專利名稱:一種在聚電解質離子的協同作用下對青霉素酰化酶的固定方法
技術領域：
本發明涉及將青霉素酰化酶(PGA)在聚電解質離子的協同作用下固定在高聚物形成的固體網格之中的方法，并應用于β-內酰胺類抗生素及其母核的工業制備和合成過程。
背景技術：
二十世紀60年代早期β-內酰胺抗生素半合成工業漸漸興起，這使得β-內酰胺的母核6-氨基青霉素烷酸(6-APA)成為重要的藥物合成中間體。因此，人們首先開始通過青霉素酰化酶(PGA)裂解青霉素G來合成6-APA。隨后，由于PGA獨特的選擇性，人們又研究利用PGA的選擇催化作用，以6-APA或7-氨基去乙酸基頭孢烷酸(7-ADCA)為β-內酰胺的母核，再加上適當的側鏈來半合成β-內酰胺抗生素。
四十余年來，經過不斷的篩選和基因重組的PGA變得越來越穩定，酶的生產能力也不斷的得到提高，再加上有效的固定化方法使得酶的回收變成可能，該方法的成本也被大大的降低。
現在，通過酶的這一催化作用，全世界一年可以生產20000噸的6-APA，而相應的β-內酰胺類抗生素，如頭孢氨芐，阿莫西林和頭孢羥氨芐等，也已經逐漸實現了工業化。
但值得注意的是，有效的PGA固定化方法是酶促裂解青霉素G和β-內酰胺抗生素半合成的關鍵。所以現在對于這一領域的研究也相當重視。
總體說來，酶的固定化方法有三大類1、載體結合法將酶共價結合到一個預制載體上。載體通常使用合成樹脂，生物高聚體或無機材料等。
2、包埋法將酶物理包埋于聚合物的網格(如凝膠格子)或有孔纖維、微囊之類的膜中。這其中采用的物理作用力非常弱，但是卻可以阻止酶的活性構象被破壞。但有時也會對酶再進行一次共價結合處理。
3、酶交聯晶體或聚沉體法主要是用雙官能團試劑對酶進行無載體交聯制備酶顆粒。
青霉素酰化酶的固定化方法及基材也有很多種。例如，以丙烯酸樹脂及其衍生物的多元共聚物為載體的共價結合固定化方法，這類載體常見的有Eupergit C和Amberlite系列等。荷蘭DSM公司發明的明膠-殼聚糖凝膠包埋青霉素酰化酶的方法。此外還有許多以無機硅材料，分子篩，硅藻土等各種材料為載體通過物理吸附，共價交聯等各種方法來固定化青霉素酰化酶的途徑。酶交聯晶體或聚沉體法也有過報道，但由于自身條件限制，該種固定化的青霉素酰化酶不能用于β-內酰胺抗生素的工業化大生產。
發明內容本發明提供一種更高效的青霉素酰化酶的固定化方法。以聚電解質離子的協同作用，先將青霉素酰化酶包埋于聚電解質離子形成的固體網格之中，再通過交聯劑的作用進一步提高其機械強度和穩定性。
這種在聚電解質離子的協同作用下對青霉素酰化酶進行固定的方法，包括如下步驟(1)將濃度為100～3000U/ml的青霉素酰化酶的溶液與聚陰離子溶液進行預混合，得到預混合液，然后將預混合液與聚陽離子溶液混合，生成帶有絮狀沉淀的懸濁液；(2)將帶有絮狀沉淀的懸濁液進行攪拌，攪拌下加入硅烷類物質并均勻混合，加入交聯劑，再經過陳化，真空干燥，研磨，得到顆粒狀的青霉素酰化酶固定化產物。
所述的聚陰離子溶液是將聚陰離子溶于pH值5.0～9.0的磷酸緩沖溶液或8.0～11.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液中，所述的聚陰離子為聚對苯乙烯磺酸鈉、硫酸酯化多糖、多糖硫酸酯、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸或海藻酸鈉中的一種或幾種。
所述的聚陽離子溶液是將聚陽離子溶于pH值3.5～6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液或5.0～9.0的磷酸緩沖溶液中，所述的聚陽離子為殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚三甲基烯丙基氯化銨、聚二甲基二烯丙基氯化銨或聚烯丙基氯化銨中的一種或幾種。
所述的青霉素酰化酶與聚陰離子溶液進行預混合時pH值控制在5.0～11.5；所述的預混合液與聚陽離子溶液進行混合時pH值控制在3.5～9.0。聚陰離子溶液濃度為0.1mg/ml～0.2g/ml；聚陽離子溶液濃度為0.1mg/ml～0.2g/ml。
所述的硅烷類物質為四甲氧基硅烷、四甲氧基硅烷含氨基衍生物、四甲氧基硅烷含環氧基團衍生物、四甲氧基硅烷含羧基衍生物、四乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷含氨基衍生物、四乙氧基硅烷含環氧基團衍生物或四乙氧基硅烷含羧基衍生物。硅烷類物質的用量為聚陽離子質量的0.2～5.0倍。
所述的交聯劑為戊二醛、乙二醛、甲醛、N，N-二甲基甲酰胺或環氧氯丙烷。交聯劑的用量為硅烷類物質質量的0.1％～20％。
步驟(1)中，由于酶自身表面的電荷分布并不均勻，通過緩沖液的控制可以使酶的表面更多的富集正電荷或負電荷，本發明方法中是采用在酶表面富集陽離子的方法，與聚陰離子溶液進行混合，得到的溶液再與聚陽離子進行混合。由于聚電解質自身正負離子的聚沉作用，這樣就可以得到通過靜電力作用的包覆有酶的聚電解質絮狀沉淀體。
步驟(1)是整個青霉素酰化酶固定化最主要的部分，因為它不僅涉及到青霉素酰化酶的固定量，也對最后產物的活性，回收率等等主要參數有極大的影響，并且之后的處理過程也是以此步驟為基礎的。因此，必須選取合適的聚電解質離子和優化各物質之間合適的比例，還要嚴格控制各種物質溶液的pH值。
步驟(2)的主要出發點是考慮到絮狀沉淀并非是工業上所能直接采用的固定化產物，因為工業需要的固定化酶必須要易于分離，并且有一定的機械強度，這都是絮狀沉淀物所不能達到的。所以，在這一懸濁液中加入一定量的硅烷，并加入交聯劑，用一種類似于溶膠凝膠法的方法來制得顆粒狀的固定化酶，并達到一定的機械強度，以適于工業生產的要求。
因此，這一過程中的助劑硅烷和交聯劑的選擇及用量是很重要的，這影響到最后產物的顆粒大小和機械強度。
通過本發明方法固定的青霉素酰化酶，保留了酶自身較高的穩定性和活性，又使得整個固定化產物本身能較好的適應于β-內酰胺抗生素工業化生產中惡劣的環境條件。
圖1為青霉素酰化酶包埋于聚陽離子與聚陰離子形成的網格中的示意圖具體實施方式
實施例1取1.0g聚對苯乙烯磺酸鈉溶于20ml pH值7.4的磷酸緩沖溶液中，再加入5ml1000U/ml的青霉素酰化酶水溶液。另取1.0g聚二甲基二烯丙基氯化銨溶于30ml pH值7.4的磷酸緩沖溶液中。將兩份溶液在150ml圓底燒瓶中混合，立刻可得到白色極細的絮狀沉淀。機械攪拌，并加入5ml氨丙基三甲氧基硅烷，1小時之后，停止攪拌，并立刻加入5ml 25％的戊二醛水溶液，陳化24小時后，洗滌沉淀物至檢測不出戊二醛，室溫真空干燥，產品取出研磨，可得顆粒狀青霉素酰化酶固定化產物，活力可達1000～1200U/g。
實施例2取1.0g羧甲基纖維素鈉溶于20ml pH值9.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液中，再加入5ml 1000U/ml的青霉素酰化酶水溶液。另取1.0g聚乙烯亞胺溶于30ml pH值4.0的檸檬酸-檸檬酸鈉溶液中。將兩份溶液在150ml圓底燒瓶中混合，立刻可得到白色絮狀沉淀。機械攪拌，并加入5ml環氧丙基三乙氧基硅烷，1小時之后，停止攪拌，并立刻加入5ml環氧氯丙烷，機械攪拌2小時，靜置24小時后，洗滌沉淀物，室溫真空干燥，產品取出研磨，可得顆粒狀青霉素酰化酶固定化產物，活力可達1200～1500U/g。
實施例3取1.0g海藻酸鈉溶于20ml pH值8.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液中，再加入5ml 1000U/ml的青霉素酰化酶水溶液。另取0.8g聚烯丙基氯化銨溶于40ml pH值6.8的磷酸緩沖溶液中。將兩份溶液在150ml圓底燒瓶中混合，立刻可得到乳白色細小顆粒沉淀。機械攪拌，并加入5ml氨丙基三乙氧基硅烷，1小時之后，停止攪拌，并立刻加入8ml甲醛水溶液，陳化24小時后，洗滌沉淀物，室溫真空干燥，產品取出研磨，可得顆粒狀青霉素酰化酶固定化產物，活力可達1100～1400U/g。
權利要求
1.一種在聚電解質離子的協同作用下對青霉素酰化酶的固定方法，包括如下步驟(1)將濃度為100～3000U/ml的青霉素酰化酶的溶液與聚陰離子溶液進行預混合，得到預混合液，然后將預混合液與聚陽離子溶液混合，生成帶有絮狀沉淀的懸濁液；(2)將帶有絮狀沉淀的懸濁液進行攪拌，攪拌下加入硅烷類物質并均勻混合，加入交聯劑，再經過陳化，真空干燥，研磨，得到顆粒狀的青霉素酰化酶固定化產物。
2.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于所述的聚陰離子溶液是將聚陰離子溶于pH值5.0～9.0的磷酸緩沖溶液或8.0～11.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液中，所述的聚陰離子為聚對苯乙烯磺酸鈉、硫酸酯化多糖、多糖硫酸酯、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸或海藻酸鈉中的一種或幾種。
3.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于所述的聚陽離子溶液是將聚陽離子溶于pH值3.5～6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液或5.0～9.0的磷酸緩沖溶液中，所述的聚陽離子為殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚三甲基烯丙基氯化銨、聚二甲基二烯丙基氯化銨或聚烯丙基氯化銨中的一種或幾種。
4.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于所述的聚陰離子溶液濃度為0.1mg/ml～0.2g/ml；聚陽離子溶液濃度為0.1mg/ml～0.2g/ml。
5.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于所述的青霉素酰化酶與聚陰離子溶液進行預混合時pH值控制在5.0～11.5；所述的預混合液與聚陽離子溶液進行混合時pH值控制在3.5～9.0。
6.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于所述的硅烷類物質為四甲氧基硅烷、四甲氧基硅烷含氨基衍生物、四甲氧基硅烷含環氧基團衍生物、四甲氧基硅烷含羧基衍生物、四乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷含氨基衍生物、四乙氧基硅烷含環氧基團衍生物或四乙氧基硅烷含羧基衍生物。
7.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于所述的硅烷類物質的用量為聚陽離子質量的0.2～5.0倍。
8.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于所述的交聯劑為戊二醛、乙二醛、甲醛、N，N-二甲基甲酰胺或環氧氯丙烷。
9.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于所述的交聯劑的用量為硅烷類物質質量的0.1％～20％。
專利摘要
本發明公開了一種在聚電解質離子的協同作用下對青霉素酰化酶進行固定的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將濃度為100～3000U/ml的青霉素酰化酶的溶液與聚陰離子溶液進行預混合，然后將預混合液與聚陽離子溶液混合，生成帶有絮狀沉淀的懸濁液；(2)將帶有絮狀沉淀的懸濁液進行攪拌，攪拌下加入硅烷類物質并均勻混合，加入交聯劑，再經過陳化，真空干燥，研磨，得到顆粒狀的青霉素酰化酶固定化產物。通過本發明方法固定的青霉素酰化酶，提高了的酶活性和使用穩定性，可以改善β－內酰胺抗生素工業化生產條件，降低生產成本。
文檔編號C12N9/78GK1995338SQ200610155522
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月28日
發明者林賢福, 吳起, 金鑫, 呂德水, 陳志春 申請人:浙江大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan