一種南極冰藻6?4光修復酶、其編碼基因和表達載體以及該酶的應用的制作方法

本發明屬于生物學
技術領域：
，具體涉及一種南極冰藻6-4光修復酶、其編碼基因和表達載體以及該酶的應用。
背景技術：
：人類活動對大氣中臭氧層的破壞，尤其是南北兩極臭氧空洞的出現、擴大，使得輻射到地球表面的太陽光中紫外線增強，導致生物圈受紫外線傷害日益嚴重。加之隨著生活水平的日益提高，越來越多的人們熱衷戶外活動，接觸紫外線的時間在增多。由于皮膚暴露于外表，皮膚中許多分子吸收uv輻射，并產生各種dna損傷。而dna分子是生命體的遺傳物質基礎，其完整性是維持生命的根本。若受損的dna得不到及時和有效的修復，細胞將走向凋亡或發生變異并導致細胞癌變。紫外輻射引起dna損傷的根本原因在于其能誘發dna同條鏈內相鄰的嘧啶堿基產生嘧啶二聚體，使dna空間結構發生變化，從而阻礙了dna復制、轉錄進而影響蛋白質的生物功能。紫外線輻射對生物體dna的主要損害是在dna中形成嘧啶二聚體（cpds）和（6-4）光產物（6-4）pps。這兩種光產物阻礙了在dna復制或轉錄時聚合酶的進程，從而導致生物體dna的紫外輻射損傷，對生物體具有致突變、致癌變和致死等效應。平流層的臭氧減少10%，全球白內障的發病率將增加6～8%，惡性皮膚瘤的發病率將增加26%；人類存在于皮膚中的免疫功能也會因紫外線的強烈輻射而受損傷，抵抗疾病的能力大大降低。光修復作用一種重要的dna修復方法，dna光修復酶承擔了修復dna損傷并保持生物遺傳穩定性的重要功能。dna光修復酶分為cpd光修復酶和（6-4）光修復酶兩種途徑，這兩種酶均有各自的修復途徑，它們的一種酶只能修復一種損傷而不能修復另外一種。利用cpd光修復酶和（6-4）光修復酶分別來修復cpds和（6-4）pps；即光修復酶可以解開嘧啶二聚體和（6-4）光產物，使損傷的dna恢復正常狀態。在細菌、昆蟲、高等植物、脊椎動物和某些低等哺乳動物體內發現了光修復酶及其基因，但在高等哺乳動物包括人體內尚未發現dna光修復酶的存在。而在高等哺乳動物細胞中，核酸外切修復（ner）是修復dna損傷的最主要途徑。哺乳動物（包括人）都缺少光修復系統，而低等生物的光修復酶對人體的dna修復同樣有效。人體試驗證明光修復酶蛋白可以被人體吸收并發揮功效，為光修復酶用于人類紫外線損傷及其相關疾病防護和治療產品開發提供可靠科學依據。有部分群體存在ner修復系統缺乏或不完整，表現出各種疾病，最常見的是著色性干皮病(xp)患者，除此之外cockayne綜合癥和光敏型的毛發硫營養障礙癥也存在ner修復系統缺乏。因此，光修復酶也可以應用到以上疾病的治療。盡管生活在南極強紫外輻射的環境中，南極冰藻仍旺盛生長繁殖，這預示著南極冰藻遺傳學上對dna紫線損傷的高效自我修復能力應是其適應這種惡劣環境的關鍵機制。與其它地區生物相比，南極冰藻中用于修復紫外線損傷dna的光修復酶結構與功能應該有其特異性，才能適應南極這種極為惡劣的強紫外線輻射環境。光修復酶在生物體內的含量極少，每個細胞約有10～20個光修復酶分子，這使得直接從生物體中分離純化光修復酶并進行其結構、功能活性和作用機制研究極為困難，但隨著基因克隆技術的發展，可以利用基因工程手段克隆南極冰藻光修復酶基因，并將其轉化到目的宿主中，完成光修復酶的過量表達和純化，并對其進行詳細的研究。dna光修復酶分為cpd光修復酶和（6-4）光修復酶兩種，這兩種酶的一種酶只能修復一種損傷而不能修復另外一種。本發明人在國內外首次開展了南極冰藻cpd光修復酶及其作用機制的研究工作，發明（cn103160488b）提供了一種南極冰藻cpd光修復酶、其編碼基因和表達載體以及該酶的應用。但是較之cpd光修復酶，對（6-4）光修復酶及修復機理方面的認識要少得多，尤其是關于強紫外線輻射生境中南極生物（6-4）光修復酶尚未見研究。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是提供了一種南極冰藻6-4光修復酶、其編碼基因和表達載體以及該酶的應用，本發明是將6-4光修復酶的編碼基因克隆到表達載體中，得到6-4光修復酶，并將6-4光修復酶合理應用到化妝品、生物醫藥等相關領域，解決了
背景技術：
中存在的技術問題。本發明對于生物（包括人類）紫外線輻射損傷修復及其相關疾病防治具有重要理論和實際意義。為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：本發明提供了一種南極冰藻6-4光修復酶，其氨基酸序列如seqidno:2所示。進一步的：所述南極冰藻6-4光修復酶的等電點為8.86，相對分子質量為63.1kda。本發明還提供了所述的南極冰藻6-4光修復酶的編碼基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。進一步的：克隆所述編碼基因的引物為：f：atggcttctgtgaccggcaa；r：tcactctgtctccttcttgctt。本發明還提供了含有所述的南極冰藻6-4光修復酶編碼基因的表達載體。所述表達載體為bl21(de3)/pet-28a(+)/6-4phr。進一步的：所述表達載體還包括選擇性標記基因，包括但不限于：在表達菌株中產生顏色變化的酶的基因、或發光化合物的基因、或具有抗生素標記物的基因。本發明還提供了所述的南極冰藻6-4光修復酶在用于制備修復紫外損傷的制劑中的應用。本發明還提供了所述的南極冰藻6-4光修復酶在用于制備化妝品中的應用。由于采用了上述技術方案，本發明的優點和有益技術效果是：本發明通過race得到南極冰藻（6-4）光修復酶的基因cdna全長，同時，根據該基因片段序列設計引物，進行pcr擴增獲得全長（6-4）光修復酶基因。同時，通過熒光定量pcr檢測該基因在紫外脅迫和強光照射條件下的表達模式。將該基因克隆到原核克隆載體pmd18-t，進行測序驗證。將構建好的重組載體經酶切后連接原核表達載體pet-28a(+)，在大腸桿菌bl21中表達。最終經過親和層析得到純化蛋白。為了方便過量表達菌株的鑒定和篩選，可對表達載體進行加工，如加入可產生顏色變化的酶或發光化合物基因(如gfp基因、熒光素酶基因等)，或具有抗性的抗生素標記物。本發明將獲得的所述南極冰藻（6-4）光修復酶應用于保健品、化妝品、生物醫藥等相關領域以主動修復由紫外線引起病癥。例如，防曬霜可以將皮膚與紫外線隔離開來，通過對光的反射和吸收兩種機制起作用，以減少紫外線對皮膚的損傷，但無法對損傷的皮膚進行修復。本發明的重組蛋白dna光修復酶可以作為高級護膚品的功能成分，主動修復由紫外線引起的紅斑、皮膚炎癥以及基因損傷，延緩衰老，徹底突破了當前“防”紫外線的概念。本發明首次克隆了南極冰藻（6-4）光修復酶基因，并成功將其克隆到表達載體中，獲得大量（6-4）光修復酶，并將（6-4）光修復酶應用到保健品、化妝品、生物醫藥等相關領域，能夠主動修復由紫外線引起病癥，帶來巨大的社會效益，意義重大。附圖說明圖1是sds-page電泳圖。圖2是（6-4）光修復酶與dna的結合實驗結果。圖3是對照組小鼠皮膚（左）及組織切片（右）圖，標尺示100μm。圖4是紫外照射組小鼠皮膚（左）及組織切片（右）圖，標尺示100μm。圖5是治療組小鼠皮膚（左）及組織切片（右）圖，標尺示100μm。具體實施方式為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下述實施例中所使用的方法均為本領域常規操作，詳見《分子克隆實驗指南》。實施例1：南極冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修復酶cdna序列的獲得1、南極冰藻的培養、總rna的分離將南極冰藻chlamydomonassp.ice-l（從2001年11月中國第十八次南極科學考察期間在中山站（69°s,77°e）附近采集的海水和海冰樣品中分離純化得到，保存在國家海洋局海洋生物活性物質重點實驗室南極冰藻藻種庫中）采用f/2培養基，培養溫度為0～6℃，培養光強為1300～1900lux,光照周期12:12。不充氣，每日搖動3次。接種量為20％。培養基成分（mg/l）：過濾陳海水，kh2po415，nano315，fec6h5o70.4，脲20。4℃培養至對數期，用invitrogen公司的trizol進行rna的提取。試驗按照trizol試劑的提取流程說明進行操作，在整個過程中保證無rnase污染，將提取的rna分裝成小份，凍存于-80℃冰箱備用。2、（6-4）光修復酶基因cdna序列的獲得根據獲得的南極冰藻轉錄組序列，篩選出（6-4）光修復酶基因片段，發現該基因5’完整，因此，根據片段序列設計引物進行3’-race：3’-race引物：gsp1：5’-gtggggttggattcatcacttggctcgt-3’（seqidno:3）；gsp2：5’-ggattcatcacttggctcgtcactcggt-3’（seqidno:4）；3’-race反轉錄體系如下：模板rna，0.5μg1.0μl；3’-cds引物a1.0μl；rnasefreeh2o4.75μl；樣品混勻后，70°c3min，,42°c2min，14,000g離心10s；5×first-strandbuffer2.0μl；dtt，20mm1.0μl；dntp，10mm1.0μl；rnaseinhibitor，40u/μl0.25μl；smartscribereversetranscriptase，100u/μl1.0μl。輕微振蕩后離心數秒鐘；于42℃90min，70℃10min，冰上急冷2min以上；用tricine-edtabuffer稀釋，保存于-20℃，待用。3、將獲得的高質量rna進行反轉錄，合成cdna，進行pcr反應，pcr反應體系如下：pcr-grade-water34.5μl；10×advantage2pcrbuffer5.0μl；dntpmix，10mm1.0μl；50×advantage2polymerasemix1.0μl；5’/3’-racereadycdna2.5μl；upm，10×5.0μl；gsp1/21.0μl。pcr反應條件為：94℃30s，72℃3min，5個循環；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5個循環；94℃30s，68℃30s，72℃3min，27個循環。4、pcr結束后用1.0％的瓊脂糖進行回收，連接到pmd18-t，轉化e.colidh5α，進行測序驗證；利用ncbi在線工具，即http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi，將所得序列應用blast程序進行序列同源性比對和相似性分析；用dnastar軟件進行序列拼接，并在ncbi中比對，以確認獲得目的基因為6-4光修復酶基因的完整編碼區序列（核苷酸序列如seqidno:1所示）。實施例2、南極冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修復酶表達載體構建1、根據測序得到的光修復酶基因完整序列設計引物：（6-4）f：5’-atggcttctgtgaccggcaa-3’（seqidno:5）；（6-4）r：5’-tcactctgtctccttcttgctt-3’（seqidno:6）；pcr反應條件為：95℃預變性10min，95℃變性15s，55℃退火1min，72℃延伸2min反應進行30個循環。2、將光修復酶基因的pcr擴增產物和原核表達載體pet-28a(+)，分別用ecorⅰ和xhoⅰ于37℃酶切2h，用1.0%的瓊脂糖分別進行回收，將純化好的目的片段及載體用t4dna連接酶于16℃下連接16h，得到重組質粒。連接體系如下。反應體系體積6-4phr3.5μl；pet-28a(+)4.5μl；連接酶1μl；連接緩沖液1μl；反應總體系10μl。3、將連接好的重組質粒轉化大腸桿菌dh5α，步驟如下：(1)取感受態細胞300μl于1.5ml離心管中，冰浴5min。(2)于每管中加入5μl連接過的質粒，輕輕旋轉以混合內容物，冰浴30min。(3)42℃熱休克90s，不要搖動試管。(4)取10ml無菌試管，每管加入800μllb液體培養基，冰浴。(5)取轉化后的細胞200μl加入800μllb液體培養基中，37℃150rpm振蕩培養45min。(6)將100μl轉化的菌液涂布于平板表面，37℃培養培養12～16h。4、挑取白色的菌落分別置于5ml含卡那霉素的lb液體培養基中，37℃振蕩培養8～12h，堿裂解法提取質粒以進行酶切鑒定。鑒定正確的質粒以相同方法轉化大腸桿菌bl21(de3)，測序鑒定得到重組菌株bl21(de3)/pet-28a(+)/6-4phr。實施例3、極冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修復酶的純化及蛋白檢測1、將重組菌株bl21(de3)/pet-28a(+)/6-4phr接種于5ml含卡那霉素的lb液體培養基中，于37℃振蕩過夜培養。次日取5ml菌液接入500ml相同的培養基繼續培養2～3h（od600約0.6）后，加入終濃度為1mm的iptg，于10℃振蕩培養24h，8000g離心10min，收集菌體。2、ni瓊脂糖親和柱親和層析：將金屬螯合劑ni瓊脂糖裝入層析柱，用1×ni柱結合緩沖液平衡。將上清液上柱。一般用50mm咪唑洗脫，得到目的蛋白即所述南極冰藻（6-4）光修復酶，其氨基酸序列如seqidno:2所示。3、取上述誘導表達的bl21(de3)/pet-28a(+)/6-4phr菌體和純化的6-4phr基因表達的蛋白質，分別與等體積的2×上樣緩沖液混合，100℃水浴3～5min。配制12%的sds-page分離膠和5%的濃縮膠，取20μl加樣于凝膠，在濃縮膠中100v，分離膠中120v，進行sds-page電泳，電泳結束進行考馬斯亮藍染色。結果如圖1所示，其中m表示標準分子量，1和2為bl21(de3)/pet-28a(+)/6-4phr菌體蛋白，而3，4，5和6表示不同分離階段制備的南極冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修復酶。圖1說明，利用上述方法能夠得到南極冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修復酶。實施例4、南極冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修復酶蛋白序列分析獲得的的南極冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修復酶基因的開放閱讀框（orf）長度為1680bp，編碼559個氨基酸殘基。（6-4）光修復酶等電點為8.86，測定的相對分子質量為63.1kda。將南極衣藻chlamydomonassp.ice-l的（6-4）光修復酶的氨基酸序列在ncbi上進行同源性比對，在核酸數據庫中沒有明顯的序列同源性。發現南極衣藻（6-4）光修復酶的氨基酸序列與鹽生杜氏藻（6-4）光修復酶的親緣關系最近。實施例5、南極冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修復酶修復紫外損傷的作用檢測1、南極冰藻（6-4）光修復酶基因重組菌株接種于三角燒瓶中，在搖床中進行培養。6000r?min-1離心收獲菌體。超聲破碎菌體，10000r?min-1離心去除菌體碎片，上清液先用超濾儀收集50000-100000da組分進行初步分離，經過鎳親合柱層析分離，再經sepharosefastflow進一步純化，得到南極冰藻（6-4）光修復酶基因表達產物。2、向人工合成的d(pt)16中加雙蒸水溶解，使d(pt)16濃度為10μmol。將d(pt)16加至石英比色皿中，100μw/cm2uvb照射，每10min測定一次引物od325值，至od325值恒定。先按照下面體系中對照組的體系配制溶液。實驗組：對照組：0.01mol/ldtt50μl0.01mol/ldtt50μl酶50μl酶50μl10μmold(pt)1650μl供試buffer900μl供試buffer850μltotalvolume1000μltotalvolume1000μl將實驗組和對照組置于相同光照條件下（藍光）修復。使用emsa凝膠阻滯遷移電泳檢測的方法進行酶活測定，檢測其體外修復活性和了解其修復過程。通過檢測（6-4）光修復酶與dna的結合程度，計算其對6-4光產物的修復率。實驗結果如圖2所示。實施例6、所述（6-4）光修復酶在化妝品領域中的應用在紫外線損害下，人體肌膚加速衰老。dna光修復酶可以保護皮膚免受紫外線的損傷，改善皮膚的健康狀況，長期使用可以減少皮膚病和皺紋。本實施例中，采用卵磷脂及膽固醇包埋實施例3純化后的南極冰藻（6-4）光修復酶，后添加至化妝品中。選擇6周左右的小鼠，陽性對照涂抹光修復酶，對其背部皮膚進行紫外照射實驗，每只小鼠經過3天重復處理，制作皮膚切片，進行蘇木素-伊紅染色。實驗結果如圖3-5所示，紫外輻射損傷小鼠表皮會明顯增厚，而涂抹南極冰藻（6-4）光修復酶的小鼠表皮具有明顯修復功能。因此，可以將南極冰藻光修復酶添加到化妝品中。實施例7、所述（6-4）光修復酶在生物醫藥領域中的應用紅斑反應是以一定劑量的紫外線照射皮膚后，經過一段時間，照射皮膚呈現邊界清楚、均勻充血的反應。用254nm波長紫外線照射小鼠背部皮膚30min，12h產生紅斑，隨機選取小鼠在紅斑附近皮膚進行皮下注射，每天注射0.1mg南極冰藻（6-4）光修復酶，連續3天，實驗結果表明1周后治療組紅腫皮膚有明顯改善。南極冰藻光修復酶可以應用于醫藥領域。以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。sequencelisting<110>國家海洋局第一海洋研究所<120>一種南極冰藻6-4光修復酶、其編碼基因和表達載體以及該酶的應用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>1680<212>dna<213>南極冰藻<400>1atggcttctgtgaccggcaaagccaaaatcgtgtggttcagaaagggtttacgactgcat60gacaacccagccctcattgaggcctgtcgtggagctgcccatgtgtaccccatcttcatc120ctagatccccacttccgtagtgctggttacaaggttggagtgaaccgttttaaattcctc180atgcaatctctgacagatctaaatgacagctttgaggcaaggggatcccgcttgttggtt240ctgagagggaaaccagaggatgtgcttccacaagtgttcaaggactggcaggtagatgag300ctttgctatgaggtggataccgagccctacgctgttttgagggatgcacatgtgagcagc360cttgctaaagcagccaacgttgaagtgaagtcgtttgtcagtcacacactatacgatact420gccgacattgttgagaggaacgggggaaagccaccactcacctaccagtccttcattaag480ctggttgacaagatgggagaccctacagcacctgcacctgatcccccagagaagatgccc540ccgcccagggatgatcttccgggtgcagccccccaggagacatcggtcccaactttgaag600gagataggctatgaccaagagcccactgcgcccttcaagggaggagagagagaagcactg660gctcgcatggatacctacctttcggacaagctgtgggtggcaaactttgagaagcctcag720acagacccaagcgcctttgaaaagcctgcgaccaccactctgtcaccgtacctaaagttt780ggatgcctctctccccggctcttccacactagactgctacagatatacaaggagcagaag840aagcactcagagcccccggtgtccttaaggggccaactgctgtggagagagttcttctac900acggtgggtgcccacactcccaacttcagccacatggtaggcaacaccgtgtgccgccaa960atagactggagacaccaggacgcggcaacagctgattctgaggcggagcagcatcttgcg1020gcatggaaggctggccgcactggcttcccctggattgatgccatcatgacacagctgcat1080gagtggggttggattcatcacttggctcgtcactcggtggcatgcttcctcacaagaggg1140gacttgtacatctcatgggagcgaggccaggaggtgtttgaggagctgttgctggaccag1200gaccacttcatcaatgctgggaactggatgtggctctccgcatctgctttcttctcgcag1260tacttcagggtgtacagcccagttgtttttgggaagaagtacgaccctgagggaaagtac1320attcgcaagttcttgcctgtgctcaaggacatgccagccaagtacatctacgagccatgg1380ctcgccccgactgaggtccagaagaaagccaagtgcatcatcggggtggactacccgcgt1440cccatagtcgatcacagcattgccagcaagcagaacattgggcgcatggctgcagcttac1500aaggcgaacaagggggaaggagaaggggaggccgctgatactcctaagaaggccgccaaa1560cccaggaaagctgccgcacccaaagctgcaaagaaggaggcgacagatgttgtttctggg1620aagggggcgaagcggcagcggacgatgaaagagtttgcaagcaagaaggagacagagtga1680<210>2<211>559<212>prt<213>南極冰藻<400>2metalaservalthrglylysalalysilevaltrpphearglysgly151015leuargleuhisaspasnproalaleuileglualacysargglyala202530alahisvaltyrproilepheileleuaspprohispheargserala354045glytyrlysvalglyvalasnargphelyspheleumetglnserleu505560thraspleuasnaspserpheglualaargglyserargleuleuval65707580leuargglylysprogluaspvalleuproglnvalphelysasptrp859095glnvalaspgluleucystyrgluvalaspthrgluprotyralaval100105110leuargaspalahisvalserserleualalysalaalaasnvalglu115120125vallysserphevalserhisthrleutyraspthralaaspileval130135140gluargasnglyglylysproproleuthrtyrglnserpheilelys145150155160leuvalasplysmetglyaspprothralaproalaproasppropro165170175glulysmetproproproargaspaspleuproglyalaalaprogln180185190gluthrservalprothrleulysgluileglytyraspglnglupro195200205thralaprophelysglyglygluargglualaleualaargmetasp210215220thrtyrleuserasplysleutrpvalalaasnpheglulysprogln225230235240thraspproseralapheglulysproalathrthrthrleuserpro245250255tyrleulyspheglycysleuserproargleuphehisthrargleu260265270leuglniletyrlysgluglnlyslyshissergluproprovalser275280285leuargglyglnleuleutrparggluphephetyrthrvalglyala290295300histhrproasnpheserhismetvalglyasnthrvalcysarggln305310315320ileasptrparghisglnaspalaalathralaaspserglualaglu325330335glnhisleualaalatrplysalaglyargthrglypheprotrpile340345350aspalailemetthrglnleuhisglutrpglytrpilehishisleu355360365alaarghisservalalacyspheleuthrargglyaspleutyrile370375380sertrpgluargglyglngluvalpheglugluleuleuleuaspgln385390395400asphispheileasnalaglyasntrpmettrpleuseralaserala405410415phepheserglntyrpheargvaltyrserprovalvalpheglylys420425430lystyraspprogluglylystyrilearglyspheleuprovalleu435440445lysaspmetproalalystyriletyrgluprotrpleualaprothr450455460gluvalglnlyslysalalyscysileileglyvalasptyrproarg465470475480proilevalasphisserilealaserlysglnasnileglyargmet485490495alaalaalatyrlysalaasnlysglygluglygluglyglualaala500505510aspthrprolyslysalaalalysproarglysalaalaalaprolys515520525alaalalyslysglualathraspvalvalserglylysglyalalys530535540argglnargthrmetlysgluphealaserlyslysgluthrglu545550555<210>3<211>28<212>dna<213>人工序列<400>3gtggggttggattcatcacttggctcgt28<210>4<211>28<212>dna<213>人工序列<400>4ggattcatcacttggctcgtcactcggt28<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5atggcttctgtgaccggcaa20<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6tcactctgtctccttcttgctt22當前第1頁12