一種阿維拉霉素高產菌株的篩選方法與流程

本發明涉及微生物菌株篩選
技術領域：
，具體涉及一種阿維拉霉素高產菌株的篩選方法。
背景技術：
：阿維拉霉素(avilamycin)又稱為卑霉素，可通過與腸道內異生的革蘭氏陽性菌的核糖體結合，抑制相關蛋白的合成，從而維持整體益生菌群的生態平衡，同時還可通過抑制腸道微生物乳酸的產生，從而減少腸道蠕動，延遲營養物質在動物腸道的停留時間，起到促進消化與調節代謝的作用，從而促進動物生長。阿維拉霉素由于其獨特的結構、安全性高、易降解、基本無殘留、促生長及抗病等特性在動物飼料特別是豬和肉雞飼料當中得以廣泛應用。綠色產色鏈霉菌(streptomycesviridochromogene)是阿維拉霉素的產生菌。目前，全球阿維拉霉素的生產被美國禮來公司壟斷，其首先開發并進行銷售的10％預混劑類型,已在世界40多個國家登記上市。并且我國也在本世紀初將其引入，商品名為“效美素”(maxus)，而且目前禮來已經申請到阿維拉霉素20％預混劑，在飼料行業限抗的今天，其市場前景非常看好。2005年前后，國內開始有對阿維拉霉素菌株的選育及發酵條件的研究報道，然而，相關的研究尚處于初級階段，產素水平較低，而且發酵中雜質成分多，進而對后續分離純化帶來困難，增加生產成本，究其原因，還是菌株的發酵水平不行。如何獲得高效積累有效成分的優良菌株成為開發改產品的關鍵技術瓶頸。artp(atmosphericandroomtemperatureplasma，artp)誘變技術是指在常溫常壓環境下通過產生高活性的等離子體射流，致使細胞受到多樣性的損傷，從而起到基因突變的效果。artp生物育種技術正以其操作的簡便性、安全無毒性和高效性等特點得到了廣泛認可，并且在微生物育種領域的發揮著重要作用。s.viridochromogene作為一類放線菌，呈菌絲狀生長，并且以孢子繁殖，而且具有細胞壁，直接誘變處理，往往處理效果不好，而且會由于菌絲分散不均勻，導致誘變處理效果不佳，另外，孢子的特殊結構往往使得其對誘變劑不敏感，會形成很多的假陽性效果。技術實現要素：為解決上述問題，本發明提供了一種阿維拉霉素高產菌株的篩選方法。本發明首先制備綠色產色鏈霉菌原生質體，采用artr系統對原生質體進行誘變，結合誘變菌株的形態特征和菌落抑菌生物效價進行初篩，然后通過搖瓶復篩，以阿維拉霉素抑菌效價及阿維拉霉素a組分含量為指標進行篩選，篩選得到的菌株具有發酵穩定性高，阿維拉霉素產量高，而且有效組分含量高的優點。本發明降低了制備相關產品的成本，顯示了非常好的工業化應用潛力。本發明通過以下技術方案實現：一種阿維拉霉素高產菌株的篩選方法，包括以下步驟：s1.取活化培養好的綠色產色鏈霉菌斜面一支，作為出發菌株，加入4～6ml無菌生理鹽水洗脫，制備孢子懸液，并按4％～6％的接種量轉入含5％甘氨酸的裝有50ml種子培養基的250ml帶擋板三角搖瓶，27～29℃，210～230rpm繼續培養24h，培養結束后，將菌液5000～7000rpm，4℃離心5～10min，磷酸高滲緩沖液清洗兩次，棄去上清，得到原生質體制備的出發菌絲體；s2.以smm溶液作為滲透壓穩定劑，在步驟s1制備的出發菌絲體管中加入終濃度為9mgml-1～15mgml-1溶壁酶5ml，30℃條件下分別酶解45min～75min，溫育結束后，采用無菌脫脂棉過濾除去未酶解的菌絲，收集濾液，4℃，2000rpm離心10min，棄上清，然后再用smm溶液洗滌離心兩次，最后用3ml的smm溶液重懸細胞，得到原生質體懸液；s3.將步驟s2原生質體懸液置于無菌的試管中，進行artp誘變：預設以氦氣作為工作載氣，設定功率為115w，通氣量為10lmin-1，等離子發射源與樣品之間的距離為1～3mm，處理30～50s；s4.將步驟s3artp誘變處理后的原生質體涂布于再生平板并置于28℃恒溫培養箱培養3天，選擇菌落大小、形狀、外觀形態發生變化的單菌落轉接至另外的固體平板，27～29℃繼續恒溫培養2天，培養結束后采用滅過菌的的打孔器將單個菌落打下，并置于無菌濕潤的無菌小盤中繼續培養3天，至菌絲長滿培養基表面；然后取菌落小塊置于含有1％的檢菌的瓊脂平板上，37℃培養24h后觀察并測定瓊脂塊抑菌圈大小，同挑選抑菌圈比出發菌株大的菌株；s5.將步驟s4篩選獲得的菌落從斜面接種至種子搖瓶，然后再轉接發酵搖瓶，27～29℃，210～230rpm，振蕩培養72h，收集發酵液；取10ml發酵液至10ml離心管中，6000×g離心10min，棄上清，甲醇重懸后轉移至100ml容量瓶中，40khz頻率超聲40min，冷卻，甲醇定容，0.45μm過濾膜過濾，進行生物抑菌效價檢測，同時采用hplc法檢測阿維拉霉素a的含量，挑選出抑菌效價高，阿維拉霉素a的產量高的菌株。優選地，步驟s1中所述種子培養基配方及濃度為：可溶性淀粉20.0g/l，豆粕提取粉8.0g/l，大豆蛋白胨5.0g/l，d-木糖7.5g/l，caco30.5g/l，feso40.01g/l，mgso40.5g/l，mncl20.5g/l，naoh調節ph7.2-7.5。優選地，步驟s1中所述磷酸高滲緩沖液由0.1mol/lph6.0磷酸緩沖液中加入終濃度為0.8mol/l甘露醇制備而成。優選地，步驟s2中所述smm緩沖液由以下成分及含量組成：0.5mol/l蔗糖、20mol/lmgc12、0.02mol/l順丁烯二酸鈉鹽，naoh調ph6.5。優選地，步驟s2中加入12mgml-1溶壁酶5ml，30℃條件下酶解60min。優選地，步驟s3中artp誘變處理時間為40s。優選地，步驟s3再生平板中所用再生培養基為：可溶性淀粉20.0g/l，mgso40.35g/l，kno31.2g/l，k2hpo40.25g/l，kh2po40.55g/l，feso40.01g/l，nacl0.5g/l，瓊脂粉20.0g/l和110g/l的蔗糖，naoh調節ph7.2-7.5。優選地，步驟s4中所用檢菌為藤黃微球菌。優選地，步驟s5中發酵所用培養基為：可溶性淀粉20.0g/l，豆粕提取粉8.0g/l，大豆蛋白胨5.0g/l，d-木糖7.5g/l，l-纈氨酸3.0g/l，caco30.5g/l，feso40.01g/l，mgso40.5g/l，mncl20.5g/l，naoh調節ph7.2-7.5。本發明以活化斜面孢子懸液接種的搖瓶種子培養24h后獲得的菌體作為出發菌絲體，采用高效溶壁酶為去壁酶，最佳酶濃度為12mgml-1，最佳酶解時間為60min，所得的原生質體數不僅較多，而且質量最好，再生率最高。為獲得更多的細胞損傷，最大限度的獲得突變菌株庫，以制備的s.viridochromogeneavl4原生質體為研究對象，采用artp誘變系統對其進行誘變處理，在綜合考慮致死率及菌落數的條件下，選擇最佳的處理時間40s，并結合誘變菌株的形態特征和菌落抑菌生物效價進行初篩，獲得生物抑菌效價顯著提高的正突變株，然后通過搖瓶復篩，以阿維拉霉素抑菌效價及有效成分——阿維拉霉素a組分含量為指標，獲得抑菌效價最高，且阿維拉霉素a組分含量最高的菌株。與現有技術相比，本發明具有以下優點：(1)篩選得到的突變株搖瓶發酵條件下，阿維拉霉素抑菌效價較出發菌株提高19.3％，其中阿維拉霉素a組分含量提高6.4％，而且斜面轉接五代，搖瓶檢測生物抑菌效價，體現了較好的遺傳穩定性；(2)對突變株進行50l罐的發酵驗證，其阿維拉霉素抑菌效價最高達4500uml-1，較原始出發菌株avl4提高27.4％，而且展現了非常好的耐受惡劣環境的發酵特性；(3)本研究通過原生質體選育獲得的菌株體現了非常優良的性能，發酵穩定，發酵得到的阿維拉霉素產量高，而且有效組分含量高，降低了制備相關產品的成本，顯示了非常好的工業化應用潛力。說明書附圖圖1：突變株s251的50l罐發酵曲線；圖2：突變株s251發酵液中阿維拉霉素hplc分析圖譜。具體實施方式下面將結合說明書附圖和實施例進一步的詳細說明本發明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發明要求保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發明的保護范圍以所附權利要求書記載的內容為準。綠色產色鏈霉菌avl4(streptomycinviridochromogeneavl4)，搖瓶發酵效價為610uml-1，50l罐最高效價達3860uml-1，本公司研究院保存。檢菌：藤黃微球菌(micrococcusluteuscicc10209)，購自中國工業微生物菌種保藏中心。實施例1培養基及緩沖液的制備方法斜面及固體平板培養基(gl-1)：可溶性淀粉20.0，mgso40.35，kno31.2，k2hpo40.25，kh2po40.55，feso40.01，nacl0.5g/l，瓊脂粉20.0，naoh調節ph7.2-7.5，121℃滅菌20min，備用。種子培養基(gl-1)：可溶性淀粉20.0，豆粕提取粉8.0，大豆蛋白胨5.0，d-木糖7.5，caco30.5，feso40.01，mgso40.5，mncl20.5，naoh調節ph7.2-7.5，121℃滅菌25min，備用。發酵培養基(gl-1)：可溶性淀粉20.0，豆粕提取粉8.0，大豆蛋白胨5.0，d-木糖7.5，l-纈氨酸3.0，caco30.5，feso40.01，mgso40.5，mncl20.5，naoh調節ph7.2-7.5，121℃滅菌25min，備用。再生培養基(gl-1)：可溶性淀粉20.0，mgso40.35，kno31.2，k2hpo40.25，kh2po40.55，feso40.01，nacl0.5，瓊脂粉20.0和110的蔗糖，naoh調節ph7.2-7.5。檢菌液體培養基(gl-1)：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，nacl5.0g，naoh調節ph至7.0，121℃滅菌20min，備用。其中在液體培養基基礎上添加15.0gl-1的瓊脂粉即為固體培養基。磷酸鹽高滲緩沖液：0.1mol/lph6.0磷酸緩沖液.的基礎上加入終濃度為0.8mol/l甘露醇制備而成。smm緩沖液：0.5mol/l蔗糖、20mol/lmgc12、0.02mol/l順丁烯二酸鈉鹽，naoh調ph6.5，115℃min滅菌18min，備用。實施例2一種阿維拉霉素高產菌株的篩選方法所述阿維拉霉素高產菌株的篩選方法，包括以下步驟：s1.取活化培養好的綠色產色鏈霉菌種avl4斜面一支，作為出發菌株，加入5ml無菌生理鹽水洗脫，制備孢子懸液，并按5％的接種量轉入含5％甘氨酸的裝有50ml種子培養基的250ml帶擋板三角搖瓶，28℃，220rpm繼續培養24h，培養結束后，將菌液6000rpm，4℃離心10min，磷酸高滲緩沖液清洗兩次，棄去上清，得到原生質體制備的出發菌絲體；s2.以smm溶液作為滲透壓穩定劑，在步驟s1制備的出發菌絲體管中加入終濃度為12mgml-1溶壁酶5ml，30℃條件下分別酶解60min，溫育結束后，采用無菌脫脂棉過濾除去未酶解的菌絲，收集濾液，4℃，2000rpm離心10min，棄上清，然后再用smm溶液洗滌離心兩次，最后用3ml的smm溶液重懸細胞，得到原生質體懸液；s3.將步驟s2原生質體懸液置于無菌的試管中，進行artp誘變：預設以氦氣作為工作載氣，設定功率為115w，通氣量為10lmin-1，等離子發射源與樣品之間的距離為2mm，處理40s；s4.將步驟s3artp誘變處理后的原生質體涂布于再生平板并置于28℃恒溫培養箱培養3天，選擇菌落大小、形狀、外觀形態發生變化的單菌落轉接至另外的固體平板，28℃繼續恒溫培養2天，培養結束后采用滅過菌的的打孔器將單個菌落打下，并置于無菌濕潤的無菌小盤中繼續培養3天，至菌絲長滿培養基表面；然后取菌落小塊置于含有1％的檢菌的瓊脂平板上，37℃培養24h后觀察并測定瓊脂塊抑菌圈大小，挑選抑菌圈比出發菌株大的菌株；s5.將步驟s4篩選獲得的菌落從斜面接種至種子搖瓶，然后再轉接發酵搖瓶，28℃，220rpm，振蕩培養72h，收集發酵液；取10ml發酵液至10ml離心管中，6000×g離心10min，棄上清，甲醇重懸后轉移至100ml容量瓶中，40khz頻率超聲40min，冷卻，甲醇定容，0.45μm過濾膜過濾，進行生物抑菌效價檢測，同時采用hplc法檢測阿維拉霉素a的含量，挑選出抑菌效價高，阿維拉霉素a的產量高的菌株。所用培養基及緩沖液均按實施例1方法制得。實施例3一種阿維拉霉素高產菌株的篩選方法所述阿維拉霉素高產菌株的篩選方法，包括以下步驟：s1.取活化培養好的綠色產色鏈霉菌avl4斜面一支，作為出發菌株，加入4ml無菌生理鹽水洗脫，制備孢子懸液，并按4％的接種量轉入含5％甘氨酸的裝有50ml種子培養基的250ml帶擋板三角搖瓶，27℃，210rpm繼續培養24h，培養結束后，將菌液5000rpm，4℃離心5min，磷酸高滲緩沖液清洗兩次，棄去上清，得到原生質體制備的出發菌絲體；s2.以smm溶液作為滲透壓穩定劑，在步驟s1制備的出發菌絲體管中加入終濃度為9mgml-1溶壁酶5ml，30℃條件下分別酶解45min，溫育結束后，采用無菌脫脂棉過濾除去未酶解的菌絲，收集濾液，4℃，2000rpm離心10min，棄上清，然后再用smm溶液洗滌離心兩次，最后用3ml的smm溶液重懸細胞，得到原生質體懸液；s3.將步驟s2原生質體懸液置于無菌的試管中，進行artp誘變：預設以氦氣作為工作載氣，設定功率為115w，通氣量為10lmin-1，等離子發射源與樣品之間的距離為2mm，處理30s；s4.將步驟s3artp誘變處理后的原生質體涂布于再生平板并置于28℃恒溫培養箱培養3天，選擇菌落大小、形狀、外觀形態發生變化的單菌落轉接至另外的固體平板，27℃繼續恒溫培養2天，培養結束后采用滅過菌的的打孔器將單個菌落打下，并置于無菌濕潤的無菌小盤中繼續培養3天，至菌絲長滿培養基表面；然后取菌落小塊置于含有1％的檢菌的瓊脂平板上，37℃培養24h后觀察并測定瓊脂塊抑菌圈大小，挑選抑菌圈比出發菌株大的菌株；s5.將步驟s4篩選獲得的菌落從斜面接種至種子搖瓶，然后再轉接發酵搖瓶，27℃，210rpm，振蕩培養72h，收集發酵液；取10ml發酵液至10ml離心管中，6000×g離心10min，棄上清，甲醇重懸后轉移至100ml容量瓶中，40khz頻率超聲40min，冷卻，甲醇定容，0.45μm過濾膜過濾，進行生物抑菌效價檢測，同時采用hplc法檢測阿維拉霉素a的含量，挑選出抑菌效價高，阿維拉霉素a的產量高的菌株。所用培養基及緩沖液均按實施例1方法制得。實驗例4一種阿維拉霉素高產菌株的篩選方法所述阿維拉霉素高產菌株的篩選方法，包括以下步驟：s1.取活化培養好的綠色產色鏈霉菌avl4斜面一支，作為出發菌株，加入4～6ml無菌生理鹽水洗脫，制備孢子懸液，并按6％的接種量轉入含5％甘氨酸的裝有50ml種子培養基的250ml帶擋板三角搖瓶，29℃，230rpm繼續培養24h，培養結束后，將菌液7000rpm，4℃離心10min，磷酸高滲緩沖液清洗兩次，棄去上清，得到原生質體制備的出發菌絲體；s2.以smm溶液作為滲透壓穩定劑，在步驟s1制備的出發菌絲體管中加入終濃度為15mgml-1溶壁酶5ml，30℃條件下分別酶解75min，溫育結束后，采用無菌脫脂棉過濾除去未酶解的菌絲，收集濾液，4℃，2000rpm離心10min，去上清，然后再用smm溶液洗滌離心兩次，最后用3ml的smm溶液重懸細胞，得到原生質體懸液；s3.將步驟s2原生質體懸液置于無菌的試管中，進行artp誘變：預設以氦氣作為工作載氣，設定功率為115w，通氣量為10lmin-1，等離子發射源與樣品之間的距離為2mm，處理50s；s4.將步驟s3artp誘變處理后的原生質體涂布于再生平板并置于28℃恒溫培養箱培養3天，選擇菌落大小、形狀、外觀形態發生變化的單菌落轉接至另外的固體平板，29℃繼續恒溫培養2天，培養結束后采用滅過菌的的打孔器將單個菌落打下，并置于無菌濕潤的無菌小盤中繼續培養3天，至菌絲長滿培養基表面；然后取菌落小塊置于含有1％的檢菌的瓊脂平板上，37℃培養24h后觀察并測定瓊脂塊抑菌圈大小，挑選抑菌圈比出發菌株大的菌株；s5.將步驟s4篩選獲得的菌落從斜面接種至種子搖瓶，然后再轉接發酵搖瓶，29℃，230rpm，振蕩培養72h，收集發酵液；取10ml發酵液至10ml離心管中，6000×g離心10min，棄上清，甲醇重懸后轉移至100ml容量瓶中，40khz頻率超聲40min，冷卻，甲醇定容，0.45μm過濾膜過濾，進行生物抑菌效價檢測，同時采用hplc法檢測阿維拉霉素a的含量，挑選出抑菌效價高，阿維拉霉素a的產量高的菌株。所用培養基及緩沖液均按實施例1方法制得。對比例1一種阿維拉霉素高產菌株的篩選方法所述阿維拉霉素高產菌株的篩選方法與實施例2的區別在于步驟s2中加入終濃度為6mgml-1溶壁酶，其它步驟均與實施例2類似。對比例2一種阿維拉霉素高產菌株的篩選方法所述阿維拉霉素高產菌株的篩選方法與實施例2的區別在于步驟s2中酶解時間為90min，其它步驟均與實施例2類似。試驗例1不同制備方法對原生質體形成與再生的影響1.試驗材料：按實施例2～4及對比例1～2方法中s2步驟制備得到的原生質體懸液。2.試驗方法：將上述不同原生質體懸液進行梯度稀釋后涂布于再生培養基平板上，28℃培養4天，進行原生質體的再生，計算菌落數a。另外，進行原生質體再生的水處理對照實驗，即在原生質體懸液中加入9倍無菌水，并在搖床上28℃、50rpm溫育20min。而后梯度稀釋后涂布于再生培養基平板上，同樣28℃培養4天，計算菌落數b。原生質體再生率＝(a-b)/(c-b)×100％，其中c為出發菌絲體直接用無菌生理鹽水稀釋相同倍數后在出發菌株固體培養基的菌落數。3.試驗結果：試驗結果如表1所示。表1不同制備方法對原生質體的影響實施例1實施例2實施例3對比例1對比例2再生率(％)36.222.629.619.516.3原生質體數/×108ml-11.61.11.51.751.86酶濃度過大或酶解時間過長，往往對細菌的細胞壁形成過度的水解作用，不僅細胞壁被酶解，細胞膜也受到一定程度的損傷，導致原生質體的形成量增加了，但再生率卻大大降低，不利于細胞再生。酶濃度過低或酶解時間不足，酶對菌絲體的有效作用降低，導致酶解不徹底，難以形成原生質體。由表1可知，采用單一溶壁酶完全能夠滿足綠色產色鏈霉菌avl4原生質體制備的需要，采用12mgml-1的溶壁酶，30℃酶解反應60min制備的原生質體效果最好，再生率最佳。試驗例2阿維拉霉素生物抑菌效價的測定方法和hplc分析1.試驗材料：按實施例2篩選方法初步篩選得到的菌株抑菌圈直徑大于對照菌株的突變株s91、s215。2.試驗方法：采用管碟法檢測發酵液抑菌效價，并根據標準曲線以及樣品的抑菌圈直徑計算樣品的抑菌生物效價。其中，抑菌圈直徑(mm)＝測量直徑-孔徑。取預處理的樣品20μl，甲醇稀釋5倍后，直接進行hplc分析3.試驗結果：試驗結果如表2所示。表2阿拉霉素生物效價由表2可知，管碟法測得的突變菌株s91和s215抑菌圈直徑分別為15.6mm和16.1mm，阿維拉霉素生物效價為705.1uml-1和727.7uml-1，較原始出發菌株分別提高15.6％和19.3％。中變株s91的阿維拉霉素a含量為521.4μgml-1，占組分含量約73.9％，較原始出發菌株a的占比含量下降2.9％。菌株s251的阿維拉霉素a含量為589.4μgml-1，占組分含量81％，較原始出發菌株a含量提高6.4％。試驗例3突變株穩定性驗證1.試驗材料：按實施例2篩選方法篩選得到的s215菌株。2.試驗方法：采用斜面傳代的方式，連續轉接五代，每一代斜面菌株都進行搖瓶發酵驗證抑菌生物效價，每代菌株進行三個平行樣。3.試驗結果：試驗結果如表3所示。表3突變株s251的斜面傳代對生物抑菌效價的影響由表3可知，突變株s251傳代過程中生物抑菌效價變化幅度在3％以內，而且從傳代的形態特征來看，菌落形態、顏色、豐度及顯微形態都沒有變化，體現了較好的遺傳穩定性。試驗例450l罐發酵驗證1.試驗材料：按實施例2篩選方法篩選得到的s215菌株。2.試驗方法：以搖瓶種作為一級種子，采用三級發酵工藝，進行50l補料分批式發酵，一級搖瓶種至二級種子罐，移種量控制為5％，二級種子罐至發酵罐，移種量控制為20％，周期為240h。發酵罐控制參數：溫度28℃，通氣量1:1，罐壓0.05mpa，初始攪拌150rpm，流加20％氨水控制ph在7.0-7.2，流加500gl-1葡萄糖溶液控制發酵過程中葡萄糖濃度在3.0-8.0gl-1通過控制攪拌和補料維持發酵過程溶氧(do)在20-40％，流加豆油控制發酵過程中的泡沫，發酵每隔8小時取樣測定生物量(菌絲體濕重占取樣體積的比例)，發酵48h后開始檢測阿維拉霉素生物效價，繪制發酵曲線。3.試驗結果：如圖1所示。由圖1可知，發酵的前32h，菌體處于適應期，菌株的生物量變化都不大，此時以初級代謝為主。發酵32h之后，變株s251較原始對照菌株avl4的生長速率明顯要快，雖然兩者的最高生物量差不多，都為65％左右，但s251菌株在發酵80h就達到了最高生物量，而對照菌株avl4需要96h。80h至發酵結束，菌株s251都未出現大幅度的生物量下降，說明s251菌絲體的在發酵體系的動態平衡中維持穩定的周期長，而此時主要進行次級代謝，有利于目標產物的合成與積累，而對照菌株avl4在發酵216h后，生物量出現明顯下降，說明avl4菌株在發酵環境開始惡化之后，大部分菌絲體自溶，發酵體系中平衡被打破，次級代謝能力下降，目標產物合成減弱，發酵不可維持了。整個發酵過程菌株的生長狀態都體現了s251菌株較強的菌絲生長優勢及發酵后期的耐惡劣環境的能力，這對于進一步的工業化放大生產非常有利。從整個發酵過程中的抑菌效價的增長情況來看，阿維拉霉素的生物合成不但與菌絲體的生長密切相關，而且在菌株進入穩定期之后，次級代謝更加活躍。菌株s251阿維拉霉素效價最高在232h，達到4500uml-1，較對照菌株avl4提高27.4％，體現非常好的產素水平。不僅如此，對照菌株avl4在生物量下降之后，抑菌效價也顯著降低，這可能是菌株在發酵后期，無效成分大量合成，有效成分比例下降，導致抑菌效價降低，而變株s251未出現此類現象，更進一步說明變株s251較好的發酵環境耐受性。綜上所述，本發明通過原生質體選育獲得的菌株體現了非常優良的性能，發酵穩定，發酵得到的阿維拉霉素產量高，而且有效組分含量高，降低了制備相關產品的成本，顯示了非常好的工業化應用潛力。當前第1頁12