專利名稱：一種使用bhk-21貼壁細胞制備口蹄疫疫苗的方法
技術領域：
本發明屬于生物制藥領域，具體描述為一種用BHK-21細胞在生物反應器中經一步高密度大規模貼壁培養制備口蹄疫疫苗的方法。
背景技術：
口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouthdisease virus, FMDV)引起的偶蹄動物傳播的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，易感動物多達70多種。口蹄疫疫病傳染性極強，可引起動物生產性能下降，一旦爆發會給被感染地區的畜牧業造成巨大的經濟損失，嚴重影響國際貿易，被世界動物衛生組織列為必須在第一時間報告疫情的疫病之一。FMDV 屬于小 RNA 病毒科(Picornaviridae) 口蹄疫病毒屬(Aphthovirus),血清型眾多，包括O、A、C、Asial、SATl、SAT2和SAT3型共7個血清型。其血清型間無交叉免疫保護，所以針對一種血清型的疫苗對其他血清型病毒難以產生作用，造成疫病控制難度較大。FMD疫苗經歷了滅活疫苗、活疫苗、滅活疫苗這一歷發展趨勢，目前也有部分新型疫苗(合成肽疫苗)面市。其中，滅活疫苗最初使用舌皮組織毒經甲醛滅活制成的疫苗，經過將近20年的發展，現在主要通過細胞培養病毒經BEI滅活制成疫苗。FMD病毒抗原生產方式也主要有三種方式:1，牛舌皮組織生產培養方法；2，轉瓶BHK21細胞培養法；3，BHK21細胞懸浮培養方法。其中，轉瓶BHK21細胞培養方法在生產過程中需要較多的人工操作，容易散毒，較難完全控制生物安全；而懸浮培養法在生產過程中使用了大型生物反應器，能很好的保持生產過程生物安全 ，是目前疫苗的主要生產方式。1962年，Capstick等將BHK21單層貼壁細胞馴化為懸浮細胞用于懸浮培養，1965年，Telling和Elsworth使用大型發酵罐用于懸浮培養BHK21懸浮細胞。此后，這種生產方式被越來越廣泛的用在口蹄疫滅活疫苗生產中。目前，世界主要口蹄疫生產企業， 如 Intervet, Merial, Indianlmmunologicals Ltd., Bayer Healthcare, WellcomeBiotechnology Limited,及國內主要口蹄疫生產企業,如金宇保靈，內蒙古必威安泰等,均采用這種大型發酵罐懸浮培養BHK21懸浮細胞制備口蹄疫滅活疫苗的生產方法。上述生產方法的典型生產工藝流程為:取細胞工作庫中保存的細胞，經0.2升，2升，5升培養體積的初級放大及懸浮馴化，接種至體積由小到大的若干發酵罐進行逐級放大，最后達到在大型發酵罐中培養，例如，經過30升，100升，300升，1000升，至3000升，或者經過10升，120升，650升，至4000升。然后接入制備好的種毒毒液，感染細胞，在條件合適時收獲病毒液，滅活，經抗原濃縮與純化，然后進行乳化并分裝獲得口蹄疫滅活疫苗成品O現有的大規模懸浮培養BHK-21細胞制備口蹄疫滅活疫苗的方法，在細胞初級放大后，包括一個必須的逐級放大的過程。這些4步-5步的逐級放大步驟需要消耗大量培養基，增加了培養困難和受到污染的可能性，每一步放大需要培養細胞3-4天，所以逐級放大過程周期為15-20天，整個生產過程周期為30-40天。
發明內容
本發明提供了一種工藝流程簡單、生產周期更短的制備口蹄疫疫苗的方法。本發明提供的工藝方法，可以使用BHK-21貼壁細胞用于制備口蹄疫疫苗，免去了將貼壁細胞馴化為懸浮細胞的過程；本發明提供的工藝方法，避免了現有的BHK-21細胞大規模懸浮培養制備口蹄疫疫苗技術中必需的逐級放大過程，顯著簡化工藝流程，縮短生產周期；本發明提供的工藝方法，在短時間內大規模培養得到極高密度的貼壁BHK-21細胞，為口蹄疫病毒的感染和復制提供更優的環境，從而提高抗原數量和質量，創造顯著效益；本發明提供的工藝方法，結合高效率的生物反應器灌流培養方式與廣泛應用的大型細胞罐一次性接毒方式，在提高生產效率的同時最大程度的減小了口蹄疫病毒的逃逸，減少污染機會。本發明方法制備的口蹄疫疫苗產量更高且質量穩定。本發明提供一種使用BHK-21貼壁細胞制備口蹄疫疫苗的方法，包括以下步驟:I)細胞復蘇和初級放大；2)大規模對細胞進行放大培養；3)將大規模放大培養后得到的細胞懸液轉移至病毒液制備罐中，條件成熟時，接種口蹄疫病毒種毒液及毒液收獲。
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本發明方法還可以包括制備疫苗成品的下游步驟。細胞復蘇采用本領域常規方法進行，例如:(I)取出凍存于液氮中的BHK-21細胞，置于37°C水浴中復蘇，并接種入含有胎牛血清或小牛血清的培養液20ml中，在37°C，通5% CO2的二氧化碳培養箱中培養1_2天。(2)將步驟(I)中培養得到的細胞懸液，經過胰酶消化，分成若干瓶，每瓶用含有胎牛血清或小牛血清的培養液40ml，繼續按(I)中的條件培養2-3天。(3)將步驟(2)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(4)進行細胞計數及活力檢查。所述培養液可采用本領域常規的細胞培養基，例如CMRL1415培養基，F12(HAM)培養基，M199培養基，MEM培養基，DMEM培養基等，向選用的培養基中加入胎牛血清，或小牛血清使其濃度達到3^-15 ^步驟(4)可采用臺盼藍染色法進行。BHK-21細胞復蘇后的初級放大培養可以使用各種體積的圓形培養皿，T型瓶，方瓶，圓柱形滾瓶(或稱轉瓶)，細胞工廠(Cell Factory, NUC公司)及其同類產品(例如，Cell Stack, Corning公司)，小型生物反應器,和各種體積的一次性生物反應器裝置。在一個實施方式中，所述初級放大培養采用細胞工廠方式，步驟如下:(I)將細胞復蘇得到的細胞懸液，用培養液稀釋至適當的密度后接種至細胞工廠培養器裝置；(2)將步驟(I)中所得到的細胞液放入二氧化碳培養箱培養；(3)將步驟(2)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(4)進行細胞計數及活力檢查。所述培養液可采用本領域常規的細胞培養基，例如CMRL1415培養基，F12(HAM)培養基，M199培養基，MEM培養基，DMEM培養基等，向選用的培養基加入胎牛血清或小牛血清使其濃度達到3%-15%。步驟(I)中所用的細胞工廠培養器裝置為本領域常規使用的裝置，例如美國NUC公司的Cell Factory,或美國Corning (康寧)公司的Cell Stack。步驟(2)的培養條件為本領域常規的細胞培養條件，例如37°C，通5% CO2的二氧化碳培養2-3天。步驟(4)可采用臺盼藍染色法進行。在另一個實施方式中，所述初級培養采用轉瓶培養方式，步驟如下:(I)將細胞復蘇得到的細胞懸液，用培養液稀釋至適當的密度后接種至轉瓶中(2)將步驟⑴中所得到的含細胞液的轉瓶置于轉瓶機；(3)將步驟(2)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(4)進行細胞計數及活力檢查。所述培養液可采用本領域常規的細胞培養基，例如CMRL1415培養基，F12(HAM)培養基，M199培養基，MEM培養基，DMEM培養基等，向選用的培養基加入胎牛血清或小牛血清使其濃度達到3%-15%。步驟(I)中所用轉瓶為本領域常規使用的器材，體積例如為3升的，15升的。步驟(2)的培養條件為本領域常規的細胞培養條件，例如裝有細胞液的轉瓶被放置于轉瓶機上，設定轉速為20-40rpm，37°C，通5% CO2的二氧化碳，培養2_3天。步驟(4)可采用臺盼藍染色法進行。使用生物反應器和微載體大規模對細胞進行放大培養，包括如下步驟:1.調試與準備生物反應器，使其處于良好的生產狀態；對微載體，進行浸泡和滅菌準備；
i1.將培養液注入生物反應器中，并將微載體加入，設定合適的培養條件、轉速和溫度;ii1.將所述初級放大培養得到的細胞懸液，以適當的接種密度接種至生物反應器中；iv.以灌流培養的方式培養細胞。培養期間以適當的時間間隔進行細胞計數及活力檢查。所述生物反應器可使用本領域常用的內部結構支持使用載體的各類生物反應器，例如德國Eppendorf (艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反應器，德國Satorious公司生物反應器,荷蘭Applicon公司生物反應器,杭州安普公司生物反應器，上海日泰公司生物反應器，廣州旗幟公司生物反應器。優選使用德國Eppendorf (艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反應器,德國Satorious公司生物反應器,荷蘭Applicon公司生物反應器，更優選使用德國Eppendorf (艾本德)公司NewBrunswickScientific生物反應器。所述載體可選自常規使用的各種材料制的載體，包括化工材料的聚丙烯，PLA,PGA,多孔硅，PLGA，PPF等，和天然材料的葡聚糖，膠原蛋白，瓊脂，谷物蛋白等。優選使用葡聚糖材料的微載體，更優選使用美國GE公司Cytodexl球形微載體。所述微載體的濃度例如為5-50克/升，優選10-40克/升，更優選15_30克/升，最優選20-25克/升。細胞培養條件為本領域常規的細胞培養條件，例如。轉速為80_120rpm。溫度為37度。所述培養液可采用本領域常規的細胞培養基，例如CMRL1415培養基，F12(HAM)培養基，M199培養基，MEM培養基，DMEM培養基等，優選使用M199培養基，MEM培養基，DMEM培養基，更優選使用GIBCO公司的MEM培養基或DMEM培養基。適當的接種密度例如為0.8xl05個細胞/ml至9xl05個細胞/ml，優選IxlO5個細胞/ml至7xl05個細胞/ml，更優選3xl05個細胞/ml至6xl05個細胞/ml，最優選為5xl05個細胞/ml。以灌流培養的方式培養細胞2-10天，優選3-7天，更優選3-4天。細胞計數及活力檢查可采用臺盼藍染色法。細胞計數及活力檢查每隔4-24h進行一次，優選每隔6-18h進行一次，更優選每隔12小時進行一次。口蹄疫病毒接種及收獲按如下步驟進行:A當細胞密度達到適當的高密度時，停止在原生物反應器上的灌流培養。將罐體內全部溶液在無菌條件下轉移至大型細胞罐體內，補充培養液至細胞密度為0.5xl07個細胞/ml οB設定轉速為80-1 lOrpm，更優選lOOrpm，維持不超過24小時，使細胞溶液處于穩定狀態。C按設定的病毒種毒液濃度接毒，超過80%細胞被感染后，收獲毒液，經滅活，稀釋，乳化工藝，制備得到口蹄疫病毒疫苗。步驟A中，適當的高密度例如為1.0xlO7個細胞/ml至12xl07個細胞/ml，優選為2xl07個細胞/ml至IOxlO7個細胞/ml，更優選為4xl07個細胞/ml至IOxlO7個細胞/ml，最優選為5xl07個細胞/ml至8xl07個細胞/ml。步驟B中，維持時間例如6-24小時，優選8-20小時，更優選I O-18小時，最優選12
小時，使細胞溶液處于穩定狀態。步驟C的基本步驟使用本領域的常規方法:按照病毒感染復數MOI為0.05的量接種口蹄疫病毒種毒液，設定溫度為例如340C _37°C，PH7.4，溶氧為30% -50%。接毒后6小時起，每小時用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查，并在顯微鏡下觀察微載體上的細胞生長情況。當大于80%的細胞從微載體上脫落時，停止攪拌。靜置4小時后,收獲全部病毒上清液。收獲病毒液時，病毒液與微載體經微載體截留裝置分離，微載體被回收，經滅毒等生物安全步驟處理銷毀。這里的“微載體截留裝置”可以是內置于細胞罐中，也可以是外接在細胞罐出液口外的，可以由任何允許的經無菌處理的材料制成，可以是柱狀，網狀，三角形，等各種形狀，只要該裝置的作用是能夠使病毒液順利流過而微載體被截住不進入病毒液收獲容器。采用蔗糖密度梯度法測定口蹄疫病毒含量，當大于1000yg/ml時，進行滅活，稀釋，乳化工藝，制備得到口蹄疫病毒疫苗。本方法可以在短時間內進行多批次產品的生產，以應對突發的口蹄疫疫情，具體步驟為:BHK-21細胞復蘇并初級放大后，經3-5天的生物反應器微載體灌流培養，細胞液中細胞可達高密度(IxlO7個細胞/ml至IOxIO7個細胞/ml)，全體細胞液被轉移至大型細胞罐中進行接毒及收獲等步驟。此時 ，原生物反應器可經清洗、滅菌等步驟，重新開始新一輪疫苗生產。本方法在BHK-21細胞復蘇并初級放大后，不需馴化細胞為純懸浮細胞，也不需經過逐級放大過程，對比傳統的懸浮培養工藝中的細胞培養過程，將大規模細胞培養過程的時間縮短了近70%。
具體實施例方式材料與設備1，材料I) MEM培養基，DMEM培養基，GIBCO公司2)胎牛血清，GIBCO公司2，主要設備I)細胞工廠，美國NUC公司2)生物反應器:德國Eppendorf (艾本德)公司New Brunswick 40L生物反應器(工作體積30L)，75L生物反應器(工作體積52L)，150L生物反應器(工作體積105L);工作體積300升的發酵罐，工作體積為550升的發酵罐，工作體積為1100升的發酵罐3) 二氧化碳培養箱，日本三洋公司4)高速離心機，Beckman公司5)超速離心機，Beckman公司6)分光光度計,德國Eppendorf公司實施例1一，細胞復蘇和初級放大
(I)取出凍存于液氮中的BHK-21細胞，置于37°C水浴中復蘇，并接種入含有15%胎牛血清的DMEM培養基20ml的方瓶(T型瓶)中，在37°C，通5 % CO2的二氧化碳培養箱中培養2天。(2)將步驟(I)中培養得到的細胞懸液，經過胰酶消化，平均分配于5個T型瓶中，每瓶用含有10%胎牛血清的DMEM培養基補至總體積為20ml，繼續按(I)中的條件培養3天。(3)將步驟(2)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(4)采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。(5)將步驟(3)中培養得到的細胞懸液，經過胰酶消化，平均分配于25個T型瓶中，每瓶用含有10%胎牛血清的DMEM培養基補至總體積為20ml，繼續按(I)中的條件培養3天。(6)將步驟(5)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(7)采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。(8)將如步驟(6)所述得到的細胞懸液，接種至20個10層的細胞工廠裝置，每個用1500ml培養液稀釋細胞懸液至接種密度為IxlO5個細胞/ml。置于37°C，通5% CO2的二氧化碳培養箱中培養3天。(9)將步驟(8)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(10)采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。二，大規模對細胞進行放大培養1.按照設備使用說明調試與準備生物反應器，進行必要的清洗，滅菌步驟，并進行無菌試驗，以確認生物反應器處于良好的生產狀態。對選用的Cytodexl微載體進行浸泡和滅菌準備。i1.以DMEM培養基為基礎培養基，加入胎牛血清至使其濃度為8%，作為放大培養中使用的培養液。將培養液注入生物反應器中，并將微載體加入。以在一臺40L的生物反應器中生產為例，注入20升培養基，按20克/升的濃度加入600克經預處理的Cytodexl微載體。ii1.將如步驟I所述得到的細胞懸液，接種至生物反應器中，以在一臺40L的生物反應器中生產為例，按接種密度5xl05個細胞/ml接種BHK-21細胞，補充注入培養液使體積達到30升，設定氧氣，氮氣，空氣，二氧化碳的通入比例為20%，5%，60%，15%，通氣量為1.0升/分鐘，設定轉速為IlOrpm/分鐘，溫度37°C。iv.按照設備使用說明，以灌流培養的方式，培養細胞3天。V.每12小時采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。三，將大規模放大培養后得到的細胞懸液轉移至病毒液制備罐中，條件成熟時，接種口蹄疫病毒毒種液及毒液收獲A當細胞密度達到5xl07個細胞/ml時，停止在原生物反應器上的灌流培養。將40L生物反應器中的全部30L細胞液連同載體一起，在無菌條件下轉移到一個工作體積為300L的發酵罐中，注入培養液使總體積達到300L。B設定轉速為80rpm，維持12小時，使細胞溶液處于穩定狀態。C接毒及毒液收獲
按照病毒感染復數MOI為0.05的量接種口蹄疫病毒種毒液，設定溫度為34°C，PH為7.4,溶氧為50%。接毒后6小時起,每小時用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查，并在顯微鏡下觀察微載體上的細胞生長情況。當大于80%的細胞從微載體上脫落時，停止攪拌。靜置4小時后，收獲全部病毒上清液。采用蔗糖密度梯度法測定口蹄疫病毒含量，當大于ΙΟΟΟμ g/ml時，進行滅活，稀釋，乳化工藝，制備得到口蹄疫病毒疫苗。檢測收獲得到病毒液中的口蹄疫病毒含量(146S)所得結果為:三次接種的結果(μ g/ml)分別為:1895，2001，2136。按我國現行獸用生物制品質量標準進行檢驗和農業部對口蹄疫疫苗的相關公告進行檢驗，質量符合要求。實施例2一，細胞復蘇和初級放大與實施例1所述相同。二,大規模對細胞進行放大培養1.按照設備使用說明調試與準備生物反應器，進行必要的清洗，滅菌步驟，并進行無菌試驗，以確認生物反應器處于良好的生產狀態。對選用Cytodexl微載體進行浸泡和滅菌準備。i1.以DMEM培養基為基礎培養基，加入胎牛血清至使其濃度為8%，作為放大培養中使用的培養液。將培養液注入生物反應器中，并將微載體加入。以在一臺40L的生物反應器中生產為例，注入20升培養基，按25克/升的濃度加入750克經預處理的Cytodexl微載體。ii1.將如步驟I所述得到的細胞懸液，接種至生物反應器中，以在一臺40L的生物反應器中生產為例，按接種密度6xl05個細胞/ml接種BHK-21細胞，補充注入培養液使體積達到30升，設定氧氣，氮氣，空氣，二氧化碳的通入比例為25%，5%，55%，15%，通氣量為1.0升/分鐘，設定轉速為IlOrpm/分鐘，溫度37°C。
iv.按照設備使用說明，以灌流培養的方式，培養細胞3天。V.每12小時采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。三，將大規模放大培養后得到的細胞懸液轉移至病毒液制備罐中，條件成熟時，接種口蹄疫病毒毒種液及毒液收獲A當細胞密度達到6xl07個細胞/ml時，停止在原生物反應器上的灌流培養。將40L生物反應器中的全部30升細胞液連同載體一起，在無菌條件下轉移到一個工作體積為300L的發酵罐中，注入培養液使總體積達到300L。B設定轉速為80rpm，維持12小時，使細胞溶液處于穩定狀態。C接毒及毒液收獲按照病毒感染復數MOI為0.05的量接種口蹄疫病毒種毒液，設定溫度為34°C，PH為7.4,溶氧為50%。接毒后6小時起,每小時用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查，并在顯微鏡下觀察微載體上的細胞生長情況。當大于80%的細胞從微載體上脫落時，停止攪拌。靜置4小時后，收獲全部病毒上清液。采用蔗糖密度梯度法測定口蹄疫病毒含量，當大于ΙΟΟΟμ g/ml時，進行滅活，稀釋，乳化工藝，制備得到口蹄疫病毒疫苗。檢測收獲得到病毒液中的口蹄疫病毒含量(146S)所得結果為:三次接種的結果(μ g/ml)分別為:1745，1608，1889。按我國現行獸用生物制品質量標準進行檢驗和農業部對口蹄疫疫苗的相關公告進行檢驗，質量符合要求。實施例3一，細胞復蘇和初級放大(I)取出凍存于液氮中的BHK-21細胞，置于37°C水浴中復蘇，并接種入含有15%胎牛血清的DMEM培養基20ml的方瓶(T型瓶)中，在37°C，通5 % CO2的二氧化碳培養箱中培養2天。(2)將步驟⑴中培養得到的細胞懸液，經過胰酶消化，平均分配于5個T型瓶中，每瓶用含有10%胎牛血清的DMEM培養基補至總體積為20ml，繼續按(I)中的條件培養3天。(3)將步驟(2)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(4)采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。(5)將步驟(3)中培養得到的細胞懸液，經過胰酶消化，平均分配于25個T型瓶中，每瓶用含有10%胎牛血清的DMEM培養基補至總體積為20ml，繼續按(I)中的條件培養3天。(6)將步驟(5)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(7)采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。(8)將如步驟(6)所述得到的細胞懸液，接種至20個10層的細胞工廠裝置，每個裝置用1500ml培養液稀釋細胞懸液至接種密度為IxlO5個細胞/ml。置于37°C，通5% CO2的二氧化碳培養箱中培養3天。 (9)將步驟(8)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(10)采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。(11)將如步驟(9)所述得到的細胞懸液，接種至70個10層的細胞工廠裝置，每個裝置用1500ml培養液稀釋細胞懸液至接種密度為IxlO5個細胞/ml。置于37°C，通5% CO2的二氧化碳培養箱中培養3天。(12)將步驟(11)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(13)采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。二,大規模對細胞進行放大培養1.按照設備使用說明調試與準備生物反應器，進行必要的清洗，滅菌步驟，并進行無菌試驗，以確認生物反應器處于良好的生產狀態。對選用Cytodexl微載體進行浸泡和滅菌準備。i1.以DMEM培養基為基礎培養基，加入胎牛血清至使其濃度為8%，作為放大培養中使用的培養液。將培養液注入生物反應器中，并將微載體加入。以在一臺150L的生物反應器中生產為例，注入8 0升培養基，按20克/升的濃度加入2100克經預處理的Cytodexl微載體.
ii1.將如步驟I所述得到的細胞懸液，接種至生物反應器中，以在一臺150L的生物反應器中生產為例，按接種密度5xl05個細胞/ml接種BHK-21細胞，補充注入培養液使體積達到105升，設定氧氣，氮氣，空氣，二氧化碳的通入比例為25%，5%，55%，15%，通氣量1.0升/分鐘，設定轉速為IlOrpm/分鐘，溫度37°C。iv.按照設備使用說明，以灌流培養的方式，培養細胞4天。V.每12小時采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。三，將大規模放大培養后得到的細胞懸液轉移至病毒液制備罐中，條件成熟時，接種口蹄疫病毒毒種液及毒液收獲A當細胞密度達到5xl07個細胞/ml時，停止在原生物反應器上的灌流培養。將150L生物反應器中的全部105L細胞液連同載體一起，在無菌條件下轉移到一個工作體積為1100L的發酵罐中，注入培養液使總體積達到1050L。B設定轉速為80rpm，維持12小時，使細胞溶液處于穩定狀態。C接毒及毒液收獲按照病毒感染復數MOI為0.05的量接種口蹄疫病毒種毒液，設定溫度為34°C，PH為7.4,溶氧為50%。接毒后6小時起,每小時用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查，并在顯微鏡下觀察微載體上的細胞生長情況。當大于80%的細胞從微載體上脫落時，停止攪拌。靜置4小時后，收獲全部病毒上清液。采用蔗糖密度梯度法測定口蹄疫病毒含量，當大于ΙΟΟΟμ g/ml時，進行滅活，稀釋，乳化工藝，制備得到口蹄疫病毒疫苗。檢測收獲得到病毒液中的口蹄疫病毒含量(146S)所得結果為:三次接種的結果(μ g/ml)分別為:1535，1724，1666。按我國現行獸用生物制品質量標準進行檢驗和農業部對口蹄疫疫苗的相關公告進行檢驗，質量符合要求。實施例4一，細胞復蘇和初級放大(I)取出凍存于液氮中的BHK-21細胞，置于37°C水浴中復蘇，并接種入含有15%胎牛血清的DMEM培養基20ml的方瓶(T型瓶)中，在37°C，通5 % CO2的二氧化碳培養箱中培養2天。(2)將步驟(I)中培養得到的細胞懸液，經過胰酶消化，平均分配于4個T型瓶中，每瓶用含有10%胎牛血清的DMEM培養基補至總體積為20ml，繼續按(I)中的條件培養2天。(3)將步驟(2)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(4)采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。(5)將步驟(3)中培養得到的細胞懸液，經過胰酶消化，平均分配于16個T型瓶中，每瓶用含有10%胎牛血清的DMEM培養基補至總體積為20ml，繼續按(I)中的條件培養2天。(6)將步驟(5)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(7)采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。(8)將如步驟(6)所述得到的細胞懸液，接種至10個10層的細胞工廠裝置，每個裝置用1500ml培養液稀釋細胞懸液至接種密度為IxlO5個細胞/ml。置于37°C，通5% CO2的二氧化碳培養箱中培養3天。(9)將步驟(8)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(10)采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。(11)將如步驟(9)所述得到的細胞懸液，接種至32個10層的細胞工廠裝置，每個裝置用1500ml培養液稀釋細胞懸液至接種密度為IxlO5個細胞/ml。置于37°C，通5% CO2的二氧化碳培養箱中培養3天。`(12)將步驟(11)培養結束后所得的細胞全部用胰酶消化，收集。(13)采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。二,大規模對細胞進行放大培養1.按照設備使用說明調試與準備生物反應器，進行必要的清洗，滅菌步驟，并進行無菌試驗，以確認生物反應器處于良好的生產狀態。對選用CytodeX3微載體進行浸泡和滅菌準備。i1.以DMEM培養基為基礎培養基，加入胎牛血清至使其濃度為8%，作為放大培養中使用的培養液。將培養液注入生物反應器中，并將微載體加入。以在一臺75L的生物反應器中生產為例，注入38升培養基，按21克/升的濃度加入1092克經預處理的Cytodex 3微載體。ii1.將如步驟I所述得到的細胞懸液，接種至生物反應器中，以在一臺75L的生物反應器中生產為例，按接種密度3xl05個細胞/ml接種BHK-21細胞，補充注入培養基使體積達到52升，，設定氧氣，氮氣，空氣，二氧化碳的通入比例為25%，5%，55%，15%，通氣量
1.0升/分鐘，設定轉速為IlOrpm/分鐘，溫度37。。。iv.按照設備使用說明，以灌流培養的方式，培養細胞4天。V.每12小時采用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查。三，將大規模放大培養后得到的細胞懸液轉移至病毒液制備罐中，條件成熟時，接種口蹄疫病毒毒種液及毒液收獲A當細胞密度達到5xl07個細胞/ml時，停止在原生物反應器上的灌流培養。將75L生物反應器中的全部52L細胞液連同載體一起，在無菌條件下轉移到一個工作體積為550L的發酵罐中，注入培養液使總體積達到520L。B設定轉速為80rpm，維持12小時，使細胞溶液處于穩定狀態。C接毒及毒液收獲
按照病毒感染復數MOI為0.05的量接種口蹄疫病毒種毒液，設定溫度為34°C，PH為7.4,溶氧為50%。接毒后6小時起,每小時用臺盼藍染色法進行細胞計數及活力檢查，并在顯微鏡下觀察微載體上的細胞生長情況。當大于80%的細胞從微載體上脫落時，停止攪拌。靜置4小時后，收獲全部病毒上清液。采用蔗糖密度梯度法測定口蹄疫病毒含量，當大于ΙΟΟΟμ g/ml時，進行滅活，稀釋，乳化工藝，制備得到口蹄疫病毒疫苗。檢測收獲得到病毒液中的口蹄疫病毒含量(146S)所得結果為:三次接種的結果(μ g/ml)分別為:1438，1587，1802。按我國現行獸用生物制品質量標準進行檢驗和農業部對口蹄疫疫苗的相關公告進行 檢驗，質量符合要求。
權利要求
1.一種在生物反應器中大規模高密度培養BHK-21貼壁細胞制備口蹄疫疫苗的方法，該方法包括以下主要步驟:1)BHK-21細胞復蘇和初級放大培養；2)BHK-21細胞在生物反應器中大規模高密度培養；3)培養結束后的細胞液轉移至大型細胞罐中稀釋，接種口蹄疫病毒種毒，收獲毒液。
2.按權利要求1所述的方法，其特征在于:所述BHK-21細胞為貼壁細胞株，并且不經過懸浮馴化篩選，直接使用。
3.按權利要求1所 述的方法，其特征在于:所述BHK-21細胞株為已經懸浮馴化過的BHK-21懸浮細胞株，這些細胞株在所述方法的培養過程中適應為貼壁細胞株。
4.按權利要求1所述的方法，其特征還在于:所述步驟2)中，根據生產規模的大小選擇使用各種體積的生物反應器(例如I升，5升，7.5升，14升，40升，75升，150升，300升，和更大規模的)和各種已知的載體；這些載體包括但不局限于以下各種材料制成的載體:聚丙烯，PLA, PGA,多孔娃，PLGA, PPF等,和天然材料的葡聚糖(Cytodex I, Cytodex2,Cytodex3),膠原蛋白，瓊脂,谷物蛋白等；優選使用GE公司生產的Cytodexl和Cytodex3球形微載體。
5.按權利要求1所述的應用，其特征還在于:所述步驟2)中，使用微載體的濃度為5-50克/升，優選10-40克/升，更優選15-30克/升，最優選20-25克/升；細胞的接種密度為0.8xl05個細胞/ml至9xl05個細胞/ml，優選IxlO5個細胞/ml至7xl05個細胞/ml，更優選3xl05個細胞/ml至6xl05個細胞/ml ;培養基中加入3% -15%胎牛血清或小牛血清；生物反應器的培養條件設置為:溫度36.5-37.5攝氏度，溶氧DO 30% -80%, PH值7.0-7.2，轉速 80-120rpm。
6.按權利要求1所述的方法，其特征還在于:所述步驟2)中，當細胞達到高密度(IxlO7個細胞/ml至IOxIO7個細胞/ml)時，結束在生物反應器中的細胞培養，在無菌條件下將全部細胞液轉移至一個經滅菌處理的大型細胞罐中，用步驟2)中所用的培養液稀釋10倍，或更多。
7.按權利要求1所述的方法，其特征還在于:所述步驟3)中，“大型細胞罐”選自各種帶有普通旋轉攪拌槳的大型生物反應器，也可以是一次性生物反應器；所述反應器的罐體體積選自10升，50升，75升，150升，400升，800升，1500升，3000升，甚至更大規模的。
8.按權利要求1所述的方法，其特征還在于:所述步驟3)中，設定低轉速(不高于150rpm)使細胞載體懸液達到相對穩定狀態(不超過24小時)；然后檢查細胞密度及細胞活力，當細胞密度大于或等于目標細胞密度(例如0.5xl07個細胞/毫升)時，接種口蹄疫病毒種毒。
9.按權利要求1所述的方法，其特征還在于:所述步驟3)中接種口蹄疫病毒種毒后，當大于80%的細胞從載體上脫落時，開始收獲病毒液；載體與病毒液被載體截留裝置分離；所述“載體截留裝置”選自內置于細胞罐中，或外接在細胞罐出液口外的各種截留裝置，由任何允許的經無菌處理的材料制成，選自各種形狀，條件是該截留裝置是能夠使病毒液順利流過而微載體被截住不進入病毒液收獲容器。
10.按權利要求1所述的方法，其特征還在于:能夠在短時間內進行多批次產品的生產，以應對突發的口蹄疫疫情，具體步驟為:BHK-21細胞復蘇并初級放大后，經7-10天的生物反應器微載體灌流培養，細胞液中細胞達到高密度(IxlO7個細胞/ml至IOxIO7個細胞/ml)，全體細胞液被轉移至大型細胞罐中進行接毒及收獲等步驟；此時，原生物反應器經清洗、滅菌等步驟，重新開始新 一輪疫苗生產，使一套設備的批次生產周期為8-14天。
全文摘要
本發明公開了一種將BHK-21細胞大規模高密度貼壁培養技術應用于口蹄疫疫苗生產中的方法，該方法包括以下步驟1)細胞復蘇與初級放大；2)在一個中等體積的生物反應器中大規模高密度的進行細胞培養，培養完成后，將高密度的細胞液在大型細胞培養罐中稀釋；3)接種口蹄疫病毒種毒并在合適條件下收獲全部病毒液，經下游步驟制備口蹄疫疫苗。本發明提供的工藝方法，免去了將貼壁細胞馴化為懸浮細胞的過程；避免了現有的BHK-21細胞大規模懸浮培養制備口蹄疫疫苗技術中必需的逐級放大過程，顯著簡化工藝流程，縮短生產周期，同時最大程度的減小了口蹄疫病毒的逃逸，減少污染機會。
文檔編號C12N7/00GK103087995SQ20121059509
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者賈馨丹 申請人:杭州國牧生物科技有限公司