一種螺旋藻抗腫瘤多肽的三酶解制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種螺旋藻抗腫瘤多肽的三酶解制備方法。
【背景技術】
[0002]生物活性肽是對機體的功能或狀態具有積極作用并最終影響機體健康的特殊蛋白質片段。相較于蛋白質而言，小分子肽片段的優越性主要體現在:更易被人體吸收利用；活性高，在較小濃度下即可發揮其特有的生理作用；分子量小，易于修飾和改造，能夠通過人工化學合成等。而相較于單一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸無可比擬的優越性。已有研宄證實，人體小腸存在專門的低聚肽吸收通道，人體攝入的蛋白質經過多種消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸收，且二肽和三肽的吸收速度比同組成的氨基酸更快。
[0003]海洋環境復雜多變，其高鹽、高壓、低溫、寡營養等獨特條件賦予了海洋生物某些優良的特性。許多研宄表明，生物活性肽，尤其是海洋來源的生物活性肽具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降壓、降血糖等多種作用。而近年來，海洋來源的天然生物抗腫瘤肽也取得一定的進展，成為抗腫瘤藥物和保健品開發的重要來源。
[0004]螺旋藻(Spirulina)是人類迄今為止所發現的最優質的純天然蛋白質食品源，其蛋白質含量高達50 - 70%，由18種氨基酸組成，包含人體全部8種必需氨基酸，且配比合理。其豐富的蛋白質和氨基酸為開發螺旋藻生物活性肽提供了良好的物質基礎。利用酶解手段將螺旋藻蛋白進行非變性水解，不僅能提高螺旋藻蛋白的溶解性和體內吸收利用率，還能獲取具有特殊生理功能的生物活性肽。目前已有報道從螺旋藻蛋白酶解物中成功提取到抗氧化肽、ACE抑制肽、抑菌肽等，但抗腫瘤肽的研宄尚處于初級階段。本文以MTT實驗為指導，通過酶解、超濾、凝膠色譜分離技術，純化得到多個抗腫瘤活性肽組分，并通過質譜技術對其組分和序列進行初步鑒定，為進一步開發螺旋藻的食用和藥用價值提供理論依據。
【發明內容】
[0005]為進一步開發螺旋藻在食品和生物醫學領域的應用價值，本發明的目的是提供一種螺旋藻抗腫瘤多肽的三酶解制備方法。
[0006]為實現本發明的目的，采用如下技術方案:
一種螺旋藻抗腫瘤多肽的三酶解制備方法，包括如下步驟:
(1)采用反復凍融、均質和超聲聯用的方法，提取螺旋藻蛋白:取10~50g螺旋藻粉，用超純水配制成濃度為5% (w/v)的溶液，反復凍融2-5次，冰浴中均質、超聲，離心取上清液，冷凍干燥備用；
(2)取步驟(I)得到的螺旋藻蛋白配置成1°/『5%的蛋白液，加入胃蛋白酶在控制條件下進行酶解，酶解過程中使用0.05?0.2 mo I/L的NaOH和HCl來調節反應體系的pH值，控制pH值在ρΗ±0.05之間，酶解完后再調節酶解條件，加入胰蛋白酶在控制條件下進行酶解，酶解體系的PH值控制方法同上，之后加入胰凝乳蛋白酶在控制條件下進行酶解，酶解體系的PH值控制方法同上，酶解完畢后滅酶，冷卻至室溫，將酶解液離心，取上清液；
(3)取步驟(2)得到的酶解液，依次用截留分子量分別為10KD,5 KD以及3 KD的超濾膜過濾，從而獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD，5-10KD和大于10 KD的螺旋藻蛋白酶解液；
(4)取步驟(3)得到的0-3K的酶解液進行葡聚糖凝膠SephadexG_15柱層析，水洗脫，按照出峰的時間順序，收集得到4個多肽組分，分別命名為Trl、Tr2, Tr3和Tr4，即螺旋藻抗腫瘤多肽。
[0007]上述方法中，步驟(I)所述反復凍融條件為:-20 °C冰箱中冷凍4~8h，再置于37°C水浴中解凍2~3h;所述均質條件為:樣品置于冰浴中均質l~3min，在轉速為3000~5000rpm 攪拌 20~50s，然后在 7000~12000rpm 攪拌 40~80s，最后在 3000~5000rpm 攪拌20?50sο
[0008]上述方法中，步驟(I)所述超聲條件為:樣品置于冰浴中，以460~670 W的功率超聲20~15min，超聲過程中每超聲4~8s，間隔6~10s再繼續超聲4~8s，如此循環。
[0009]上述方法中，步驟(I)所述離心條件為:4 0C, 8000 ~10000r/min，離心30?60mino
[0010]上述方法中，步驟(2)胃蛋白酶、胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶三酶解的水解條件是:加入胃蛋白酶，酶解溫度37°C，pH=l~2，酶解時間1~3 h，酶與底物濃度比為4~6% (w/w)，加入胰蛋白酶，酶解溫度37°C，pH=7~9，酶解時間2~4h，酶與底物濃度比為3~5% (w/w)，加入胰凝乳蛋白酶，酶解溫度37°C，pH=7~9，酶解時間2~4h，酶與底物濃度比為4?6% (w/w)o
[0011]上述方法中，步驟(2)所述滅酶條件為:80~95°C水浴滅酶10~15 min。
[0012]上述方法中，步驟(2)所述離心條件為8000~10000 r/min，離心30~60 min。
[0013]上述方法中，步驟(3)所述的超濾在CO2壓力為0.1?0.25 MPa的室溫下用超濾杯結合10K，5K和3K的超濾膜超濾。
[0014]上述方法中，步驟(4)所述的葡聚糖凝膠Sephadex G_15分離純化，具體條件為:柱體積為150~200 mL，上樣量為1~4 mL，上樣濃度為50~150 mg/mL，流動相為水，流速為0.35 mL/min，每8 min收集一管，總共收集160管，檢測波長為280 nm。
[0015]上述方法中，步驟(4)所述螺旋藻抗腫瘤多肽組份通過MALD1-TOF-TOF質譜分析鑒定得到，Trl多肽中的的其中一條肽分子量為935.567，序列為RPARSLVH (C — N)。
[0016]與現有的技術相比，本發明具有如下的技術優點和效果:
本發明得到的4個螺旋藻多肽組份對乳腺癌細胞(MCF-7)和肝癌細胞(HepG-2)均具有抑制作用。其中，Trl對MCF-7和HepG-2的半抑制濃度IC5tl值分別為:60.12 Pg/mL和82.48Pg/mL。Tr2對MCF-7的半抑制濃度IC5tl值小于實驗最低劑量濃度31.25 Pg/mL，對HepG-2半抑制濃度IC5tl為90.74Pg/mL。Tr3對MCF-7和H印G_2的半抑制濃度IC 5(|值分別為:238.86 Pg/mL 和 176.37Pg/mL。MALD1-TOF-TOF-MS 二級質譜分析得出 Trl 多肽中的的其中一條肽分子量為935.567，序列為RPARSLVH (C — N)。因而本發明得到的螺旋藻多肽有利于抗腫瘤藥物和保健食品的開發利用。
【附圖說明】
[0017]圖1為實施例1中0-3 K酶解液組份的葡聚糖凝膠S印hadexG-15柱層析洗脫曲線。
[0018]圖2為實施例1中所制備的4個多肽組份濃度均為500 Pg/mL時對乳腺癌細胞(MCF-7)和肝癌細胞(HepG-2)抑制效果。
[0019]圖3為實施例1所制備的螺旋藻多肽中荷質比m/z = 935.567的二級質譜圖。
[0020]
【具體實施方式】
[0021]以下結合實例和附圖對本發明的具體實施作進一步說明，但本發明的實施和保護范圍不限于此。
[0022]實施例1
(I)取10 g螺旋藻粉，用超純水配制成濃度為5% (w/v)的溶液，在-20 ^冰箱中冷凍4h，再置于37°C水浴中解凍2h，如此反復凍融5次。樣品置于冰浴中均質2min，轉速為5000rpm 30s — 1000rpm Imin — 5000rpm 30s。然后冰浴中以 460W 的功率超聲 20min(每超聲 6 s，間隔 9 S)。4 °C，8000r/min，離心 30 min。
[0023](2)取步驟(I)得到的螺旋藻蛋白配置成2% (w/w)的蛋白液，加入胃蛋白酶，使酶與底物濃度比為4% (w/w)，調節溫度至37°C，pH為1.0，酶解I h。然后調節pH至7.0，按照3% (w/w)的酶底比加入胰蛋白酶酶解2h。再按照4% (w/w)的酶底比加入胰凝乳蛋白酶，酶解2h。該過程中使用0.05mol/L的NaOH和HCl來調節反應體系的pH值，控制pH值在ρΗ±0.05之間。酶解完畢后80°C水浴中滅酶15min，冷卻至室溫，8000r/min,離心30min后取上清液。
[0024](3)取步驟(2)得到的酶解液，依次用截留分子量分別為10 KD,5 KD以及3 KD的超濾膜過濾(C02的壓力為0.10 MPa的室溫下)，從而獲得分子量大小范圍為0_3 KD,3-5KD，5-10KD和大于10 KD的螺旋藻蛋白酶解液。
[0025](4)取步驟(2)得到的0-3K的酶解液進行葡聚糖凝膠Sephadex G_15柱層析，柱體積為150 mL，上樣量為I mL，上樣濃度為150 mg/mL，流動相為水，流速為0.40 mL/min,每8 min收集一管，總共收集160管，檢測波長為280 nm,按照出峰的時間順序，收集得到4個多肽組分，分別命名為Trl、Tr2、Tr3和Tr4 (圖1)。
[0026]通過步驟(I) ~ (4)得到4種螺旋藻多肽組份，用MTT法對這4個組份進行抗腫瘤活性檢測，結果表明當這4種組份的濃度分別為500 Pg/mL時，對乳腺癌細胞MCF-7和肝癌細胞H印G-2均具有一定的抑制作用(圖2)。其中，Tr 1、Tr 2和Tr4對乳腺癌細胞MCF-7的半數抑制濃度IC5tl值分別為60.12Pg/mL，小于31.25Pg/mL以及238.86μδ/mL。對H印G-2的半數抑制濃度IC5tl值分別為82.48Pg/mL，90.74Pg/mL以及176.37Pg/mL。MALD1-TOF-TOF-MS 二級質譜分析得出Trl多肽中的的其中一條肽分子量為935.567，序列為 RPARSLVH (C —N)。
[0027]實施例2
(I)取20 g螺旋藻粉，用超純水配制成濃度為5% (w/v)的溶液，在-20 °C冰箱中冷凍5h，再置于37°C水浴中解凍2.5h，如此反復凍融4次。樣品置于冰浴中均質70s，轉速為4000rpm 20s — 12000rpm 30s — 4000rpm 20s。然后冰浴中以 500 W 的功率超聲 20min(每超聲 5 s，間隔 7 S)。4 °C，8000r/min，離心 40 min。
[0028](2)取步驟(I)得到的螺旋藻蛋白配置成3% (w/w)的蛋白液，加入胃蛋白酶，使酶與底物濃度比為5% (