胞質體囊泡的制備方法及其應用

本發明涉及生物醫藥，尤其涉及一種胞質體囊泡的制備方法及其應用。

背景技術：

1、細胞類囊泡是一種仿生的生物技術，主要用于制備類似細胞膜結構的微米或納米囊泡，目前現有的細胞類囊泡主要包括細胞膜制備的囊泡和細胞分泌的外囊泡。細胞類囊泡在藥物的制備和疾病的診斷領域已被證明具有非常多的優勢，比如良好的生物安全性、膜蛋白的靶向性、多重載藥性，這讓細胞類囊泡擁有廣闊的應用前景。但是，細胞類囊泡在大規模制備和多功能化上還存在一些挑戰。特別是，細胞分泌的外囊泡的數量極少，遠遠少于實際使用的需求量。研究表明，在體外培養的情況下，106個細胞每日分泌的細胞分泌的外囊泡不到微克量級，這造成了細胞分泌的外囊泡(外泌體)在疾病診斷和治療等領域的研究困境。為克服這一缺點，大規模制造細胞衍生的微米、納米囊泡的需求應運而生。誘導分泌的囊泡在具有與外泌體相似功能的同時，這類誘導分泌的囊泡的制備過程增加的步驟相對簡單，囊泡提取量相比也更多一些。其中最常用的方法是利用化學誘導(化學試劑或納米材料)刺激細胞分泌更多的囊泡[advanced?functional?materials,2016,26(32):5804-5817]，另外還包括物理的方法，例如通過光誘導的方法使細胞產生納米囊泡[naturecommunications,2022,13(1):6534]。通過這些手段能夠獲得數量較為充足的膜成分和母細胞接近的囊泡[acs?appl.mater.interfaces?2021,13,55767-55779]。然而，現有的細胞分泌的外囊泡誘導技術要么耗時長且產率改善不高，要么會引入有生物安全風險的試劑，因此，開發新的高效、安全的細胞類囊泡的制備方法亟待解決。

2、此外，已有的細胞類囊泡的應用都是基于擁有的細胞膜結構，通過負載或者修飾小分子治療劑或者診斷劑在囊泡內或者細胞膜上，可以給予了細胞類囊泡衍生的小分子治療劑或者診斷劑出色的生物相容性和靶向性，但這樣的細胞類囊泡負載方式對于生物大分子(蛋白、mrna、細胞器)還是存在很大困難的，負載效率很低，這也間接反映了細胞類囊泡可拓展功能的局限性。生物大分子的遞送作為生物治療和診斷的重要途徑，雖然對于蛋白藥物、mrna藥物等生物大分子的負載和體內遞送還有一些其他的方式，但是對于更大尺寸(幾百納米到十幾微米)和脆弱性的細胞器，負載或遞送細胞器的策略幾乎沒有被報道。因此，構建含有生物大分子以及結構(特別是細胞器)的細胞類囊泡對生物治療和診斷的發展很有意義，并具備潛在的應用價值。

技術實現思路

1、本發明的目的在于提供一種胞質體囊泡的高效制備方法及其應用。本發明的制備方法方便快捷、價格低廉，并且不涉及有毒物質，適于推廣應用。

2、為達到上述目的，本發明所采用的技術方案如下：

3、本發明提供一種細胞外胞質體囊泡的制備方法，所述制備方法包括通過脫水處理誘導細胞生成囊泡的步驟。

4、在一些實施方案中，脫水處理的時間為1秒鐘-60分鐘，例如5分鐘-30分鐘、10分鐘-30分鐘、5分鐘-20分鐘、10分鐘、1分鐘-10分鐘、1分鐘-5分鐘、1分鐘-2分鐘、1秒鐘-10秒鐘、20分鐘-60分鐘、30分鐘。

5、在一些實施方案中，所述制備方法包括以下步驟：對細胞進行脫水處理，直至(例如在顯微鏡下觀察到細胞皺縮)細胞皺縮，進而誘導其生成囊泡。

6、在一些實施方案中，所述脫水處理選自以下任一種方式：

7、i)在無培養基或無緩沖液條件下，將細胞在一定溫度下靜置一段時間；例如，在-80℃至80℃的溫度下靜置1秒鐘-60分鐘；

8、ii)將細胞置于高濃度的氯化鈉溶液和/或蔗糖中靜置一段時間；例如靜置1分鐘-60分鐘。

9、在一些實施方案中，所述制備方法可以在實驗室中進行小規模的制備，也可以進行大規模的產業化的生產。

10、在一些實施方案中，脫水處理方式i)中，可根據靜置的溫度相應調整靜置的時間，直至在顯微鏡下觀察到細胞皺縮。例如，當靜置的溫度較高時，減少靜置的時間；當靜置的溫度較低時，增加靜置的時間。

11、在一些實施方案中，脫水處理方式i)可具體選擇如下任一處理方式：

12、i)在無培養基或緩沖液狀態下，將細胞在室溫下靜置1分鐘-60分鐘，例如5分鐘-30分鐘、10分鐘-30分鐘、5分鐘-20分鐘、10分鐘；

13、ii)在無培養基或緩沖液狀態下，將細胞在室溫至80℃下靜置1秒鐘-20分鐘，例如1分鐘-10分鐘、1分鐘-5分鐘、1分鐘-2分鐘、1秒鐘-10秒鐘、20秒鐘、30秒鐘；

14、iii)在無培養基或緩沖液狀態下，將細胞在低于室溫條件下靜置10分鐘-80分鐘，例如20分鐘-60分鐘、30分鐘。

15、在一些實施方案中，i)中室溫為10℃至30℃，例如18℃至28℃、18℃至25℃。

16、在一些實施方案中，ii)中溫度為30℃至80℃。

17、在一些實施方案中，iii)中低于室溫條件下為低于10℃，例如-100℃至10℃、-80℃至0℃。

18、在一些實施方案中，所述制備方法包括以下步驟：

19、細胞擴大培養，脫水處理，胞質體囊泡的分離及純化。

20、在一些實施方案中，所述制備方法包括以下步驟：

21、細胞的獲取，細胞擴大培養，脫水處理，培養(例如灌流培養)，收集胞質體囊泡。

22、在一些實施方案中，細胞來源于原代細胞、基因改造細胞、癌細胞、干細胞、組織、血液樣本等。

23、在一些實施方案中，細胞擴大培養具體為：將細胞接種至培養皿中，培養至細胞增殖到整個培養皿的70％～90％或者培養至細胞密度為70％～90％。在一些實施方案中，脫水處理方式選自i)時，所述制備方法包括以下步驟：

24、1)將細胞接種至培養皿中，培養至細胞增殖到整個培養皿的70％～90％或者培養至細胞密度為70％～90％；

25、2)去除培養基；任選地加入緩沖液沖洗并去除死細胞；

26、3)脫水處理：將細胞在一定溫度下靜置一段時間；

27、4)觀察到細胞皺縮后，加入緩沖液；

28、5)培養；任選地拍打培養皿(可加速囊泡的脫離過程)；

29、6)收集上清液，離心純化；

30、7)將上清進一步離心濃縮，即得到胞質體囊泡。

31、在一些實施方案中，培養皿為10cm培養皿。

32、在一些實施方案中，步驟1)中，細胞培養的條件為：在37℃、5％?co2條件下培養。

33、在一些實施方案中，步驟1)中，根據細胞密度，每3～4天傳代1次。

34、在一些實施方案中，步驟1)中，培養至細胞增殖到整個培養皿的80％～90％或70％～80％。

35、在一些實施方案中，步驟1)中，培養至細胞密度為80％～90％或70％～80％。

36、在一些實施方案中，步驟1)中，細胞的類型包括懸浮細胞和貼壁細胞。

37、在一些實施方案中，步驟1)中，細胞的類型包括原代細胞，例如卵巢癌原代細胞。

38、在一些實施方案中，步驟1)中，細胞是癌細胞，例如肺癌細胞(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞、胃癌細胞、肝癌細胞、血癌細胞(白血病細胞、急性髓系白血病細胞、急性淋巴細胞白血病細胞)、食管癌細胞、卵巢癌細胞等。

39、在一些實施方案中，步驟1)中，細胞選自pc9、mcf7、a549、h460、hela、mkn74、h22、cem、hek293t、b16、kyse150、a2780等細胞。

40、在一些實施方案中，步驟1)中，培養基選自添加10％胎牛血清(fbs)和1x青霉素-鏈霉素(ps)的dmem培養基、含10％fbs和1％?ps的rpmi?1640培養基。

41、在一些實施方案中，步驟2)和/或步驟4)中，緩沖液的ph為7.4-8.4，優選為7.4，更優選為ph為7.4的dpbs緩沖液。

42、在一些實施方案中，步驟2)和/或步驟4)中，緩沖液的離子強度為10mm～10m，優選為10mm～3m。

43、在一些實施方案中，步驟2)和/或步驟4)中，緩沖液選自dpbs緩沖液、nacl溶液、完全培養基、無血清培養基等。

44、在一些實施方案中，步驟4)中，緩沖液的加入量為5ml。

45、在一些實施方案中，步驟5)中，培養2min-60min(例如10min-60min)后再進行囊泡的脫離操作，例如培養10min、20min、30min、40min、50min、60min。

46、在一些實施方案中，步驟5)中，培養2分鐘，即可在顯微鏡下觀察到大量的脫水誘導的囊泡從細胞上脫離下來。

47、在一些實施方案中，步驟6)和/或步驟7)中，離心條件為500g離心15min～30min。

48、在一些實施方案中，脫水處理方式ii)中，高濃度的氯化鈉溶液為質量濃度為3％-10％的氯化鈉溶液，例如8％的氯化鈉溶液；

49、和/或，高濃度的蔗糖溶液為質量濃度為20％-50％的蔗糖溶液，例如30％的蔗糖溶液。

50、在一些實施方案中，脫水處理方式選自ii)時，所述制備方法包括以下步驟：

51、(1)將細胞接種至培養皿中，培養至細胞增殖到整個培養皿的70％～90％或者培養至細胞密度為70％～90％；

52、(2)去除培養基；任選地加入緩沖液沖洗并去除死細胞；

53、(3)脫水處理：將細胞置于高濃度的氯化鈉和/或蔗糖溶液中靜置一段時間；

54、(4)細胞皺縮后，去除高濃度的氯化鈉和/或蔗糖溶液(任選地使用緩沖液清洗殘余的高濃度的氯化鈉和/或蔗糖溶液)，加入緩沖液；

55、(5)培養；任選地拍打培養皿(可加速囊泡的脫離過程)；

56、(6)收集上清液，離心純化；

57、(7)將上清進一步離心濃縮，即得到胞質體囊泡。

58、在一些實施方案中，培養皿為10cm培養皿。

59、在一些實施方案中，步驟(1)中，細胞培養的條件為：在37℃、5％?co2條件下培養。

60、在一些實施方案中，步驟(1)中，根據細胞密度，每3～4天傳代1次。

61、在一些實施方案中，步驟(1)中，培養至細胞增殖到整個培養皿的80％～90％或70％～80％(例如80％)。

62、在一些實施方案中，步驟(1)中，培養至細胞密度為80％～90％或70％～80％。

63、在一些實施方案中，步驟(1)中，細胞的類型包括懸浮細胞和貼壁細胞。

64、在一些實施方案中，步驟(1)中，細胞的類型包括原代細胞，例如卵巢癌原代細胞。

65、在一些實施方案中，步驟(1)中，細胞是癌細胞，例如肺癌細胞(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞、胃癌細胞、肝癌細胞、血癌細胞(白血病細胞、急性髓系白血病細胞、急性淋巴細胞白血病細胞)、食管癌細胞、卵巢癌細胞等。

66、在一些實施方案中，步驟(1)中，細胞選自pc9、mcf7、a549、h460、hela、mkn74、h22、cem、hek293t、b16、kyse150、a2780等細胞。

67、在一些實施方案中，步驟(1)中，培養基選自添加10％胎牛血清(fbs)和1x青霉素-鏈霉素(ps)的dmem培養基、含10％fbs和1％?ps的rpmi?1640培養基。

68、在一些實施方案中，步驟(2)和/或步驟(4)中，緩沖液的ph為7.4-8.4，優選為7.4，更優選為ph為7.4的dpbs緩沖液。

69、在一些實施方案中，步驟(2)和/或步驟(4)中，緩沖液的離子強度為10mm～10m，優選為10mm～3m。

70、在一些實施方案中，步驟(2)和/或步驟(4)中，緩沖液選自dpbs緩沖液、nacl溶液、完全培養基、無血清培養基等。

71、在一些實施方案中，步驟(4)中，緩沖液的加入量為5ml。

72、在一些實施方案中，步驟5)中，培養2min-60min(例如10min-60min)后再進行囊泡的脫離操作，例如培養10min、20min、30min、40min、50min、60min。

73、在一些實施方案中，步驟(6)和/或步驟(7)中，離心條件為500g離心15min～30min。

74、本發明還提供由上述制備方法制備得到的細胞外胞質體囊泡。

75、在一些實施方案中，細胞是癌細胞，例如肺癌細胞(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞、胃癌細胞、肝癌細胞、血癌細胞(白血病細胞、急性髓系白血病細胞、急性淋巴細胞白血病細胞)、食管癌細胞、卵巢癌細胞等。

76、在一些實施方案中，細胞選自pc9、mcf7、a549、h460、hela、mkn74、h22、cem、hek293t、b16、kyse150、a2780等細胞；優選為pc9細胞、b16細胞。

77、在一些實施方案中，細胞外胞質體囊泡包含calnexin蛋白和/或β-actin蛋白。

78、在一些實施方案中，細胞外胞質體囊泡不含有細胞核。

79、在一些實施方案中，細胞外胞質體囊泡不包含凋亡細胞特征蛋白。

80、在一些實施方案中，細胞外胞質體囊泡包含如下標志蛋白中的一種、兩種或多種：utp20、tmem109、zw10、pvr、cd58、mrps7、chp1、rab27b、steap4、jagn1、dbt、slc39a7、pacsin3、scamp1、ndufb4、mrps17、psmb6、ano6、sypl1、trpc5/4、polr2e、c7orf50、seh1l、tm9sf4、mxra7、bdh1、gtpbp1、mknk1、mgst3、alg5；

81、在一些實施方案中，細胞外胞質體囊泡的尺寸為0～40μm，優選地大于5μm，例如大于10μm，例如5μm-20μm，例如5μm-30μm。

82、本發明還提供一種細胞外納米級胞質體囊泡的制備方法，包括以下步驟：

83、(i)利用上述制備方法制備得到細胞外胞質體囊泡；

84、(ii)使用脂質體擠出儀、納米孔徑的過濾器得到細胞外納米級胞質體囊泡。

85、在一些實施方案中，步驟(ii)具體為：

86、(ii)使用脂質體擠出儀，將細胞外胞質體囊泡的懸浮液裝入注射器中，然后將懸浮液依次通過一系列納米孔徑的過濾器，收集0.1μm濾膜擠壓產物，即可得到細胞外納米級胞質體囊泡。

87、在一些實施方案中，過濾器為聚碳酸酯膜過濾器。

88、在一些實施方案中，一系列納米孔徑為1μm、0.4μm和0.1μm。

89、本發明提供由上述制備方法制備得到的細胞外納米級胞質體囊泡。

90、在一些實施方案中，細胞是癌細胞，例如肺癌細胞(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、食管癌、宮頸癌細胞、胃癌細胞、肝癌細胞、血癌細胞(白血病細胞、急性髓系白血病細胞、急性淋巴細胞白血病細胞)等。

91、在一些實施方案中，細胞選自pc9、mcf7、a549、h460、hela、mkn74、h22、cem、hek293t、b16、kyse150、a2780等細胞。

92、在一些實施方案中，細胞外納米級胞質體囊泡包含calnexin蛋白和/或β-actin蛋白；

93、在一些實施方案中，細胞外納米級胞質體囊泡不含有細胞核；

94、在一些實施方案中，細胞外納米級胞質體囊泡不包含凋亡細胞特征蛋白；

95、在一些實施方案中，細胞外納米級胞質體囊泡包含如下標志蛋白中的一種、兩種或多種：utp20、tmem109、zw10、pvr、cd58、mrps7、chp1、rab27b、steap4、jagn1、dbt、slc39a7、pacsin3、scamp1、ndufb4、mrps17、psmb6、ano6、sypl1、trpc5/4、polr2e、c7orf50、seh1l、tm9sf4、mxra7、bdh1、gtpbp1、mknk1、mgst3、alg5。

96、本發明還提供上述細胞外胞質體囊泡或細胞外納米級胞質體囊泡在制備藥物載體中的應用。

97、在一些實施方案中，所述藥物包括化學藥物、適體藥物、dna藥物、rna藥物、蛋白質藥物等。

98、本發明還提供上述細胞外胞質體囊泡或細胞外納米級胞質體囊泡在制備腫瘤疫苗中的應用。

99、本發明還提供一種腫瘤疫苗，所述腫瘤疫苗包括上述細胞外胞質體囊泡或細胞外納米級胞質體囊泡以及佐劑。

100、本發明還提供上述細胞外胞質體囊泡或細胞外納米級胞質體囊泡在制備疾病診斷試劑、藥物(例如靶向藥物、抗腫瘤藥物)、生物醫學成像等中的應用。

101、本發明還提供上述細胞外胞質體囊泡的制備方法、上述細胞外納米級胞質體囊泡的制備方法在制備藥物載體、制備腫瘤疫苗、制備疾病診斷試劑、藥物(例如靶向藥物、抗腫瘤藥物)、生物醫學成像等中的應用。

102、有益效果

103、本發明制備細胞外胞質體囊泡的方法方便快捷，且不受細胞類型限制，并且產率高，不涉及有毒物質的使用，還可以通過對親本細胞改造，來改變胞質體囊泡的功能。本發明制備的胞質體囊泡可以用于疾病的診斷與臨床用藥等，具有較高的應用價值，適于推廣應用。

104、本發明制備的胞質體囊泡和細胞相比，與外泌體具有相似的性質，可以作為一種外泌體的類似物，用于疾病的診斷和藥物制備。與此同時，胞質體囊泡含有線粒體和細胞核等重要細胞器，可以用于細胞器的補充治療或用于mrna的表達或蛋白質的分泌。

105、本方法適用于多種類細胞，懸浮細胞和貼壁細胞均具有良好的產率。