一種支持HeLa細胞貼壁培養的無血清培養基的制作方法

本發明涉及一種支持hela細胞貼壁培養的無血清培養基，屬于細胞工程技術領域。

背景技術：

海拉細胞(hela細胞)生長奇快，甚至超越一般癌細胞。海拉細胞經歷細胞分裂時可維持端粒酶活性以維持端粒長度，一般細胞的端粒會隨著老化而變短，終至細胞死亡。而海拉細胞卻擁有端粒修復酶，自動避開海夫力克極限(hayflicklimit)，從而達到“永生”。“海拉”細胞幫助科學家實現了人類科學史上一些最重要的醫學突破：化學療法、克隆、基因組、人工受精等等。到今天，無數科學家還在繼續使用“海拉”細胞以期攻克人類未攻克的難題，如癌癥、艾滋病、輻射傷害、毒性問題等等，上世紀80年代，德國科學家利用海拉細胞證實了hpv病毒與宮頸癌的因果關系，獲1984年諾貝爾獎。21世紀，至少有5項諾貝爾獎與海拉細胞系有關。海拉細胞甚至還被工業用在測試人體對膠帶、膠水、化妝品和其他工業品的敏感度上。很多人受益于“海拉”細胞，比如脊髓灰質炎疫苗的研制就與這組細胞關系密切。

細胞培養基是決定細胞體外生長代謝最重要、最直接的環境因素。目前大多數合成細胞培養基均需要補充動物血清才能支持細胞的體外生長、增殖，而動物血清的使用帶來了動物性病原微生物污染培養物的可能，因此推動了動物細胞無血清培養基的發展。現有技術中，國外細胞無血清培養基配方保密且價格高，同時市場上已有培養基(國內、國外)成分均不明確。

技術實現要素：

針對上述現有技術，本發明提供了一種支持hela細胞貼壁培養的無血清培養基，實現了在不添加血清的情況下培養hela細胞，使其能夠維持正常的細胞形態及正常的細胞生長速度。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種支持hela細胞貼壁培養的無血清培養基，是由以下濃度的組分組成的，各濃度單位為mg/l：

甘氨酸10～50；

l-丙氨酸2～10；

l-精氨酸鹽酸鹽50～200；

l-天冬酰胺5～20；

l-天冬氨酸5～20；

l-半胱氨酸鹽酸鹽10～50；

l-胱氨酸鹽酸鹽20～50；

l-谷氨酰胺300～500；

l-谷氨酸5～10；

l-組氨酸鹽酸鹽20～50；

l-異亮氨酸50～100；

l-亮氨酸50～100；

l-賴氨酸鹽酸鹽50～200；

l-蛋氨酸10～50；

l-苯丙氨酸20～50；

l-脯氨酸10～50；

l-絲氨酸20～50；

l-蘇氨酸50～100；

l-色氨酸5～20；

l-酪氨酸50～100；

l-纈氨酸50～100；

生物素0.0001～0.01；

氯化膽堿5～10；

d-泛酸鈣1～5；

葉酸1～5；

煙酰胺1～5；

鹽酸吡哆醇1～5；

核黃素0.1～1；

硫胺素鹽酸鹽1～5；

維生素b120.1～1；

肌醇10～20；

無水氯化鈣100～200；

五水硫酸銅0.0001～0.01；

九水硝酸鐵0.01～0.1；

七水硫酸亞鐵0.1～1；

無水氯化鎂20～50；

七水硫酸鎂20～50；

氯化鉀300～500；

碳酸氫鈉2000～3000；

氯化鈉5000～8000；

磷酸氫二鈉50～100；

一水磷酸二氫鈉50～100；

七水硫酸鋅0.1～1；

葡萄糖2000～3000；

次嘌呤鈉1～5；

亞油酸0.1～0.5；

硫辛酸0.1～1；

酚紅鈉鹽5～15；

腐胺鹽酸鹽0.01～0.1；

丙酮酸鈉50～200；

胸腺嘧啶0.1～0.5；

hepes2000～5000；

抗壞血酸100～200；

谷胱甘肽5～20；

胰酶抑制劑50～200；

l多聚賴氨酸0.1～1；

白蛋白1000～3000；

胰島素5～50；

轉鐵蛋白5～50；

氯化錳0.0001～0.01；

偏釩酸銨0.0001～0.1；

氯化鎳0.0001～0.1；

二水氯化錫0.0001～0.1；

九水硅酸鈉0.0001～0.1；

四水鉬酸銨0.0001～0.1；

亞硒酸鈉0.0001～0.1；

余量為水。

本發明的無血清培養基的制備方法為：取上述除水外的組分，根據其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調節ph值至7.1～7.4，濾膜過濾除菌(0.22μm濾膜過濾)，即得，分裝。

本發明的支持hela細胞貼壁培養的無血清培養基，根據細胞體外生長的營養需求選擇不同營養物質以替代動物血清所發揮的作用，并對不同營養物質的比例進行了合理調整。不需要補充血清就可以支持hela細胞貼壁生長，使其能夠維持正常的細胞形態及正常的細胞生長速度。

附圖說明

圖1：hela細胞呈單層貼壁形式正常生長示意圖(低密度)(200×)。

圖2：hela細胞呈單層貼壁形式正常生長示意圖(高密度)(200×)。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明。

下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規儀器、試劑、材料等，可通過正規商業途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規實驗方法，檢測方法等。

實施例1制備無血清培養基

是由以下濃度的組分組成的，各濃度單位為mg/l：

甘氨酸30；

l-丙氨酸6；

l-精氨酸鹽酸鹽120；

l-天冬酰胺15；

l-天冬氨酸15；

l-半胱氨酸鹽酸鹽30；

l-胱氨酸鹽酸鹽40；

l-谷氨酰胺400；

l-谷氨酸8；

l-組氨酸鹽酸鹽40；

l-異亮氨酸150；

l-亮氨酸70；

l-賴氨酸鹽酸鹽150；

l-蛋氨酸30；

l-苯丙氨酸30；

l-脯氨酸30；

l-絲氨酸40；

l-蘇氨酸70；

l-色氨酸12；

l-酪氨酸80；

l-纈氨酸80；

生物素0.005；

氯化膽堿7；

d-泛酸鈣3；

葉酸3；

煙酰胺3；

鹽酸吡哆醇3；

核黃素0.5；

硫胺素鹽酸鹽3；

維生素b120.5；

肌醇15；

無水氯化鈣150；

五水硫酸銅0.005；

九水硝酸鐵0.05；

七水硫酸亞鐵0.5；

無水氯化鎂35；

七水硫酸鎂35；

氯化鉀400；

碳酸氫鈉2500；

氯化鈉7000；

磷酸氫二鈉70；

一水磷酸二氫鈉80；

七水硫酸鋅0.5；

葡萄糖2500；

次嘌呤鈉3；

亞油酸0.3；

硫辛酸0.5；

酚紅鈉鹽10；

腐胺鹽酸鹽0.05；

丙酮酸鈉100；

胸腺嘧啶0.3；

hepes3500；

抗壞血酸150；

谷胱甘肽15；

胰酶抑制劑130；

l多聚賴氨酸0.5；

白蛋白2000；

胰島素30；

轉鐵蛋白30；

氯化錳0.005；

偏釩酸銨0.005；

氯化鎳0.005；

二水氯化錫0.005；

九水硅酸鈉0.005；

四水鉬酸銨0.005；

亞硒酸鈉0.005；

余量為蒸餾水。

制備方法為：取上述除水外的組分，根據其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入蒸餾水使各組分終濃度如上所述，調節ph值至7.2，0.22μm濾膜過濾除菌，即得，分裝，-4℃保存。

實施例2制備無血清培養基

是由以下濃度的組分組成的，各濃度單位為mg/l：

甘氨酸10；

l-丙氨酸10；

l-精氨酸鹽酸鹽50；

l-天冬酰胺20；

l-天冬氨酸5；

l-半胱氨酸鹽酸鹽50；

l-胱氨酸鹽酸鹽20；

l-谷氨酰胺500；

l-谷氨酸5；

l-組氨酸鹽酸鹽50；

l-異亮氨酸50；

l-亮氨酸100；

l-賴氨酸鹽酸鹽50；

l-蛋氨酸50；

l-苯丙氨酸20；

l-脯氨酸50；

l-絲氨酸20；

l-蘇氨酸100；

l-色氨酸5；

l-酪氨酸100；

l-纈氨酸50；

生物素0.01；

氯化膽堿5；

d-泛酸鈣5；

葉酸1；

煙酰胺5；

鹽酸吡哆醇1；

核黃素1；

硫胺素鹽酸鹽1；

維生素b121；

肌醇10；

無水氯化鈣200；

五水硫酸銅0.001；

九水硝酸鐵0.1；

七水硫酸亞鐵0.1；

無水氯化鎂50；

七水硫酸鎂20；

氯化鉀500；

碳酸氫鈉2000；

氯化鈉8000；

磷酸氫二鈉50；

一水磷酸二氫鈉100；

七水硫酸鋅0.1；

葡萄糖3000；

次嘌呤鈉1；

亞油酸0.5；

硫辛酸0.1；

酚紅鈉鹽15；

腐胺鹽酸鹽0.01；

丙酮酸鈉200；

胸腺嘧啶0.1；

hepes5000；

抗壞血酸100；

谷胱甘肽20；

胰酶抑制劑50；

l多聚賴氨酸1；

白蛋白1000；

胰島素50；

轉鐵蛋白5；

氯化錳0.01；

偏釩酸銨0.1；

氯化鎳0.1；

二水氯化錫0.1；

九水硅酸鈉0.001；

四水鉬酸銨0.001；

亞硒酸鈉0.001；

余量為蒸餾水。

制備方法為：取上述除水外的組分，根據其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入蒸餾水使各組分終濃度如上所述，調節ph值至7.4，0.22μm濾膜過濾除菌，即得，分裝，-4℃保存。

實施例3制備無血清培養基

是由以下濃度的組分組成的，各濃度單位為mg/l：

甘氨酸50；

l-丙氨酸2；

l-精氨酸鹽酸鹽200；

l-天冬酰胺5；

l-天冬氨酸20；

l-半胱氨酸鹽酸鹽10；

l-胱氨酸鹽酸鹽50；

l-谷氨酰胺300；

l-谷氨酸10；

l-組氨酸鹽酸鹽20；

l-異亮氨酸100；

l-亮氨酸50；

l-賴氨酸鹽酸鹽200；

l-蛋氨酸10；

l-苯丙氨酸50；

l-脯氨酸10；

l-絲氨酸50；

l-蘇氨酸50；

l-色氨酸20；

l-酪氨酸50；

l-纈氨酸100；

生物素0.001；

氯化膽堿10；

d-泛酸鈣1；

葉酸5；

煙酰胺1；

鹽酸吡哆醇5；

核黃素0.1；

硫胺素鹽酸鹽5；

維生素b120.1；

肌醇20；

無水氯化鈣100；

五水硫酸銅0.01；

九水硝酸鐵0.01；

七水硫酸亞鐵1；

無水氯化鎂20；

七水硫酸鎂50；

氯化鉀300；

碳酸氫鈉3000；

氯化鈉5000；

磷酸氫二鈉100；

一水磷酸二氫鈉50；

七水硫酸鋅1；

葡萄糖2000；

次嘌呤鈉5；

亞油酸0.1；

硫辛酸1；

酚紅鈉鹽5；

腐胺鹽酸鹽0.1；

丙酮酸鈉50；

胸腺嘧啶0.5；

hepes2000；

抗壞血酸200；

谷胱甘肽5；

胰酶抑制劑200；

l多聚賴氨酸0.1；

白蛋白3000；

胰島素5；

轉鐵蛋白50；

氯化錳0.001；

偏釩酸銨0.001；

氯化鎳0.0001；

二水氯化錫0.001；

九水硅酸鈉0.1；

四水鉬酸銨0.1；

亞硒酸鈉0.1；

余量為蒸餾水。

制備方法為：取上述除水外的組分，根據其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入蒸餾水使各組分終濃度如上所述，調節ph值至7.1，0.22μm濾膜過濾除菌，即得，分裝，-4℃保存。

實驗

將實施例1制備的培養基置于t25細胞培養瓶中，將hela細胞(購自上海細胞保藏中心)以5.0×10⁵cells/ml接種，在溫度37℃下培養，培養24小時后，可見hela細胞呈單層貼壁形式正常生長，如圖1所示，培養48小時后，如圖2所示。

同時，以國外品牌(gibco)的無血清培養基為對照培養hela細胞。

結果：采用本發明的無血清培養基培養hela細胞，無需經過復雜的降血清馴化過程，可直接轉換為無血清培養。而國外品牌(gibco)的無血清培養基，則需要10％，5％，2％，1％梯度馴化，馴化周期長，操作復雜。

細胞倍增時間對比：經細胞倍增時間檢測如表1所示，本發明的無血清培養基培養的hela細胞，生長迅速，倍增時間最快15個小時，細胞生長迅速，收獲細胞多。而國外品牌(gibco)的無血清培養基，倍增時間在20小時左右，速度緩慢。

表1細胞個數

上述雖然結合實施例對本發明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護范圍以內。