一種亞油酸含量相關的芝麻基因及其應用的制作方法

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及與一種亞油酸含量相關的芝麻基因sifad2，同時還涉及該基因在釀酒酵母微生物初生代謝物分泌和作物品質育種中的應用，亞油酸含量相關芝麻基因sifad2在釀酒酵母細胞和擬南芥中的過量表達表明，此基因可顯著提高釀酒酵母細胞和植物種子的亞油酸含量，應用于改良微生物出油品質和作物品質。

背景技術：

芝麻(sesamumindicuml.)屬胡麻科草本植物，世界范圍內廣泛栽培和利用的優質油料和特色經濟作物。芝麻種子含油量高，平均可達55％，有“油料皇后”之美稱，含有豐富的蛋白質、甾醇、卵磷脂、維生素e等營養成分，還富含鈣、磷、鐵等重要元素，芝麻中的芝麻素和芝麻酚林等特色保健成分，經研究證明具有強抗氧化和抗癌等功能。因此，芝麻廣受人民喜愛，其需求量和消費量隨著人民生活水平的上升而逐年增加。芝麻中脂肪酸含量豐富，主要由亞油酸和油酸組成，其比例分別占芝麻脂肪酸總量的44.32％和42.18％。

亞油酸屬ω-6系不飽和脂肪酸，是其他不飽和脂肪酸的前體，是人和動物營養中必需的脂肪酸，具有重要的生理功能。亞油酸參與磷脂的合成并以磷脂的形式作為線粒體和細胞膜的重要成分，促進膽固醇和類脂質的代謝，合成前列腺素的前體，保護皮膚免受由x射線引起的損害，有利于促進動物精子的形成等。除此之外，亞油酸還有助于生長、發育以及妊娠。人體缺乏亞油酸會出現生長過緩甚至停滯以及皮膚損傷等癥狀，因此說，亞油酸是最為有效、也最為普遍的ω-6脂肪酸。對人體主要功能還包括降血脂，預防動脈硬化、高膽固醇血癥和高血脂癥的作用以及提高細胞免疫功能的作用。同時，亞油酸在工業上應用也較多，亞油酸的鈉鹽或鉀鹽是肥皂的成分之一，并可用作乳化劑等表面活性劑。

油酰磷脂酰膽堿去飽和酶(l-acyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine△12-desaturase，fad2)，存在于內質網上，其可以催化單不飽和脂肪酸脫氫形成第二個雙鍵，雙鍵位于脂肪酸烴鏈的第12個碳位置上，是形成多不飽和脂肪酸的第一步反應，主要催化油酸轉化為亞油酸，對植物油中油酸和亞油酸的含量、比例均具有調控作用，是植物脂肪酸代謝通路中的關鍵酶。fad2基因是油酰磷脂酰膽堿去飽和酶(fad2酶)的編碼基因，故其是調控植物中油酸轉化為亞油酸的關鍵基因。目前，多種植物中的fad2基因被分離得到，包括油菜、花生、大豆、向日葵、玉米等食用油農作物，也包括擬南芥、煙草、菠菜等非食用油作物，以及橄欖、蓖麻等木本植物。khadake等(2009)發現亞麻lufad2-2和lufad2被轉化到釀酒酵母中，兩基因在釀酒酵母中表達，并具有油酸轉化為亞油酸的作用。okuley(1994)等在擬南芥中發現fad2基因，并將其分離克隆出來，通過研究得出：fad2是編碼油酸去飽和酶的重要基因，在植物的整個生長發育期均有表達。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題包括提供一種(sesamumindicuml.)亞油酸含量相關的芝麻基因sifad2、編碼蛋白及應用。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

提供一種亞油酸含量相關的芝麻基因sifad2，該基因的核苷酸序列為seqidno.1所示，或為由該序列在添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而產生的具有同等功能的核苷酸序列。通過將亞油酸含量相關芝麻基因sifad2在釀酒酵母和擬南芥中的過量表達，發現此基因可顯著提高釀酒酵母細胞和植物種子的亞油酸含量，為微生物亞油酸含量分泌和植物品質改良提供基因資源。

提供一種芝麻sifad2蛋白，其具有如seqidno.2所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本發明包括通過各種方法獲得的、如seqidno.2所示氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白質以及編碼這些衍生蛋白質的基因。

本發明還包括含有sifad2核苷酸序列的克隆載體或各類表達載體、含有所述載體的宿主細胞如含有所述核苷酸序列或其片段的轉化釀酒酵母細胞。

sifad2基因構建到表達載體pyes2。通過熱激轉化方法，將pyes2攜帶的sifad2基因轉入釀酒酵母細胞中，獲得釀酒酵母轉化細胞。實驗結果表明，sifad2具有提高釀酒酵母細胞的亞油酸含量的作用。本發明將sifad2基因構建到表達載體pbi121。通過農桿菌介導轉化方法，將pbi121攜帶的sifad2基因轉入擬南芥，獲得擬南芥轉化植株。實驗結果表明，sifad2具有提高植物種子亞油酸含量的作用。本發明還提供上述sifad2基因、載體或宿主細胞在調節釀酒酵母細胞亞油酸含量中的應用。

本發明還提供上述sifad2基因、載體或宿主細胞在調節植物種子亞油酸含量中的應用。

本發明所述的一種提高亞油酸含量的芝麻基因sifad2獲得方法，包括如下步驟：

(1)從國家芝麻中期庫保存的7910份國內外資源中根據產量相關性狀的表型、地理來源和遺傳多樣性檢測結果，采取逐級取樣策略，選取了705份芝麻材料進行重測序分析；

(2)利用illuminahiseq2500測序平臺，用2×76雙末端測序法對705份芝麻材料進行低覆蓋度的全基因組重測序，獲得了2.6倍覆蓋的基因組序列；

(3)結合種質資源群體中的種子亞油酸含量數據、基因型數據和群體結構，采用emmax軟件包和peal程序對芝麻相關性狀進行全基因組關聯分析，在p＝10^-4.65水平檢測到1個位于6號連鎖群上3279380的位置與芝麻亞油酸含量顯著關聯的標記位點，解釋8.7％的表型變異；(4)通過芝麻參考基因組(http://ocri-genomics.org/sinbase/index.html)比對和基因注釋分析，發現距離顯著關聯標記位點24428bp的位置存在sin_1009785基因，該基因的擬南芥同源基因為fad2，是擬南芥亞油酸合成基因，因此，推測該基因可能與芝麻亞油酸含量相關，命名為sifad2；

(5)根據sifad2基因的cds序列，利用primer5.0設計可以擴增其完整cds序列的引物，引物序列及名稱如下：

sifad2-f：5’-cccgggatgggagccggagg-3’

sifad2-r：5’-gagctctcagaacttgttct-3’；

(6)取中芝13發育25天的蒴果，提取種子總rna，逆轉錄生成cdna，以反轉后的cdna為模板，利用步驟(5)中的引物sifad2-f/r進行rt-pcr擴增，將擴增得到的片段進行測序，獲得提高亞油酸含量相關的芝麻sifad2基因序列，如seqidno.1所示；

(7)通過上述方法獲得了亞油酸含量相關芝麻基因sifad2，采用一種提高sifad2表達活性的轉基因釀酒酵母細胞和擬南芥，其特征在于轉基因釀酒酵母細胞和轉基因植物表現為sifad2含量增加，比受體對照(非轉基因釀酒酵母和植株)的細胞和種子亞油酸含量有所提高。

克隆本發明中所述的亞油酸含量相關的基因sifad2的方法是本領域中所常用的方法。提取植物葉片dna是常用的分子生物學技術，提取mrna的方法也有多種成熟的技術，試劑盒(easyspinplusplantrnakit)可從商業途徑獲得(購于aidlabbiotechnologiesco.,ltd)。構建本發明中所述的載體和將載體轉入植株所用到的酶切、連接、酵母轉化、花序侵染等方法也是本領域中常用技術。其中所涉及的質粒(pbi121和pyes2)，轉染用媒體(如釀酒酵母菌株invsc1、根癌農桿菌gv3101和所用試劑成分如蔗糖、卡那霉素等)可從商業途徑獲得。

與現有技術相比，本發明的優點在于：

本發明是國內外首次公開報道了亞油酸含量相關芝麻基因sifad2序列，存在于內質網上，本發明中的亞油酸含量相關基因sifad2及其編碼蛋白，與擬南芥同源基因(at3g12120.2，fad2)同源度分別為73％和74％。通過其過量表達可提高釀酒酵母細胞和植物種子亞油酸含量。本發明實驗結果表明轉基因釀酒酵母和擬南芥sifad2的含量與受體對照(非轉基因酵母細胞和植株)相比均有很大程度的提高，酵母細胞和擬南芥種子亞油酸含量也因此得到提高。因此本發明提出可利用sifad2的過量表達來提高微生物細胞的亞油酸含量，改良微生物菌株的出油品質；以及利用sifad2的過量表達來提高植物種子的亞油酸含量以便用于油料作物高亞油酸品種的選育，由此來提高食用油的品質，改善人們膳食營養。

附圖說明

圖1為含sifad2基因的釀酒酵母表達載體pyes2-fad2的構建；

圖2轉sifad2基因酵母菌株的pcr鑒定結果示意圖(m：marker；1-7：陰性菌株；8-10：陽性菌株；空：轉空載體菌株)；

圖3陽性酵母菌株定量表達驗證結果圖；

圖4氣相色譜法測定轉sifad2基因酵母各脂肪酸組分含量以及總脂肪酸含量；

圖5為含sifad2基因的植物表達載體pbi121-fad2的構建；

圖6轉sifad2基因擬南芥t1代陽性植株的篩選結果示意圖；

圖7轉sifad2基因擬南芥t1代的pcr鑒定結果示意圖(m：marker；1-14：轉基因t1代植株；陽：陽性對照；陰：陰性對照)；

圖8轉sifad2基因擬南芥t2代陽性植株的篩選結果示意圖；

圖9轉sifad2基因擬南芥t2代的pcr鑒定結果示意圖(m：marker；1-25：轉基因t2代植株)；

圖10轉sifad2基因擬南芥t2代種子定量表達驗證結果圖；

圖11氣相色譜法測定轉sifad2基因擬南芥種子各脂肪酸組分含量以及總脂肪酸含量。

具體實施方式

通常按照常規條件如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)，或draper等人(blackwell科學出版社，1988)所述的條件，或按照所用試劑制造廠商所建議的條件。

實施例1：亞油酸相關芝麻基因sifad2的獲得

本發明所述的一種提高亞油酸含量相關芝麻基因sifad2獲得方法，包括如下步驟：

(1)從國家芝麻中期庫保存的7910份國內外資源中根據產量相關性狀的表型、地理來源和遺傳多樣性檢測結果，采取逐級取樣策略，選取了705份芝麻材料進行重測序分析；

(2)利用illuminahiseq2500測序平臺，用2×76雙末端測序法對705份芝麻材料進行低覆蓋度的全基因組重測序，獲得了2.6倍覆蓋的基因組序列；

(3)結合種質資源群體中的種子亞油酸含量數據、基因型數據和群體結構，采用emmax軟件包和peal程序對芝麻相關性狀進行全基因組關聯分析，在p＝10^-4.65水平檢測到1個位于6號連鎖群上3279380的位置與芝麻亞油酸含量顯著關聯的標記位點，解釋8.7％的表型變異；

(4)通過芝麻參考基因組(http://ocri-genomics.org/sinbase/index.html)比對和基因注釋分析，發現距離顯著關聯標記位點24428bp的位置存在sin_1009785基因，該基因的擬南芥同源基因為fad2，是擬南芥亞油酸合成基因，因此，推測該基因可能與芝麻亞油酸含量相關，命名為sifad2；

(5)根據sifad2基因的cds序列，利用primer5.0設計可以擴增其完整cds序列的引物，引物序列及名稱如下：

sifad2-f：5’-cccgggatgggagccggagg-3’

sifad2-r：5’-gagctctcagaacttgttct-3’；

(6)取中芝13發育25天的蒴果，提取種子總rna，逆轉錄生成cdna，以反轉后的cdna為模板，利用步驟(5)中的引物sifad2-f/r進行rt-pcr擴增，將擴增得到的片段進行測序，獲得亞油酸含量的芝麻基因sifad2，其序列為seqidno.1所示。

實施例2：一種提高亞油酸含量的芝麻基因sifad2在提高釀酒酵母細胞亞油酸含量中的應用

1)將實施例1克隆得到的亞油酸含量相關的基因sifad2利用同源重組的方法與pyes2(vazyme公司)質粒連接構建植物表達載體，命名為pyes2-fad2(圖1)；

2)將步驟1)中制備的載體pyes2-fad2轉入釀酒酵母invsc1中(invitrogen公司)；

3)轉基因酵母陽性檢測

挑取步驟2)中獲得的酵母單克隆5-10個到sd-u基礎培養基中，30℃振蕩過夜培養，提取酵母質粒，利用sifad2-1f/1r引物，對挑取的轉基因酵母單克隆和轉空載體酵母進行pcr檢測(圖2)，獲得轉基因陽性酵母(圖2中的1-7號菌株)。

酵母質粒提取方法參照北京天根生物技術公司酵母質粒小提試劑盒。

sifad2-1f：5’-gccgttcgttctccta-3’

sifad2-1r：5’-gtgcgtatctgtgatgttat-3’

4)陽性酵母菌株定量表達驗證

取陽性酵母菌株以及轉pyes2空載體釀酒酵母菌株為對照的同一批繁殖培養的菌株，通過誘導培養基誘導培養，利用easyspin酵母rna快速提取試劑盒(艾德萊生物)提取各菌液rna，并反轉錄cdna，以各自cdna為模板，以pyes2載體上的ura3基因為內參(pf：5’-gctggccgcatcttctcaaa-3’；pr：5’-tatcggctttattgctcaaa-3’)，進行qrt-pcr表達驗證。結果表明以轉pyes2空載體釀酒酵母菌株為對照，芝麻sifad2基因在3個酵母轉基因菌株中具有較大的差異表達，而在轉pyes2空載體酵母對照菌株中，沒有檢測到芝麻sifad2基因的表達(圖3)。表明芝麻的sifad2基因均轉化并插入到了相應酵母基因組中并得到了表達。

5)轉基因酵母亞油酸含量分析

分別挑取轉pyes2-fad2基因單克隆和轉pyes2空載體釀酒酵母菌株進行誘導培養基誘導培養，當od＝2.0時低溫離心收集菌體，收集的菌體于-80℃冷凍30min，并于冷凍干燥機中干燥，然后利用氣相色譜法分別測定轉基因酵母和轉pyes2空載體釀酒酵母菌株中的亞油酸含量。結果表明測試的轉sifad2基因的酵母菌株，較轉pyes2空載酵母菌株亞油酸(c18:2)含量都有顯著的升高(圖4)。通過芝麻sifad2基因的過量表達，酵母菌株中亞油酸含量明顯升高。

實施例3：一種提高亞油酸含量的芝麻基因sifad2在植物品質改良育種中的應用

1)將實施例1克隆得到的亞油酸含量相關的芝麻基因sifad2利用同源重組的方法與pbi121(vazyme公司)質粒連接構建植物表達載體，命名為pbi121-sad(圖5)；

2)將步驟1)中制備的載體pbi121-fad2轉入根癌農桿菌gv3101(invitrogen公司)，再導入擬南芥植株中；

3)篩選t1代陽性植株：

種植擬南芥t0代所收獲的種子，將t0代種子消毒，接種含卡那霉素的ms篩選培養基上篩選陽性植株(圖6，右圖是左圖局部放大圖)。篩選出的陽性植株的葉片dna提取后，利用實施例1步驟(5)中的pcr鑒定引物sifad2-f/r，進行轉基因植株的pcr分子鑒定(圖7)，最終確認基因已經轉入的t1代陽性植株。

4)轉基因植株t2代陽性檢測

將t1代陽性植株進行單株收種獲得t1代種子，繼續進行卡那霉素篩選獲得t2代陽性植株(圖8)，獲得的陽性植株移栽生長，提取葉片基因組dna利用實施例1步驟(5)中的目的基因引物sifad2-f/r進行pcr分子鑒定(圖9)，確定t2代陽性植株。

5)t2代陽性植株定量表達驗證

取t2代陽性植株以及未轉基因擬南芥野生型對照的同一生長時期的幼嫩角果，各自cdna為模板，以擬南芥β-actin為內參(af：5’-cccgctatgtatgtcgcca-3’；ar：5’-aaccctcgtagattggcacag-3’)，進行qrt-pcr表達驗證。結果表明以未轉基因的野生型擬南芥為對照，芝麻sifad2基因在3個擬南芥轉基因株系的角果中具有較大的差異表達，而在未轉基因對照擬南芥的角果中，沒有檢測到芝麻sifad2基因的表達(圖10)。表明芝麻的sifad2基因均轉化并插入到了相應擬南芥基因組中并得到了表達。

6)t2代陽性擬南芥種子亞油酸含量的測定

待t2代轉基因種子成熟后，收集種子，利用氣相色譜法分別測定擬南芥轉基因種子和未轉基因野生型擬南芥種子中亞油酸含量。結果表明與野生型擬南芥對照相比，本研究獲得的轉sifad2基因擬南芥株系亞油酸(c18:2)含量明顯升高(圖11)，表明芝麻sifad2基因的過量表達可以促進油酸向亞油酸轉化，從而提高植物種子的亞油酸含量。

sequencelisting

<110>中國農業科學院油料作物研究所

<120>一種亞油酸含量相關的芝麻基因及其應用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1152

<212>dna

<213>芝麻(sesamumindicuml.)

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gagagacttcaaatcttcatctccgatgctggtataattgctgctgtatgtgtgctttat720

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380