一種高產硒代甲硫氨酸釀酒酵母的構建及應用的制作方法

本發明屬于釀酒酵母工程技術領域，具體涉及一種釀酒酵母的met6過表達突變株的構建方法，還涉及met6過表達釀酒酵母突變株的應用。

背景技術：

硒是人體的必需元素之一，具有抗氧化，增強免疫，解毒，促進基礎代謝等功能。硒攝入不足會導致克山病，癌癥，心血管等一系列疾病。因此，硒的足夠攝入量對于人維持健康具有重要作用。中國營養學會制定了中國居民膳食硒的參考攝入量，提出成人膳食硒平均需要量為41μg/d，推薦攝入量為50μg/d。硒代甲硫氨酸是一種低毒性的有機硒化物，可以在人體和動物體內被代謝和保留，在營養方面優于其它硒化合物，是一種理想的硒補充劑。

作為發酵工業的主要菌種，釀酒酵母同時也具有強大的硒耐受性和富集能力。富硒能力高達3000μg/g，可將無機硒轉化為有機硒，其中90%以上的硒存在形式以硒代甲硫氨酸。富硒酵母由于食用安全性強、生物利用率高等優點而成為首選的補硒添加劑，被廣泛地應用于動物，家禽的飼養，以及人體的硒元素補充。

提升酵母富硒能力是一個重要課題，而傳統的解決方法一般從培養基成分的優化，培養條件的優化（溫度，轉速，通氣量，ph等）方面入手。本技術利用強大的酵母遺傳學操作系統，對胞內硒代甲硫氨酸合成進行進一步的調控，對細胞硒代謝進行了改造，從而提高了胞內硒代甲硫氨酸的合成能力。

met6基因編碼的甲硫氨酸合酶能夠催化同型半胱氨酸生成甲硫氨酸，是釀酒酵母胞內甲硫氨酸合成的主要途徑之一。目前未見對釀酒酵母met6基因進行改造提升胞內硒代甲硫氨酸的合成能力的報道。

技術實現要素：

本發明目的是構建一種釀酒酵母的met6過表達突變株，該突變株met6基因過表達，富硒時合成硒代甲硫氨酸的能力提高。

本發明的另一個目的在于提供了一種釀酒酵母的met6過表達突變株的構建方法，利用微生物遺傳學方法構建釀酒酵母細胞met6過表達突變株后，再將突變株用于富硒時高產硒代甲硫氨酸。

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術方案：

一種釀酒酵母的met6基因過表達突變株在提高硒代甲硫氨酸合成的應用。

一種釀酒酵母met6基因過表達突變株的構建方法，其步驟如下：通過同源重組將含有強啟動子的目的片段與酵母基因組上met6基因的啟動子區域交換，獲得met6過表達菌株。

一種釀酒酵母met6基因過表達突變株sz1的構建方法，其步驟如下：

釀酒酵母met6過表達突變株sz1構建：釀酒酵母基因同源重組敲除原理、引物設計、敲除片段轉化方法按照文獻所描述的方法進行（yeast,1998,14:953-962），該方法是目前釀酒酵母中基因敲除的通用方法；

1）引物設計：依據釀酒酵母met6基因序列（genbank:bk006943.1）設計引物：

上游引物met6-p1：

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下游引物met6-p2：

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2）pcr擴增：利用上游引物met6-p1和下游引物met6-p2對質粒psp72-ura3-pgal1（可通過addgene獲得）進行pcr擴增，獲得含釀酒酵母met6基因的啟動子上下游序列的gal1強啟動子片段；

3）met6基因的過表達：通過liac/peg的轉化方法將pcr擴增得到的敲除片段導入釀酒酵母by4742菌株細胞（by4742菌株來源于中國典型培養物保藏中心，可以通過購買獲得），并通過ura標記篩選得到具有ura合成基因的釀酒酵母的met6過表達突變株sz1（saccharomycescerevisiaesz1），此菌株已保藏，保藏單位：中國典型培養物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學，保藏日期：2017年6月12日，保藏編號cctccno：m2017326，分類命名：釀酒酵母sz1(saccharomycescerevisiaesz1)。

一種利用釀酒酵母的met6基因過表達突變株sz1在提高硒代甲硫氨酸合成的應用，其步驟是：

1）富硒過程：將met6過表達突變株sz1和by4742菌株分別從平板上接種于2mlypgal培養基（酵母提取物：1%，蛋白胨：2%，半乳糖：2%）中，200rpm/min，30°c振蕩培養24h；向培養基中添加終濃度為2.5mm的na2seo3，繼續200rpm/min，30°c振蕩培養24h，完成富硒；

2）胞內硒代甲硫氨酸的收集：收集硒化后的酵母細胞（0.5g，濕重），用pbs溶液洗滌后分裝至裝好酸洗玻璃珠（sigma）的凍存管，用mini-beadbeater-16型玻璃珠細胞破碎儀破碎細胞，震蕩1min，冰上孵育1min；離心后收集上清，加入200mg的trypsin和10×tcsbuffer（1mtris-clph7.5,100mmcacl2,5%sds）于37°c孵育18h；離心后上清用0.22μm濾膜過濾后，加入40mg的蛋白酶14于37℃孵育24h；離心后上清用0.22μm濾膜過濾后，利用尺寸排阻色譜除去未被完全消解的蛋白質（色譜柱為superdex200hr10/30column；儀器為島津公司色譜分離系統），其流動相組成為0.05mnah2po4-na2hpo4(ph7.2)，流動相流速為0.5ml/min，柱溫30°c，紫外檢測波長設定為220nm和280nm，收集保留時間為80-89min及101-104.5min的樣品；

3）將收集的樣品繼續注入高效液相色譜-電感耦合等離子體-質譜儀(hplc-icp-ms)中進行進一步的確認，其流動相組成為甲酸/甲酸銨（25mm），0.1%（v/v）tfa，ph3.1，3%（v/v）甲醇；硒代甲硫氨酸標準品購于sigma公司；得到野生型釀酒酵母細胞by4742和met6過表達突變株sz1富硒后胞內的硒代甲硫氨酸含量分別為7.806μg/gsemet和21.15μg/gsemet。

本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果：

本發明首次將釀酒酵母met6基因和釀酒酵母富硒相關聯。利用強大的酵母遺傳學操作系統，構建了met6過表達突變株sz1，過表達met6基因，對胞內硒代甲硫氨酸合成進行進一步的調控，對細胞硒代謝進行了改造，從而提高了胞內硒代甲硫氨酸的合成能力。該菌株富硒后胞內的硒代甲硫氨酸含量相對于野生型酵母細胞提升至少2倍。

附圖說明

圖1為一種pcr鑒定met6基因重組菌株sz1的電泳示意圖。

通過met6基因啟動子特異性同源重組驗證引物進行pcr，可以發現，在sz1模板的泳道中出現了大小為2200bp的特異性擴增條帶。

具體實施方式

下面以一種高產硒代甲硫氨酸富硒釀酒酵母的構建及應用為例，參照附圖進一步闡述本發明。

釀酒酵母by4742菌株和質粒psp72-ura3-pgal1來源于中國典型培養物保藏中心。

【實施例1】一種釀酒酵母met6過表達突變株sz1的構建方法

釀酒酵母met6過表達突變株sz1構建：釀酒酵母基因同源重組敲除原理、引物設計、敲除片段轉化方法按照文獻所描述的方法進行（yeast,1998,14:953-962），該方法是目前釀酒酵母中基因敲除的通用方法；

1）引物設計：依據釀酒酵母met6基因序列（genbank:bk006943.1）設計引物：

上游引物met6-p1：

tttttgttaaactcttcctttatcataaaaaagcaagcatctaagagcataaagggaataagggcgacac；

下游引物met6-p2：

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2）pcr擴增：利用上游引物met6-p1和下游引物met6-p2對質粒psp72-ura3-pgal1（可通過addgene獲得）進行pcr擴增，獲得含釀酒酵母met6基因的啟動子上下游序列的gal1強啟動子片段；

3）met6基因的過表達：通過liac/peg的轉化方法將步驟2）pcr擴增得到的敲除片段導入釀酒酵母by4742菌株細胞（by4742菌株來源于中國典型培養物保藏中心，可以通過購買獲得），并通過ura標記篩選得到具有ura合成基因的釀酒酵母的met6過表達突變株sz1（saccharomycescerevisiaesz1），保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno:m2017326。

【實施例2】一種利用釀酒酵母的met6過表達突變株在提高硒代甲硫氨酸合成的應用

將met6過表達突變株sz1和by4742菌株分別從平板上接種于2mlypgal培養基（酵母提取物：1%，蛋白胨：2%，半乳糖：2%）中，200rpm/min，30°c振蕩培養24h；向培養基中添加終濃度為2.5mm的na2seo3，繼續200rpm/min，30°c振蕩培養24h，完成富硒。收集硒化后的酵母細胞（0.5g，濕重），用pbs溶液洗滌后分裝至裝好酸洗玻璃珠（sigma）的凍存管，用mini-beadbeater-16型玻璃珠細胞破碎儀破碎細胞，震蕩1min，冰上孵育1min；離心后收集上清，加入200mg的trypsin和10×tcsbuffer（1mtris-clph7.5,100mmcacl2,5%sds）于37°c孵育18h。離心后上清用0.22μm濾膜過濾后，加入40mg的蛋白酶14于37℃孵育24h。離心后上清用0.22μm濾膜過濾后，利用尺寸排阻色譜除去未被完全消解的蛋白質（色譜柱為superdex200hr10/30column；儀器為島津公司色譜分離系統），其流動相組成為0.05mnah2po4-na2hpo4(ph7.2)，流動相流速為0.5ml/min，柱溫30°c，紫外檢測波長設定為220nm和280nm，收集保留時間為80-89min及101-104.5min的樣品。

將收集的樣品繼續注入高效液相色譜-電感耦合等離子體-質譜儀(hplc-icp-ms)中進行進一步的確認，其流動相組成為甲酸/甲酸銨（25mm），0.1%（v/v）tfa，ph3.1，3%（v/v）甲醇。硒代甲硫氨酸標準品購于sigma公司。得到野生型釀酒酵母細胞by4742和met6過表達突變株sz1富硒后胞內的硒代甲硫氨酸含量分別為7.806μg/gsemet和21.15μg/gsemet。

以上描述是對本發明的解釋，不是對本發明的限定，本發明所限定的范圍參見權利要求，在不違背本發明的精神的情況下，本發明可以做任何形式的修改。

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