DNA/RNA病毒PCR實時增強反應試劑盒、檢測試劑及其使用方法與流程

本發明涉及的dna/rna病毒pcr實時增強反應試劑盒、檢測試劑及其使用方法，屬于檢測領域。本發明針對來源于唾液、糞便、血液、鼻腔分泌物dna/rna病毒樣本，無需做提取和純化步驟，無需做水浴煮沸步驟，無需做高溫預加熱處理步驟，本試劑盒試劑促進dna/rna從病毒顆粒中釋放出來，實時增強pcr反應，病毒樣本最低檢出濃度為1拷貝。

背景技術：

聚合酶鏈式反應(pcr)是一種有用的工具，用于食品、環境、臨床樣本的快速檢測。典型的pcr反應需要對樣本進行dna提取和純化的前處理步驟，去除掉眾多的抑制pcr反應的因素，這一前處理步驟通常需要1至2小時完成。

常用的dna病毒提取方法：(1)蛋白酶k---苯酚抽提法，蛋白酶k在edta存在下消化蛋白質或多肽分子，sds(十二烷基磺酸鈉)將細胞膜裂解，苯酚/氯仿反復抽提，使核蛋白變性降解，使dna從核蛋白中游離出來；(2)堿裂解法，naoh溶解細胞，tris-hcl溶液調節適當ph值，edta螯合ca2+和mg2+等二價金屬離子，抑制dnase(dna酶)的活性，sds與醋酸鉀形成蛋白質沉淀，然后用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，進行酒精沉淀才能得到質量穩定的dna；(3)煮沸法，采用沸水高溫處理10分鐘，蛋白在高溫下變性，在edta螯合劑，sds，tris-hcl溶液中沉淀，離心取上清液。

常用的rna病毒提取方法：(1)異硫氰酸胍提取法，利用高濃度異硫氰酸胍使蛋白質變性，迅速破壞細胞結構，使核蛋白與rna分離，釋放出rna。再通過酚，氯仿等有機溶劑抽提，離心，使rna與其他細胞組分分離，得到純化的總rna。提取緩沖液中含有sds，酚，氯仿，胍鹽等蛋白質變性劑，能夠內源和外源的rnase活性，保護rna分子不被降解。(2)trizol法,主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質，但不能完全抑制rna酶活性，因此trizol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源rnase(rna酶)。trizol在細胞和組織樣品裂解或勻漿過程中，能保持總rna完整性，加入氯仿后，溶液分為水相和有機相，總rna在水相中。取出水相，用異丙醇可沉淀回收總rna。

現有的dna/rna病毒提取方法的缺點一是操作步驟繁瑣，耗費時間，不利于現場樣本的快速檢測；缺點二是現有提取方法采用的離子型變構劑sds，金屬螯合劑edta，殘留液會抑制下一步pcr酶活性，提高了最低檢測樣本濃度的閾值。

本發明欲提供一種全新的pcr實時增強反應試劑盒，用于檢測dna/rna病毒樣本，

技術實現要素：

本發明的pcr實時增強反應試劑盒的檢測試劑，由5種成分混合組成：乙基苯基聚乙二醇、溶菌酶、海藻糖、三水醋酸鈉，以水為溶劑。

本發明的pcr實時增強反應試劑盒中乙基苯基聚乙二醇濃度為0.5％至3％，最佳濃度為1％。乙基苯基聚乙二醇(nonidetp-40；nonaethyleneglycoloctylphenylether)為非離子型表面活性劑，與蛋白結合力強，用于防止物質分子疏水間相互作用，確保蛋白的充分溶解和結構穩定。尤其用于膜蛋白的非變性條件下的溶解。

本發明的pcr實時增強反應試劑盒中溶菌酶濃度為10ug/ml至200ug/ml，最佳濃度為10ug/ml。溶菌酶(lysozyme)可與帶負電荷的病毒蛋白直接結合，與dna、rna、脫輔基蛋白形成復鹽，通過破壞n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，病毒顆粒破裂內容物逸出。

本發明的pcr實時增強反應試劑盒中海藻糖濃度為0.1mol/l至1mol/l，最佳濃度為0.3mol/l。海藻糖是蛋白酶的保護劑，穩定蛋白的構象，在pcr反應循環的升溫過程中保護溶菌酶的活性。

本發明的pcr實時增強反應試劑盒中三水醋酸鈉濃度為1mmol/l至5mmol/l，最佳濃度為1mmol/l。三水醋酸鈉是試劑盒溶液ph值的調節劑和緩沖劑。

本發明的pcr實時增強反應試劑盒中的水為雙蒸水、注射用水或無菌水。以不宜帶入金屬為佳，以免影響檢測效果。

本發明的pcr實時增強反應試劑盒，其使用方法按照常規反應試劑盒操作即可：將病毒樣本與試劑盒檢測試劑混合，離心，取上清液，加入到pcr管中，直接做pcr擴增反應。pcr反應每一循環的升溫過程，本試劑盒試劑促進dna/rna從病毒顆粒中釋放出來，實時增強pcr反應。其中，混合病毒樣本與試劑盒檢測試劑以總量便于離心即可。一般按照病毒樣本與試劑盒檢測試劑體積比1:1-3混合，若病毒樣本量多，則優選病毒樣本與試劑盒檢測試劑體積比1:1混合，若病毒樣本量少，則采用試劑盒檢測試劑補量以總量便于離心即可。

本發明的pcr實時增強反應試劑盒，其適用樣本類型包括唾液、糞便、血液、鼻腔分泌物dna/rna病毒樣本。唾液樣本采用棉簽試子刮取，將試子放于本發明的pcr實時增強反應試劑中，渦旋振蕩，即可做pcr反應模板。糞便樣本采用棉簽試子刮取，將試子放于本發明的pcr實時增強反應試劑中，渦旋振蕩，10000rpm離心2分鐘，去除雜質，取上清液作為pcr反應模板。血液樣本采用普通采血管采血，離心取上層血清，與本發明的pcr實時增強反應試劑等比混合，作為pcr反應模板。鼻腔分泌物樣本采用棉簽試子刮取，將試子放于本發明的pcr實時增強反應試劑中，渦旋振蕩，10000g離心2分鐘，去除雜質，取上清液作為pcr反應模板。

本發明的pcr實時增強反應試劑盒，無需做提取和純化步驟，無需做水浴煮沸步驟，無需做高溫預加熱處理步驟，pcr實時增強反應試劑盒的病毒樣本檢出效率高，病毒樣本最低檢出濃度為1拷貝。本發明的pcr實時增強反應試劑盒節省病毒樣本檢測時間和勞動力，適合現場樣本的實時快速檢測的需求。

附圖說明

圖1四種表面活性劑篩選實驗，采用熒光定量pcr儀器檢測每個表面活性劑對pcr反應的影響。表面活性劑的濃度都為1％，乙基苯基聚乙二醇(np40)和聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)對pcr反應沒有影響，而十二烷基硫酸鈉(sds)和醋酸氯已定明顯抑制pcr反應。

圖2五個濃度梯度的乙基苯基聚乙二醇(np40)篩選實驗，采用熒光定量pcr儀器檢測不同濃度梯度的乙基苯基聚乙二醇對pcr反應的影響。pcr擴增曲線從高到低的濃度梯度順序依次為1％，0.5％，2％，3％，5％。

圖3溶菌酶與蛋白酶k的篩選實驗，采用熒光定量pcr儀器檢測不同含量的酶對pcr反應的影響。10ug/ml、100ug/ml、200ug/ml的溶菌酶對pcr反應沒有影響，其中，10ug/ml的溶菌酶含量效果最好。而10ug/ml、100ug/ml的蛋白酶k明顯抑制pcr。

圖4犬細小病毒cpv2定量pcr檢測結果分析；bio-radcfx96熒光定量pcr儀，rfu，相對熒光強度；cycle，每30秒一個循環。從左至右，cpv2模版濃度依次為①10⁷拷貝,②10⁶拷貝，③10⁵拷貝，④10⁴拷貝，⑤10³拷貝，⑥10²拷貝，⑦10拷貝，⑧1拷貝；1個模版的情況下，本發明的pcr實時增強反應試劑盒也能夠檢測出來。

圖5犬細小病毒cpv-2基因片段pcr產物凝膠電泳圖片；m,dna分子量標準品；樣本1和樣本2是犬唾液樣本，樣本3和樣本4是犬糞便樣本，樣本5和樣本6是犬血清樣本；犬細小病毒cpv-2基因片段大小為210bp。

具體實施方式

以下結合附圖，通過具體實施方式對本發明進行詳細說明。

本發明的pcr實時增強反應試劑成分篩選實驗：

(1)醋酸氯已定，十二烷基硫酸鈉(sds)，聚乙二醇辛基苯基醚，乙基苯基聚乙二醇等四種表面活性劑的篩選實驗。

材料和方法：

犬細小病毒唾液樣本，四川成都寶興寵物醫院提供，并臨床診斷為感染犬細小病毒的樣本。病毒dna試劑盒提取，采用tianampvirusdna/rnakit試劑盒，按照說明書進行操作。提取出來的dna模版分成4組，第1組加入1％的醋酸氯已定，第2組加入1％的十二烷基硫酸鈉，第3組加入1％的聚乙二醇辛基苯基醚，第4組加入1％的乙基苯基聚乙二醇。

上游引物序列cpv-f：caattggaggtaaaacaggaattaactata(seqidno.1)；

下游引物序列cpv-r：ttatcccaaatttgaccatttggataaact(seqidno.2)。

bio-radcfx96熒光定量pcr儀，solarbio公司2×sybrgreenpcr試劑盒，本試劑盒預混有緩沖液、dntp、hotstarttaqdna聚合酶、sybrgreeni染料和mgcl2，按試劑盒說明書操作加樣，上下游引物各加2.5ul，終濃度0.5um，模板2ul，加水至體積20ul。定量pcr擴增參數設置：94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘,72℃1分鐘,40個循環。

實驗結果：

定量pcr檢測結果如圖1所示，乙基苯基聚乙二醇和聚乙二醇辛基苯基醚對pcr反應沒有影響，而十二烷基硫酸鈉和醋酸氯已定明顯抑制pcr反應。

討論：

醋酸氯已定，陽離子表面活性劑，破壞細胞膜的作用強烈，但醋酸氯已定會抑制pcr聚合酶的活性，0.3％濃度醋酸氯已定完全抑制pcr聚合酶的活性。

十二烷基硫酸鈉(sds)，陰離子表面活性劑，與膜蛋白疏水部分結合并使其與膜分離，改變蛋白質的構象，但十二烷基硫酸鈉嚴重抑制pcr聚合酶活性，0.1％濃度乙二胺四乙酸完全抑制pcr聚合酶活性。

聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)，非離子型表面活性劑，破壞細胞膜的作用強烈，但聚乙二醇辛基苯基醚具有發泡功能，pcr反應過程中產生很多小水泡，不利于后期實驗。

乙基苯基聚乙二醇(nonidetp-40；nonaethyleneglycoloctylphenylether)是非離子型去垢劑，與蛋白結合力強，1％濃度基本可以破壞掉細胞膜，尤其用于膜蛋白的非變性條件下的溶解。0.5％至5％的濃度對pcr聚合酶無明顯的抑制作用。

結論：

經過對比篩選實驗，本發明的pcr實時增強反應試劑中表面活性劑成分選用乙基苯基聚乙二醇。

(2)表面活性劑乙基苯基聚乙二醇的濃度優化實驗。

材料和方法：

dna模版的提取方法同(1)，提取出來的dna模版分成5組，從第1組到第5組分別加入0.5％、1％，2％，3％，5％的乙基苯基聚乙二醇。

實驗方法同(1)。

實驗結果：

定量pcr檢測結果如圖2所示，pcr擴增曲線從高到低的濃度梯度順序依次為1％，0.5％，2％，3％，5％。

結論：

經過乙基苯基聚乙二醇濃度優化實驗，本發明的pcr實時增強反應試劑成分乙基苯基聚乙二醇的最優濃度為1％。

(3)溶菌酶和蛋白酶k的篩選實驗

材料和方法：

dna模版的提取方法同(1)，提取出來的dna模版分成5組，第1組加入10ug/ml的溶菌酶，第2組加入100ug/ml的溶菌酶，第3組加入200ug/ml的溶菌酶，第4組加入10ug/ml的蛋白酶k，第5組加入100ug/ml的蛋白酶k。

實驗方法同(1)。

實驗結果：

定量pcr檢測結果如圖3所示，10ug/ml、100ug/ml、200ug/ml的溶菌酶對pcr反應沒有影響，其中，10ug/ml的溶菌酶含量效果最好。而10ug/ml、100ug/ml的蛋白酶k明顯抑制pcr。

討論：

蛋白酶k，活性強，水解蛋白完全，但需在60℃處理樣本1至2小時，同時，蛋白酶k也會水解pcr聚合酶，使聚合酶失去活性。

溶菌酶，又稱胞壁質酶，主要通過破壞細胞壁中n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，病毒顆粒破裂內容物逸出。而且溶菌酶不會破壞pcr聚合酶的結構，因此可以與聚合酶混合使用。

結論：本發明的pcr實時增強反應試劑成分中選用溶菌酶，濃度在10ug/ml至200ug/ml之間時對pcr聚合酶的活性無明顯的影響。

(4)保護劑的選取，保護劑在pcr反應的高溫解離步驟中，穩定酶的結構，起到保護作用，同時也具有擁擠劑作用，使得pcr實時增強反應試劑中各種成分在溶液空間中接觸更近，發生化學反應的概率更高。

單糖，例如葡萄糖，穩定蛋白的構象，增強酶與底物的結合，但葡萄糖溶液易滋生細菌，在試劑盒生產過程不便于對試劑進行滅菌操作。

雙糖，例如蔗糖和海藻糖，常用的酶保護劑，在pcr反應的高溫解離步驟中溫度上升至95℃，在高溫環境條件下海藻糖比蔗糖的保護作用更好。

因此，本發明的pcr實時增強反應試劑成分選用海藻糖作為保護劑，濃度在0.1mol/l至1mol/l，最佳濃度在0.3mol/l。

(5)緩沖液的選取。

本發明的pcr實時增強反應試劑成分選用三水醋酸鈉為緩沖液，三水醋酸鈉安全性好，濃度在1mmol/l至5mmol/l之間，最佳濃度在1mmol/l。

本實施例中pcr實時增強反應試劑成分及含量組成：乙基苯基聚乙二醇溶液1％，溶菌酶10ug/ml，海藻糖0.3mol/l，三水醋酸鈉1mmol/l，溶劑為水。

實施例

本發明用于犬細小病毒2型基因快速檢測，犬細小病毒病是犬的一種具有高度接觸性傳染的烈性傳染病。臨床上以急性出血性腸炎和心肌炎為特征。

犬細小病毒對犬具有高度的接觸性傳染性，各種年齡的犬均可感染。但以剛斷乳至90日齡的犬發病較多，病情也較嚴重。據臨床幼犬有的可呈現心肌炎癥狀而突然死亡。本病一年四季均可發生，但以天氣寒冷的冬春季多發。病犬的糞便中含毒量最高。

犬細小病毒是一種單鏈dna病毒，cpv-2是繼binn等1967年從犬中分離到的第二種細小病毒，它與binn早期從健康犬分離的犬極小病毒(minutevirusofcanine，mvc)在致病性上顯著不同，抗原性上也有明顯差異。cpv-2在家犬和犬科其他成員間具有高度傳染性。感染cpv-2發展為急性胃腸炎，臨床癥狀表現食欲不振，嘔吐，發熱，出血性腹瀉和白細胞減少，具有高發病率與死亡率。

(1)樣本收集

四川成都寶興寵物醫院，雜交犬，雄性，4個月，經臨床診斷感染犬細小病毒。

唾液病毒樣本采集，采用棉簽試子從犬口腔中沾取，將試子放于1.5ml離心管中，加入本發明的pcr實時增強反應試劑200ul，渦旋振蕩，作為pcr反應模板。

血液病毒樣本采集，采血針，100-200ul血樣，普通采血管收集，離心取上清液20ul，與本發明的pcr實時增強反應試劑等比混合，作為pcr反應模板。

糞便病毒樣本采集，用棉簽試子插入直腸，試取內容物，放入1.5ml離心管中，加入600ul與本發明的pcr實時增強反應試劑，渦旋振蕩15秒，10000g離心2分鐘，取上清液pcr反應模板。

(2)引物設計

根據genbankcpv-435病毒基因序列設計引物；

上游引物序列cpv-f：caattggaggtaaaacaggaattaactata(seqidno.1)；

下游引物序列cpv-r：ttatcccaaatttgaccatttggataaact(seqidno.2)。

引物序列由擎科生物技術有限公司合成。

(3)pcr擴增

大連寶生物takaraextaq試劑盒，按試劑盒說明書操作加樣，上下游引物各加2.5ul，終濃度0.5um，模板2ul，加水至體積20ul，pcr反應參數設置：94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘,72℃1分鐘,30個循環。

(4)定量pcr檢測結果

bio-radcfx96熒光定量pcr儀，solarbio公司2×sybrgreenpcr試劑盒，本試劑盒預混有緩沖液、dntp、hotstarttaqdna聚合酶、sybrgreeni染料和mgcl2，按試劑盒說明書操作加樣，上下游引物各加2.5ul，終濃度0.5um，模板2ul，加水至體積20ul。定量pcr擴增參數設置：94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘,72℃1分鐘,40個循環。定量pcr檢測結果見圖4。

(5)電泳檢測結果

犬細小病毒cpv2的pcr產物凝膠電泳圖譜見圖5，樣本1和樣本2是犬唾液樣本，樣本3和樣本4是犬糞便樣本，樣本5和樣本6是犬血清樣本；犬細小病毒cpv-2基因片段大小為210bp。pcr產物條帶清晰明亮，說明采用本發明的pcr實時增強反應試劑盒，犬唾液、糞便和血清病毒樣本無需提取純化步驟，直接做pcr反應，就能擴增出目的dna序列片段。

(6)分析與結論

犬細小病毒cpv2定量pcr檢測結果分析，從左至右，cpv2模版濃度依次為①10⁷拷貝,②10⁶拷貝，③10⁵拷貝，④10⁴拷貝，⑤10³拷貝，⑥10²拷貝，⑦10拷貝，⑧1拷貝；1個模版的情況下，本發明的pcr實時增強反應試劑盒也能夠檢測出來。說明發明的pcr實時增強反應試劑盒，病毒樣本最低檢出濃度為1拷貝。

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