一種來源于宏基因組的低溫酯酶、編碼基因及其應用的制作方法

本發明涉及生物技術和生物工程領域，具體涉及一種來源于土壤宏基因組的低溫酯酶est18及其編碼基因和應用。

背景技術：

酯酶廣泛存在于動物、植物及微生物中，是一類催化水解或形成酯鍵的酶，作用的底物通常是脂肪鏈小于十個碳原子的酯類。酯酶屬于α/β折疊水解酶超家族，催化中心一般由絲氨酸、天冬氨酸/谷氨酸和組氨酸組成，保守序列為絲氨酸附近的五肽(gxsxg)序列。酯酶能催化水解、酯化、轉酯化等多種化學反應，是一種很重要的工業生物催化劑，被廣泛運用于精細化工、洗滌、醫藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、廢水處理和飼料工業等領域。從催化特性來看，酯酶具有高度的化學選擇性和立體異構選擇性，且反應不需要輔酶、反應條件溫和、副產物少。在生產應用中的酯酶的另一顯著特點是它能在異相系統（即油-水界面）或有機相中作用。在水相中，酯酶通常催化水解反應，而在有機相中，它卻能催化酯化和轉酯化反應。

宏基因組，又稱元基因組，是指生境中全部微小生物遺傳物質的總和。因為宏基因組技術是將直接提取的環境微生物基因組dna克隆于不同的載體并轉入合適的宿主，通過不同的篩選技術篩選并獲得新基因或生物活性類物質，所以該技術實際上繞過了微生物培養環節，能夠更好地開發和利用未培養微生物資源，為工業、農業或各方面提供了更廣闊的基因庫。目前，越來越多的專利酶類是來自于宏基因組文庫，它們可適用于食品、化工、醫藥等領域。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種來源于泰山土壤宏基因組的新的低溫堿性酯酶est18、編碼基因及其制備方法，該酯酶可用于酯鍵的水解，尤其是短鏈酯類的水解。

本發明從泰山土壤宏基因組文庫中，通過特異性底物三丁酸甘油酯利用功能篩選方法(function-drivenscreening)從中篩選到一株表現出酯酶活性的菌株ts-est18，利用生物信息學分析方法，分析得到一個酯酶基因est18。該基因全長為957bp（從起始密碼子到終止密碼子），編碼318個氨基酸。通過pcr的方法，將克隆得到酯酶基因est18與表達載體pet-30b(+)連接后得到重組質粒pest18，經大腸桿菌bl21(de3)plys誘導表達后，得到了重組酯酶est18。est18是低溫堿性酯酶，在溫度40℃以下時相對穩定，最適溫度20℃，在ph6-11范圍內穩定，最適ph為8，ph11時的最大活性>80％。包含該基因的重組菌株保藏在位于武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccm2017317，菌株分類為escherichiacoli。

本發明的第一個目的是提供一種編碼所述的酯酶est18的酯酶基因est18，所述的酯酶基因est18的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本發明的第二個目的是提供一種酯酶est18，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

本發明還提供一種含有所述的酯酶基因est18的重組表達載體。所述的表達載體，優選pet-30b(+)載體。

本發明還提供一種含有所述的酯酶基因est18的基因工程菌。所述的基因工程菌，優選大腸桿菌escherichiacolibl21(de3)plys。

本發明的第三個目的是提供一種制備低溫堿性酯酶est18的方法，包括以下步驟：

1)用上述重組載體轉化宿主細胞escherichiacolibl21(de3)plys。，得重組菌株；

2)培養重組菌株，誘導重組酯酶表達；

3)回收并純化所表達的酯酶est18。

本發明所述低溫堿性酯酶est18來自泰山土壤宏基因組（宿主菌未知），其氨基酸序列如seqidno.2所示：

mstldpklfsdkaiapetravndaiiaamtgmpewwdvgaaktraarargegifpaaakserarwieidgpagkvplrviapenprgvylhihggghvlgaadqqdrllerisnetrltaisveyrlapenpypagpddceaaalwvnehaadfgghkiaiggesagahlsaltilrlrdkhgltpfnaanlvfgvfdlgmtpsarafgderlvlrtrdiekfgeaflpgtddeqkrapefsplyanlaglcpalftigtrdallddslfmharwvaagnvgeldiypggchgfiafpypqafasiarqatflnaalg

本發明還提供上述的低溫堿性酯酶est18在催化酯類水解、酯化或轉酯化反應中的應用。優選的短鏈脂肪酸酯為具有c2-c8短碳鏈的對硝基苯酚酯，例如對硝基苯乙酸酯、對硝基苯丁酸酯，對硝基苯辛酸酯等，其中底物為對硝基苯丁酸酯（c4）時催化活性最高。

酯酶est18為一種低溫堿性酯酶，共含有318個氨基酸，在20-45℃間的酶活力達80%以上，溫度大于50℃時酶活性急劇下降。最適ph為8.0，在ph11的緩沖液中保溫20min仍然保存80%以上的酶活，在ph值7-11之間有較高酶活性，優選為7.0~9.0。1mm的cu²⁺、fe²⁺和zn²⁺對est18的酶活產生強烈的抑制作用，而ca²⁺，mg²⁺，ni²⁺和co²⁺，以及金屬螯合劑edta均對酶活有增強作用。

本發明從泰山土壤宏基因組文庫中篩選得到新的酯酶基因，發現該基因編碼的蛋白在20℃時穩定高效，50℃時迅速失活（便于酶促反應控制），同時在堿性環境中表現出較高穩定性和活性。因此本發明的低溫堿性酯酶可在食品、化工、洗滌、制藥等工業中應用，以降低生產溫度減少能耗。

附圖說明

圖1：在e.coli中表達的重組酯酶est18的sds-page分析。泳道m為蛋白質marker，泳道a為酯酶est18誘導前的可溶性組分，泳道b為酯酶est18誘導后的可溶性組分，泳道c為酯酶est18純化后的蛋白。

圖2：重組酯酶est18最適反應ph。

圖3：重組酯酶est18最適反應溫度。

圖4：重組酯酶est18的熱穩定性。

圖5：二價陽離子對酯酶est18活性影響。

圖6：有機溶劑、變性劑和螯和劑對est18活性影響。

具體實施方式

實施例1：酯酶基因est18的獲取

以三丁酸甘油酯為底物從泰山土壤宏基因組文庫中篩選并純化得到表現出酯酶活性的菌株ts-est18。提取ts-est18的質粒dna，經亞克隆測序得到插入片段的序列信息。利用生物信息學方法對基因信息進行注釋，分析并確定了其中酯酶基因的開放閱讀框（openreadingframe,orf），將該orf命名為est18，其基因序列如seqidno.1所示，全長為957bp（atg起始，tag終止），其編碼的酯酶est18的氨基酸序列如seqidno.2所示，共318個氨基酸。

實施例2：酯酶基因est18的克隆、重組載體及重組菌株的構建

將本發明獲得的酯酶基因est18克隆到表達載體上，構建重組表達載體。根據分析得到的酯酶基因序列，利用primer5軟件設計擴增酯酶全基因的上游引物forwards（5’-ccaagctttccggtttttgacgaagcgc，bamhi）和下游引物reverse（5’-cgggatccgagcgcgatccgcaaactag，hindiii）。使用以下pcr擴增程序擴增酯酶基因est18：94℃預變性3min；94℃變性1min，復性溫度56℃1min，72℃延伸1min，進行25個循環；循環結束后72℃延伸10min，4℃10min，擴增目的片段的長度約為1kb。純化后的pcr產物經bamhi和hindiii雙酶切，割膠回收后與bamhi和hindiii雙酶切的質粒pet-30b(+)連接，轉化大腸桿菌dh5α，通過卡那霉素抗性及三丁酸甘油酯活性篩選得到陽性克隆。抽提陽性克隆的質粒得到重組載體pest18，經雙酶切及測序鑒定插入片段同seqidno.1。包含重組載體pest18的大腸桿菌escherichiacolidh5α菌株保藏在位于武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccm2017317，保藏日期為2017年6月8日。

實施例3：表達酯酶est18的基因工程菌的構建

3.1大腸桿菌bl21(de3)plys感受態細胞制備

1.將少量大腸桿菌bl21(de3)plys菌種接入3mllb試管液中，200rpm、37℃過夜培養；

2.按1%體積比的接種量將試管中的菌液接種到200mllb搖瓶中，200rpm、20℃過夜培養；

3.將培養好的搖瓶在冰水中迅速冷卻至4℃，分裝至冰預冷的離心管(50ml)，冰浴數分鐘；

4.4℃、4000rpm離心10min回收細胞，棄上清；

5.用冰預冷的10ml0.1m的cacl2重懸細胞，4℃4000rpm離心10～15min回收細胞；

6.重復5，用10ml0.1m的cacl2重懸細胞，冰浴30min以上；

7.4℃，4000rpm離心10min回收細胞；

8.每50ml原培養物用1ml的0.1mcacl2重懸后，在加入1ml50%的甘油混勻后，分裝于1.5ml離心管，50～100μl每管。-80℃保藏。由此得到大腸桿菌bl21(de3)plys感受態細胞。

3.2轉化

取實施例2中得到的pest18質粒0.5～1μl與50μl大腸桿菌bl21(de3)plys感受態細胞混合，冰浴30min，于42℃水浴鍋熱激90s，冰浴2min后加入500μllb液體培養基，37℃200rpm培養45min。培養物離心后涂布于含有50μg/ml的卡那霉素的lb平板，由此得到含有pest18的大腸桿菌bl21(de3)plys。

實施例4：酯酶est18的表達和純化

4.1蛋白誘導表達

含有pest18的大腸桿菌bl21(de3)plys在200ml的lb培養基中37℃培養至od600為0.4-0.6時，加iptg至終濃度0.2mm，20℃培養過夜。每50ml菌液4000rpm、4℃離心10min，收集菌體，并2ml(20mm，ph7.4)pbs緩沖液（kh2po4-k2hpo4）重懸菌體，超聲波破碎15min分鐘，離心，收集上清。

4.2酯酶est18的純化與sds-page電泳

用his親和層析柱純化4.1中收集的上清，具體實施方案如下：

1.his親和層析柱的ni²⁺結合和bindingbuffer（20mmpbs緩沖液，5mm咪唑和500mmnacl并用0.22μm過濾器過濾）的平衡。加入（0.5倍柱體積）0.1mniso4溶液進行ni²⁺的相應結合，填充完后，加入dh2o（已用0.22μm過濾器過濾）洗滌未結合的ni²⁺，再用5倍柱體積的bindingbuffer進行平衡。

2.酯酶est18蛋白的純化。平衡后上樣，樣品為4.1中收集的上清（上清中的鹽濃度和咪唑濃度與bindingbuffer相同）10ml，以5倍柱體積的bindingbuffer洗去未結合（雜蛋白）蛋白。然后洗脫，洗脫體積為20ml（在這20ml內，elutionbuffer（20mmpbs緩沖液，500mm咪唑和500mmnacl并用0.22μm過濾器過濾）和bindingbuffer在該步驟進行混合，elutionbuffer比例逐漸增大，使咪唑濃度從5mm勻速增加到500mm）；最后再用5倍體積elutionbuffer完全洗脫，收集蛋白峰(1ml/tube)。

3.檢驗收集的蛋白洗脫液的酯酶活性。在含有三丁酸甘油酯的lb培養皿底部劃上小方格，然后對每個格進行標號，將收集的洗脫液各取10μl，然后根據序號加入相應的小格子內，置于37℃培養箱內正放培養3h左右即可觀察到結果（含有酯酶est18蛋白的洗脫液會有水解圈）。

4.對收集的洗脫液進行脫鹽和濃縮。用超濾管（默克密理博merckmillipore）進行脫鹽和濃縮，具體操作方法參照默克密理博merckmillipore公司的操作手冊進行。

5.酯酶est18的sds-page電泳。將純化的酯酶進行sds-page凝膠電泳（圖1），得到純化的酯酶est18，純化的蛋白大小約37kda，符合理論預期。

4.3酯酶est18活性測定

酯酶est18活力測定采用對硝基苯酚酯，具體方法如下：

1用二甲基亞砜（dmso）配制200mm的對硝基苯酚酯；

2在1ml反應體系中加980μl50mmtris-hclbuffer（100mmnacl，50mmtris-hcl，0.3%（v/v）tritonx-100，ph8.0），10μl對硝基苯酚酯，10μl純酶液（稀釋100倍后的濃度0.012276μg/μl）；

3使用分光光度計在400nm吸光度下檢測游離的對硝基苯酚的含量，在該條件下測定對硝基苯酚含量的消光系數為16,642m^-1cm^-1（即ε=16,642m^-1cm^-1）。酶活性單位的定義是在標準條件下（25℃，101.325kpa）每分鐘生成1μmol對硝基苯酚所需的酶量。

實施例5：酯酶est18的底物特異性分析

按照4.3的測定條件，比較酯酶est18水解不同長度酰基的對硝基苯酚酯的活性。底物采用對硝基苯乙酸酯（c2）、對硝基苯丁酸酯（c4），對硝基苯辛酸酯（c8）。結果表明，est18對酰基碳鏈較短的對硝基苯酚酯具有催化活性，其中底物為對硝基苯酚丁酸酯（c4）時催化活性最高。

實施例6：酯酶est18的最適反應條件分析

酯酶est18的最適反應ph在4.0~11.0范圍內測定。配制不同的緩沖溶液，其中hac-naac緩沖液ph為4.0-6.0，k2hpo3-kh2po3緩沖液ph為6.0-8.0，h3bo3-na2b4o7緩沖液ph為7.4-9.0，na2co3-nahco3緩沖液ph為9.0-11.0。這些不同ph的緩沖溶液濃度均為50mm。將4.3中測定條件所述的緩沖液(tris-hclbuffer)用配制的緩沖溶液分別進行替換，測定重組酯酶est18的酶活力，底物為對硝基苯酚丁酸酯。ph對重組酯酶est18活性的影響結果見圖3。在50mm的h3bo3-na2b4o7緩沖液ph8.0時，酯酶est18的酶活性最高，ph值在7.0–11.0之間有較高的酶活性。當ph低于7.0時，其活性迅速降低（圖2）

酯酶est18的最適反應溫度在20~70℃范圍內測定。使用4.3中測定條件所述的50mm緩沖液(tris-hclbuffer)ph8.0作為緩沖液，對硝基苯酚丁酸酯作為底物，按照4.3中的反應體系，在不同溫度下測定酶活。結果表明，est18為低溫酶，溫度越低反應速度越高，在20-45℃間的酶活力達80%以上，溫度大于50℃時酶活性急劇下降（圖3）。

實施例7：酯酶est18酶學穩定性分析

酯酶est18的熱穩定性在20~50℃范圍內測定。將純化后的酶液分別保溫在20、30、40、45和50℃下，間隔一定時間取出按4.3所示檢測方法測定酶活性，結果見圖4。酯酶est18隨著處理溫度的升高，酯酶殘余酶活力逐漸下降，當溫度高于50℃時酶活性急劇降低，在50℃處理5min后，殘余酶活力基本喪失（圖4）。

二價陽離子酯酶est18活性影響的測定。在反應體系中分別加入1mm的fe²⁺、zn²⁺、cu²⁺、mn²⁺、ca²⁺、mg²⁺、ni²⁺和co²⁺，在室溫下孵育20min，按4.3測定方法（以對硝基苯酚丁酸酯作為底物）測定相對酶活，以未添加任何離子的反應體系中的酶活力為100%。結果表明，與對照相比，低濃度的fe²⁺、zn²⁺和cu²⁺對酯酶催化對硝基苯酚丁酸酯的活力有不同程度的抑制作用。而mn²⁺對酯酶est18酶活力的影響很小，低濃度ca²⁺、mg²⁺、ni²⁺和co²⁺對酯酶est18酶活力有增強效果（圖5）。

有機溶劑和變性劑等對est18活性影響的測定。在反應體系中分別加入15%（v/v）和30%（v/v）有機溶劑（甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮和二甲基亞砜dmso）、1%變性劑（十二烷基硫酸鈉sds、吐溫20）及螯合劑（10%edta）孵育20min后，按4.3測定方法（以對硝基苯酚丁酸酯作為底物）測定相對酶活，以原始反應體系中的酶活力為100%。結果表明，所測有機溶劑對est18的活性有不同程度的抑制，且隨著有機溶劑濃度的增大，抑制程度增強。變性劑對酶活的抑制是非常強烈的，加入1%的sds孵育20min后僅剩下0.14%的活性。但是est18在螯合劑edta（122%）存在下酶活性有較大的增加（圖6）。

sequencelisting

<110>武漢輕工大學

<120>一種來源于宏基因組的低溫酯酶、編碼基因及其應用

<160>2

<210>seqidno.1

<211>957

<212>dna

<213>environmentaldna

<400>seqidno.1

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gtgaacgatgccattatcgccgcgatgaccggcatgcctgaatggtgggatgtcggcgcg120

gccaagacgcgcgcggcgcgcgccaggggcgaaggcattttcccagcggcggcgaaatcc180

gaacgcgcgcgctggatcgagatagatgggcccgccggcaaggtgccgttgcgcgtcatc240

gcgccggaaaatccgcgcggcgtatatctgcacattcacggcggcggccacgtgttgggc300

gccgcggatcaacaggatcggttgctcgagcgcatctcaaacgaaaccaggctgacggcg360

atcagcgttgagtatcgcttggcgccggaaaatccctatcccgctgggcccgacgattgt420

gaagcggcggcgctttgggtgaacgagcatgcggcggattttggcggccacaagattgcc480

atcggcggcgaaagcgcgggcgcgcacctgtcagcgctgactattctgcgcttgcgcgac540

aagcatgggctgacgcccttcaatgcggcgaaccttgtgttcggcgttttcgatttggga600

atgacgccaagtgcgcgcgcgtttggcgatgagcggctggtcttgcgcacgcgcgacatc660

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ttctcgccgctctacgcgaacctcgccggcttgtgccccgcgctcttcaccatcggcacg780

cgcgatgcgctcctggacgacagtctcttcatgcacgcgcgctgggtggcggcgggaaat840

gtcggcgaactcgacatctatccgggcggctgtcatggcttcatcgccttcccgtacccg900

caggcgttcgcgtcgatcgcgcgccaagccacgtttttgaacgcggccctgggttag957

<210>seqidno.2

<211>318

<212>prt

<213>environmentaldna

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metserthrleuaspprolysleupheserasplysalailealapro

151015

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proglutrptrpaspvalglyalaalalysthrargalaalaargala

354045

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