5次，抗體稀釋液稀釋hrp標記的抗小鼠二抗，孵育1h，pbst洗液洗膜5次。用增強型hrp-dab底物顯色試劑盒進行顯色，結果如圖1所示。

以上已對本發明創造的較佳實施例進行了具體說明，但本發明創造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發明創造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。