本發明涉及生物工程領域，尤其是涉及一種提高昆蟲細胞瞬時轉染和穩定表達蛋白表達量的方法。
背景技術：
：：昆蟲細胞表達系統已被用于包括組織因子和抗體等在內的許多人類重組蛋白的表達(kost等，1997)。目前，昆蟲表達系統主要用于表達亞單位疫苗，除了獸用疫苗還用于生產部分人類疫苗以及重組病毒(maranga等，2002；ryan和walsh等，2012；yang等，2013；miller等，2012)。果蠅s2(drosophilaschneider2)細胞和草地貪夜蛾sf9(spodopterafrugiperda)細胞是常用于異源基因表達的昆蟲細胞，可通過構建穩定細胞池的方法進行重組蛋白表達。近年來昆蟲細胞已成功用于表達一些具有生物活性的受體蛋白、離子通道蛋白、細胞骨架蛋白、轉錄因子、激素和凝血因子等(millar等，1995；millar等1994；tota等1995；towers和sattelle等2002；mennella等，2005；winslow等，1989；change等，2005；zmora等，2007；vatandoost等，2012)。但穩定細胞池每升的產量也只能達到幾毫克，且尚未有發現簡單可行的提高產量方法。瞬時轉染在哺乳動物中用于重組蛋白的快速表達的工藝已非常完善，近年來也逐漸應用到昆蟲表達系統中(geisse等，2009；hopkins等，2012；loomis等，2005；shen等2013)。昆蟲細胞的瞬時轉染常用于構建穩定細胞池之前對表達載體的檢驗(vatandoost等，2012)。近年來，s2、sf9等細胞的瞬時轉染開始采用低成本的陽離子聚合物轉染試劑，如聚乙烯亞胺，也可在短時間內獲得重組蛋白，但其產量也亟待提高。技術實現要素：基于此，有必要提供一種提高昆蟲細胞瞬時轉染和穩定表達蛋白表達量的方法。一種提高昆蟲細胞瞬時轉染和穩定表達蛋白表達量的方法，包括如下步驟：配制轉染試劑溶液：將線性聚乙烯亞胺溶于ph3-10的無菌水中，配制成濃度為0.1-10g/ml的轉染試劑溶液；配制轉染復合物：按照線性聚乙烯亞胺與待轉染的含目的dna的質粒的質量比為1-20:1的比例將所述轉染試劑溶液與待轉染的含目的dna的質粒溶液加入無菌水中，震蕩混勻，形成轉染復合物；瞬時轉染：將所述轉染復合物加入已傳代培養的果蠅s2細胞或草地貪夜蛾sf9細胞的細胞懸液中，搖晃培養，得到已轉染含目的dna的質粒的昆蟲細胞，將所述昆蟲細胞于16-40℃、120-300rpm、2％-10％co2培養箱中搖晃培養，或者于16-40℃、120-300rpm培養箱中以密封蓋封住密封培養；穩定細胞池蛋白表達：以所述瞬時轉染構建的所述昆蟲細胞構建穩定細胞池，以1-8×106個昆蟲細胞/ml的密度接種后，于16-40℃、120-300rpm、2％-10％co2培養箱中搖晃培養，或者于16-40℃、120-300rpm培養箱中以密封蓋封住密封培養。在其中一個實施例中，昆蟲細胞或穩定細胞池的培養溫度優選20-32℃，更優選25-29℃。在其中一個實施例中，所述線性聚乙烯亞胺的分子量范圍為2.5-40kd，優選25kd。在其中一個實施例中，在所述配制轉染試劑溶液過程中，所述無菌水的ph為5.0-7.0，優選ph為6.1。在其中一個實施例中，在所述配制轉染試劑溶液過程中，配制的轉染試劑溶液中線性聚乙烯亞胺的濃度為0.1-2g/ml，優選1g/ml。在其中一個實施例中，在所述配制轉染復合物過程中，對于果蠅s2細胞是按照線性聚乙烯亞胺與待轉染的含目的dna的質粒的質量比為2:1的比例配制；對于草地貪夜蛾sf9細胞是按照線性聚乙烯亞胺與待轉染的含目的dna的質粒的質量比為3:1的比例配制。在其中一個實施例中，在所述瞬時轉染過程中，將所述轉染復合物加入已傳代培養的果蠅s2細胞或草地貪夜蛾sf9細胞的細胞懸液中是按照每106個細胞轉染0.1-3μg含目的dna的質粒的比例添加。在其中一個實施例中，在所述瞬時轉染過程中，對于果蠅s2細胞是按照每106個果蠅s2細胞轉染0.6μg含目的dna的質粒的比例添加，并于28℃、180rpm、5％co2培養箱中搖晃培養，或者于28℃、180rpm培養箱中以密封蓋封住密封培養，并在12-72小時，優選48小時后更換為透氣蓋子；對于草地貪夜蛾sf9細胞是按照每106個草地貪夜蛾sf9細胞轉染1.5μg含目的dna的質粒的比例添加，并于28℃、180rpm、5％co2培養箱中搖晃培養，或者于28℃、180rpm培養箱中以密封蓋封住密封培養，并在12-72小時，優選48小時后更換為透氣蓋子。在其中一個實施例中，在果蠅s2細胞或草地貪夜蛾sf9細胞傳代培養時，傳代細胞的密度為0.1-2×106個細胞/ml，優選1×106個細胞/ml。在其中一個實施例中，在所述瞬時轉染過程中，當傳代培養的細胞密度達到2-50×106個細胞/ml時，進行瞬時轉染，優選是達到5×106個細胞/ml時，進行瞬時轉染。在其中一個實施例中，在所述穩定細胞池蛋白表達過程中，以4×106個昆蟲細胞/ml的密度接種，于28℃、180rpm、5％co2培養箱中搖晃培養，或者于28℃、180rpm培養箱中以密封蓋封住密封培養，并在12-72小時，優選48小時后更換為透氣蓋子。傳統的在昆蟲細胞培養時多采用的是磷酸鹽緩沖系統，不同于哺乳動物細胞的碳酸鹽緩沖體系，其培養過程中無需添加co2來調節緩沖體系的ph，然而，目的蛋白的表達量比較低。本發明創造性的發現在昆蟲細胞培養時，無論是在瞬時轉染還是在穩定細胞池的蛋白表達生產過程中，在培養箱中添加co2或通過轉染后將透氣蓋子換成密封蓋以通過昆蟲細胞自身呼吸作用增加瓶中co2濃度的方法都可以提高蛋白的表達量，并且提升效果顯著。并且通過進一步研究發現，co2濃度對蛋白的表達量也是有一定影響的，co2濃度太低對蛋白表達量的提升幫助不大，但濃度過高也會影響蛋白的表達，因此，本發明選用濃度為2％-10％co2培養環境，或者在培養開始后就用密封蓋密封，一段時間后再打開或換用透氣蓋子，以保證培養環境中的co2的濃度滿足最大化促進蛋白表達的要求。本發明的在昆蟲細胞培養過程中在培養箱中添加co2或將培養瓶蓋子換成密封蓋簡單易行，成本低，是可以廣泛使用的并可顯著提高昆蟲細胞蛋白表達量的方法。附圖說明圖1為本發明一實施方式的工藝流程圖。圖2為在sf9的瞬時轉染中，與對照組轉染后在不含co2培養箱中培養相比，轉染后在5％co2培養箱中培養的egfp陽性細胞比例在轉染后1-5天都更高。圖3為在sf9的瞬時轉染中，與對照組轉染后在不含co2培養箱中培養相比，轉染后在5％co2培養箱中培養的sf9細胞tnfr-fc蛋白的單位產量在轉染后1-5天都更高。圖4為在s2細胞瞬時轉染中，在培養箱不添加co2的情況下，轉染后用密封蓋封住培養瓶可通過細胞自身的呼吸作用在培養瓶中積累更多co2，在轉染后培養箱不添加co2的情況下，與對照組轉染后使用透氣蓋子相比，轉染后分別封閉蓋子至24h、48h、72h后再換成透氣蓋子，s2細胞的蛋白1單位產量都更高，其中封閉蓋子至48h的最高。圖5為在s2細胞穩定細胞池的培養過程中，與對照組在不含co2培養箱中培養相比，在5％co2培養箱中培養和封閉蓋子培養s2細胞在第1天、3天、5天的蛋白1單位產量都更高，其中在第5天在5％co2培養箱中培養的蛋白1單位產量顯著高于對照組和用密封蓋密封培養組。圖6為在s2細胞穩定細胞池的培養過程中，與對照組在不含co2培養箱中培養相比，在5％co2培養箱中培養和用密封蓋密封培養s2細胞在第1天、3天、5天的蛋白2單位產量都更高。具體實施方式為了便于理解本發明，下面將參照相關附圖對本發明進行更全面的描述。附圖中給出了本發明的較佳實施例。但是，本發明可以以許多不同的形式來實現，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發明的公開內容的理解更加透徹全面。如圖1所示，一實施方式的提高昆蟲細胞瞬時轉染和穩定表達蛋白表達量的方法，包括如下步驟：配制轉染試劑溶液：將線性聚乙烯亞胺溶于ph3-10的無菌水中，配制成濃度為0.1-10g/ml的轉染試劑溶液；配制轉染復合物：按照線性聚乙烯亞胺與待轉染的含目的dna的質粒的質量比為1-20:1的比例將轉染試劑溶液與待轉染的含目的dna的質粒溶液加入無菌水中，震蕩混勻，形成轉染復合物；瞬時轉染：將轉染復合物加入已傳代培養的果蠅s2細胞或草地貪夜蛾sf9細胞的細胞懸液中，搖晃培養，得到已轉染含目的dna的質粒的昆蟲細胞，將昆蟲細胞于16-40℃、120-300rpm、2％-10％co2培養箱中搖晃培養，或者于16-40℃、120-300rpm培養箱中以密封蓋封住密封培養；穩定細胞池蛋白表達：以瞬時轉染構建的昆蟲細胞構建穩定細胞池，以1-8×106個昆蟲細胞/ml的密度接種后，于16-40℃、120-300rpm、2％-10％co2培養箱中搖晃培養，或者于16-40℃、120-300rpm培養箱中以密封蓋封住密封培養。在其中一個實施方式中，線性聚乙烯亞胺的分子量范圍為2.5-40kd，優選25kd。在其中一個實施方式中，在配制轉染試劑溶液過程中，無菌水的ph為5.0-7.0，優選ph為6.1。在其中一個實施方式中，在配制轉染試劑溶液過程中，配制的轉染試劑溶液中線性聚乙烯亞胺的濃度為0.1-2g/ml，優選1g/ml。在其中一個實施方式中，在配制轉染復合物過程中，對于果蠅s2細胞是按照線性聚乙烯亞胺與待轉染的含目的dna的質粒的質量比為2:1的比例配制；對于草地貪夜蛾sf9細胞是按照線性聚乙烯亞胺與待轉染的含目的dna的質粒的質量比為3:1的比例配制。在其中一個實施方式中，在瞬時轉染過程中，將轉染復合物加入已傳代培養的果蠅s2細胞或草地貪夜蛾sf9細胞的細胞懸液中是按照每106個細胞轉染0.1-3μg含目的dna的質粒的比例添加。在其中一個實施方式中，在瞬時轉染過程中，對于果蠅s2細胞是按照每106個果蠅s2細胞轉染0.6μg含目的dna的質粒的比例添加，并于28℃、180rpm、5％co2培養箱中搖晃培養，或者于28℃、180rpm培養箱中以密封蓋封住密封培養，并在12-72小時，優選48小時后更換為透氣蓋子；對于草地貪夜蛾sf9細胞是按照每106個草地貪夜蛾sf9細胞轉染1.5μg含目的dna的質粒的比例添加，并于28℃、180rpm、5％co2培養箱中搖晃培養，或者于28℃、180rpm培養箱中以密封蓋封住密封培養，并在12-72小時，優選48小時后更換為透氣蓋子。在其中一個實施方式中，在果蠅s2細胞或草地貪夜蛾sf9細胞傳代培養時，傳代細胞的密度為0.1-2×106個細胞/ml，優選1×106個細胞/ml。在其中一個實施方式中，在瞬時轉染過程中，當傳代培養的細胞密度達到2-50×106個細胞/ml時，進行瞬時轉染，優選是達到5×106個細胞/ml時，進行瞬時轉染。在其中一個實施方式中，在穩定細胞池蛋白表達過程中，以4×106個昆蟲細胞/ml的密度接種，于28℃、180rpm、5％co2培養箱中搖晃培養，或者于28℃、180rpm培養箱中以密封蓋封住密封培養，并在12-72小時，優選48小時后更換為透氣蓋子。傳統的在昆蟲細胞培養時多采用的是磷酸鹽緩沖系統，其培養過程中無需添加co2，目的蛋白的表達量比較低。本發明創造性的發現在昆蟲細胞培養時，無論是在瞬時轉染還是在穩定細胞池的蛋白表達生產過程中，在培養箱中添加co2或通過轉染后將透氣蓋子換成密封蓋以通過昆蟲細胞自身呼吸作用增加瓶中co2濃度的方法都可以提高蛋白的表達量，并且提升效果顯著。在昆蟲細胞培養過程中在培養箱中添加co2或將培養瓶蓋子換成密封蓋簡單易行，成本低，是可以廣泛使用的并可顯著提高昆蟲細胞蛋白表達量的方法。以下結合具體實施例對提高昆蟲細胞瞬時轉染和穩定表達蛋白表達量的方法作進一步詳細的說明。以下實施例所用的濃度等數值均為優選的數值，可理解，在其他實施例中，不限于此，如可以以前面所述的數據范圍中的任意數據。1.果蠅s2細胞來源及傳代果蠅s2細胞從tcmetrix公司(epalinges，瑞士)獲得，來自果蠅的drosophilaschneider2細胞系，并在sf900iisfm培養基中(lifetechnologies公司，巴塞爾，瑞士)進行懸浮培養。細胞在tubespin生物反應器50(ts50)或在tubespin生物反應器600(ts600)(tpp，trasadingen，瑞士)中培養，其各自培養基的量分別為5-10ml或300ml。細胞每周傳代2次，傳代細胞密度為1×106個細胞/ml。所有培養物在isf1-x振蕩培養器(kühnerag，birsfelden，瑞士)中保持在28℃溫度下，搖晃速度為180rpm，搖動直徑5cm。細胞密度和活性通過臺盼藍排除法使用血細胞計數器測定。2.草地貪夜蛾細胞sf9的來源及傳代sf9細胞購買至invitrogen公司(巴塞爾，瑞士)，并在sf900iisfm培養基中(lifetechnologies公司，巴塞爾，瑞士)進行懸浮培養。細胞在tubespin生物反應器50(ts50)或在tubespin生物反應器600(ts600)(tpp，trasadingen，瑞士)中培養，其各自培養基的量分別為5-10ml或300ml。細胞每周傳代2次，傳代細胞密度為1×106個細胞/ml。所有培養物在isf1-x振蕩培養器(kühnerag，birsfelden，瑞士)中保持在28℃溫度下，搖晃速度為180rpm，搖動直徑5cm。細胞密度和活性通過臺盼藍排除法使用血細胞計數器測定。3.瞬時轉染配置轉染試劑溶液：將分子量為25kd的線性聚乙烯亞胺(polyscienceseuropegmbh,eppelheim，germany)溶于ph6.1的無菌水中，配置成濃度為1mg/ml的轉染試劑溶液。在轉染兩天前將細胞離心后按照1×106個細胞/ml的密度傳代，當細胞密度達到5×106個細胞/ml時轉染。果蠅s2細胞按照每106個細胞轉染質量為0.6μg含目的dna的質粒比例準備質粒，將聚乙烯亞胺與含目的dna的質粒按照質量比為2:1的比例加入無菌水中震蕩混勻，以形成轉染復合物。草地貪夜蛾sf9細胞按照每106個細胞轉染質量為1.5μg含目的dna的質粒比例準備質粒，將聚乙烯亞胺與含目的dna的質粒按照質量比為3:1的比例加入無菌水中震蕩混勻，以形成轉染復合物。對于小規模轉染，將細胞離心并重懸于含培養基的ts50管中，將轉染復合物加入培養基中。對于300ml的轉染，將細胞離心并重懸于含培養基的ts600管中，將轉染復合物加入培養基中。將轉染復合物加入已傳代培養的昆蟲細胞s2或sf9細胞懸液中，得到已轉染含目的dna的質粒的細胞，于28℃、180rpm，5％co2培養箱中搖晃培養，或于轉染后在28℃、180rpm，無co2培養箱中培養但將瓶蓋換成不透氣密封蓋以增加瓶中co2含量，48h后換回透氣蓋子。4.穩定細胞池生產穩定細胞池的構建方法可參考現有技術文獻(matascim,baldil,hackerdl,wurmfm.2011a.thepiggybactransposonenhancesthefrequencyofchostablecelllinegenerationandyieldsrecombinantlineswithsuperiorproductivityandstability.biotechnolbioeng108(9):2141-50)。構建好的s2或sf9細胞穩定細胞池以1-8×106個細胞/ml的密度接種后，，于28℃、180rpm，5％co2培養箱中搖晃培養，或于轉染后在28℃、180rpm，無co2培養箱中培養但將瓶蓋換成不透氣密封蓋以增加瓶中co2含量，48h后換回透氣蓋子。5.蛋白質定量含目的dna的質粒包括導入有egfp(綠色熒光蛋白)基因、tnfr-fc基因、蛋白1基因和蛋白2基因的質粒，從而表達出egfp、tnfr-fc、蛋白1和蛋白2的蛋白。piex-xegfp、piex-tnfr-fc、piex-protein1和piex-protein2分別攜帶egfp基因、人tnfr-fc基因、蛋白1基因和蛋白2基因，并且受autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus(acmnpv)同源區5(hr5)增強子以及極早期基因1(ie1)啟動子的控制，質粒的構建參考申請號為cn201510708368.8的中國專利申請。egfp陽性細胞的百分比通過guavaeasycyte流式細胞儀(guavatechnologies,hayward,美國)測定。激發光和發射光分別為488nm和532nm。tnfr-fc、蛋白1和蛋白2的濃度通過elisa方法確定。分別使用羊抗人fcγ抗體、蛋白1鼠源抗體和蛋白2鼠源抗體進行包被，并通過堿性磷酸酶共聚羊抗人iggγ鏈來檢測tnf-fc，堿性磷酸酶羊抗鼠抗體來檢測蛋白1和蛋白2。加入底物后，在405nm和490nm下用讀板器檢測吸收值。6.實驗結果如圖2-圖6所示，圖2sf9的瞬時轉染中，與對照組轉染后在不含co2培養箱中培養相比，轉染后在5％co2培養箱中培養的egfp陽性細胞比例在轉染后1-5天都更高。圖3在sf9的瞬時轉染中，與對照組轉染后在不含co2培養箱中培養相比，轉染后在5％co2培養箱中培養的sf9細胞tnfr-fc蛋白的單位產量在轉染后1-5天都更高。圖4在s2細胞瞬時轉染中，在培養箱不添加co2的情況下，轉染后用密封蓋封住培養瓶可通過細胞自身的呼吸作用在培養瓶中積累更多co2，在轉染后培養箱不添加co2的情況下，與對照組轉染后使用透氣蓋子相比，轉染后分別封閉蓋子至24h、48h、72h后再換成透氣蓋子，s2細胞的蛋白1單位產量都更高，其中封閉蓋子至48h的最高。圖5在s2細胞穩定細胞池的培養過程中，與對照組在不含co2培養箱中培養相比，在5％co2培養箱中培養和封閉蓋子培養s2細胞在第1天、3天、5天的蛋白1單位產量都更高，其中在第5天在5％co2培養箱中培養的蛋白1單位產量顯著高于對照組和用密封蓋密封培養組。圖6在s2細胞穩定細胞池的培養過程中，與對照組在不含co2培養箱中培養相比，在5％co2培養箱中培養和用密封蓋密封培養s2細胞在第1天、3天、5天的蛋白2單位產量都更高。本實施例研究發現在昆蟲細胞的瞬時轉染和穩定細胞池生產中，通過在培養箱中添加co2或通過封閉蓋子增加培養瓶中co2濃度的方法來提高蛋白產量，此操作方法簡單易行且效果顯著，可應用于昆蟲細胞瞬時轉染和穩定細胞池的蛋白生產中。以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。當前第1頁12當前第1頁12