微小rna病毒蛋白的增強表達的制作方法
【專利說明】微小RNA病毒蛋白的増強表達
[0001] 對相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請流水號61/790, 114的優先權。 其內容在此完整并入用于所有目的。
[0003] 對序列表的交叉引用
[0004] 本申請通過提及并入2013年3月14日創建的名稱為"N0VV_52_SeqList. txt"的 24kb序列表的內容。
[0005] 發明背景
[0006] 人和動物患有由病原體（如細菌、真菌和病毒）引起的疾病和病癥。使用疫苗來 誘導針對病原體感染的免疫是本領域中公知的。在歷史上已經使用多種方法來制備疫苗， 包括殺死的病毒和活減毒疫苗。然而，殺死的病毒和活減毒病毒可以與不利效應有關，在一 些情況中，殺死的病毒不是有效的或者實際上可以惡化疾病。
[0007] 疫苗生產的效率也可以是商業生存能力的障礙。在一些情況中，如生產疫苗前需 要的長訂購前置時間（lead time)以及在其它情況中在滅活前制備活病毒可以導致疾病和 病癥。例如，口蹄疫病毒（FMDV)是細小RNA病毒科（Picornaviridae)內的原型口蹄疫病 毒屬（aphthovirus)。口蹄疫爆發的經濟損失是所有家畜疾病的最高者之一，并且廣泛的 疫苗接種是疾病控制的優選方法。目前的疫苗是殺死的全病毒疫苗，其具有公認的限制，如 通過在滅菌前培養活病毒、一些毒株的不良生長、和貯存后免疫原性降低造成的那些。參見 Porta 等，'，Efficient production of foot-and-mouth disease virus empty capsids in insect cells following down regulation of 3C protease activity,'，J Virol Methods. 2013Feb ; 187 (2):406-12.)。
[0008] 在最近幾年中，使用重組技術來生成亞基疫苗已經特別有吸引力。然而，雖然重組 方法克服了關于生產活疫苗的問題并且提供了快速合成的潛力，但是生產合適量的免疫原 出于多種原因可以是挑戰性的。
[0009] 發明概述
[0010] 本公開內容提供了含有與多肽融合的N-端信號肽的融合蛋白。本公開內容還提 供了通過使用N-端信號肽增強多肽生產的方法，特別是在蛋白質既不是分泌性蛋白質又 不是跨膜蛋白質的情況下。可以使用融合蛋白來診斷疾病并且誘導免疫應答。在一些方面， 多肽是免疫原性的。免疫原性多肽可以來自病毒、細菌或真菌。
[0011] 附圖簡述
[0012] 圖1顯示了含有FMDV Pl蛋白（顯示為"vpl-4"）（其是未切割的前體多蛋白，其按 次序具有 vp〇-vp3-Vpl，Vp〇 含有 Vp4 和 vp2)的 BV1168(編碼 SEQ ID N0:4)和 BV 1169(編 碼SEQ ID NO: 1)的質粒圖。序列是相同的，只是BV1169含有來自甲型/印尼/5/05流感 病毒的血凝素信號肽。
[0013] 圖2A-2D顯示了與在缺乏信號肽的情況下表達的相同多肽相比在使用HA信號肽 時獲得的增強的表達。制備質粒，如圖1中描繪。BV1168含有具有六組氨酸標簽（His6) 的FMDV Pl蛋白。BV1169含有FMDV Pl蛋白，其具有六組氨酸標簽（His6)以及還有來自 甲型/印尼/5/05 HA的N-端信號肽（SEQ ID N0:3)。在Sf9細胞中表達質粒，并且通過 SDS-PAGE和Western印跡分析。各道如下：M-標志物。第1-3道顯示了自BV1168表達的 FMDV Pl蛋白，具有六組氨酸標簽，沒有信號肽。第4-6道顯示了自BV1169表達的FMDV Pl 蛋白，具有六組氨酸標簽和信號肽。第7道顯示了 BV266對照，并且第8道顯示了 BV 1064 S300 Fxn。根據SDS-PAGE中的總蛋白質染色，圖2A在第4-6道中顯示了增強的表達。圖 28-0在第4-6道中顯示了通過抗組氨酸抗體（圖28;"抗!113 1&113")，抗？1?￥叩2抗體（圖 2C ;"F1412SA Mab"）及通過抗 FMDV vpl 抗體（圖 2D ;"12FE9. 2. IA Mab"）檢測的增強的 表達。
[0014] 圖3顯示了個別非分泌性蛋白質的增強的表達，其通過在有信號肽的情況下表達 它們而實現。用表達具有和沒有信號肽的重組蛋白的桿狀病毒感染Sf9細胞。在感染后70 小時收獲細胞。通過使用對重組蛋白特異性的單克隆抗體的Western印跡分析收獲的粗制 材料（即細胞和培養基）。圖面（a)，左圖面顯示了 FMDV vpO的表達。圖面（b)，右圖面顯 示了 FMDV vpl蛋白的表達。" + "重組蛋白含有信號肽，重組蛋白沒有信號肽。
[0015] 圖4A-4D顯示了本文中公開的序列。圖4A顯示了由BV1169質粒編碼的核苷酸序 列。表達的蛋白質是FMDV Pl前體多蛋白，其含有蛋白vpl至vp4(即vp〇-vp3-vpl ;vpO含 有vp2和vp4二者），以及在N端的HA信號肽和在C端的His6標簽。圖4B顯示了由BV1169 表達的肽序列。表達的蛋白質是FMDV Pl蛋白，其含有蛋白vpl至vp4,以及在N端的HA信 號肽和 C 端的 His6-標簽。信號肽（MEKIVLLLAIVSLVK;SEQ ID N0:3)來自 Indo H5N1 HA。 圖4C和4D分別顯示了由BV1168質粒編碼的核苷酸和肽序列。編碼的序列與BV1169相同， 只是BVl 168缺乏HA信號肽。
[0016] 圖5A-C顯示了單一蛋白質和串聯的蛋白質的表達。用表達具有（+)或沒有（-)信 號肽的蛋白質1、2、3、和/或4的重組桿狀病毒（BV)感染Sf9細胞，并且在感染后約65小 時收獲。收獲粗制樣品（即細胞和培養基），并且通過SDS-PAGE和Western印跡分析。表 達的重組蛋白以點標示。BVl表達FMDV vpl。BV2表達FMDV vpO vp3。BV3表達FMDV vpl、 vpO和vp3。BV4表達FMDV Pl多蛋白（即vp〇-vp3-vpl)。圖5A顯示了總蛋白質染色。圖 5B和5C分別顯示了 vpl和vp2抗體的結合。注意vpO蛋白含有vp2蛋白和vp4蛋白。BV2 與vpl抗體的反應是由于與vpO的交叉反應。還獲得了用FMDV蛋白酶3C的增強表達（未 顯示）。" + "重組蛋白含有信號肽，重組蛋白沒有信號肽。
[0017] 發明詳述
[0018] 定義
[0019] 如本文中使用，術語"桿狀病毒"又稱為桿狀病毒科（baculoviridae)，指節肢 動物的有包膜DNA病毒科，其成員可以用作表達載體以在昆蟲細胞培養物中生成重組 蛋白。病毒粒含有一個或多個桿形狀的核殼，其含有環狀超螺旋雙鏈DNA的分子（Mw 54X 106-154X IO6)。用作載體的病毒一般是苜蓿銀紋夜蛾（Autographa californica)核 多角體病毒（NVP)。導入的基因的表達通常在強啟動子的控制下，所述強啟動子通常調節大 核內包含體的多面體蛋白組分的表達，其中病毒包埋于受感染的細胞中。
[0020] 如本文中使用，術語"源自"指蛋白質、核酸或其它分子的起源或來源。蛋白質、核 酸和其它分子可以從如本文所述的來源改變。在一些方面，改變包括刪除全長序列的殘基 或核苷酸。在其它方面，改變包括從野生型序列的保守突變。
[0021] 如本文中使用，術語"疫苗"指含有用于誘導針對免疫原的免疫應答以提供保護性 免疫應答（即，降低由病原體引起的疾病或病癥的嚴重性的免疫應答）的免疫原的制備物。 保護性免疫應答可以包括抗體形成和/或細胞介導的應答。優選地，疫苗誘導中和性抗體 的生成。根據上下文，術語"疫苗"也可以指對受試者施用以產生保護性免疫的免疫原的懸 浮液或溶液。
[0022] 如本文中使用，術語"VLP"意指病毒樣顆粒。
[0023] 如本文中使用，術語"約"意指指示數值的±10%。
[0024] 如本文中使用，術語"佐劑"指與針對在沒有佐劑的情況下施用的免疫原的免疫應 答相比，在與免疫原組合使用時修飾針對免疫原誘導的免疫應答的化合物。
[0025] 如本文中使用，"有效劑量"指足以誘導免疫應答的免疫原的量，所述免疫應答降 低由細菌毒素誘導的疾病或病癥的至少一種癥狀，從而施用的劑量在治療或管理細菌性感 染中提供治療益處。有效劑量可以例如通過測量中和性分泌性和/或血清抗體的量來測 定，例如通過斑中和、補體固定、酶聯免疫吸附（ELISA)、或者微量中和測定法。
[0026] 如本文中使用，術語"實質性保護性抗體應答"指包括阻斷細菌毒素進入細胞的抗 體（例如中和性抗體）生成的免疫應答。
[0027] 如本文中使用，術語"免疫原"或"抗原"指能夠引發免疫應答的物質，如蛋白質和 肽。例如，在一些方面，免疫原是免疫原性多肽。
[0028] 如本文中使用，術語"分離的"指不在受試者中的物質，如核酸、蛋白質、VLP等。
[0029] 如本文中使用，術語"受試者"或"患者"指脊索動物亞門（subphylum cordata)的 任何成員，