一種番茄內生真菌交織枝頂孢及其在番茄根結線蟲病生防中的應用
【專利說明】一種番茄內生真菌交織枝頂孢及其在番茄根結線蟲病生防 中的應用 發明領域
[0001] 本發明涉及生物防治技術領域，具體的說，本發明涉及一種交織枝頂孢菌及其在 番茄根結線蟲病生防中的應用技術領域。
【背景技術】
[0002] 番茄根結線蟲病是一種嚴重危害番茄品質和產量的土傳性病害。根結線蟲主要侵 染番茄根部，尤其側根受害多。根上形成很多近球狀瘤狀物，似念珠狀相互連接，初表面白 色，后變褐色或黑色，地上部表現萎縮或黃化。線蟲以成蟲或卵在病組織里或以幼蟲在土壤 中越冬。病土和病肥是發病主要來源。該線蟲發育適溫25-3CTC，幼蟲遇低溫失去活動能 力，48-60°C經5分鐘致死，在土中存活一年，2年即全部死亡。番茄根部被破壞，影響正常的 吸收機能，所以地上部生長發育受阻，輕者癥狀不明顯，重者生長緩慢，植株比較矮小，生育 不良，結果小而且少。在中午氣溫較高時，地上部植株呈萎蔫狀態；早晚氣溫較低或澆水充 足時，暫時萎蔫又可恢復正常。隨著病情的發展，植株逐漸枯死。
[0003] 根結線蟲防治以化學防治為主，不僅破壞土壤生態環境，還對人體健康造成影 響。化學防治帶來的環境污染和農藥殘留問題嚴重制約我國番茄產業的發展，生物防治 具有環境相容性、綠色環保性特點，具有廣闊的應用前景。近年來，番茄根結線蟲生防 菌的篩選受到關注。人們分離到多種根結線蟲生防菌，如厚垣孢普可尼亞菌（Pochonia chlamydosporia)、尖抱枝抱(Cladosporiumoxysporum)、淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)和綠色木霉（Trichodermaviride)等。這些生防菌通過寄生線蟲或卵塊、分泌 殺線蟲活性物質來抑制根結線蟲，但在田防效不佳，主要由于這些生防菌不能在土壤中定 殖。植物內生真菌可產生殺線蟲活性的次生代謝產物直接作用于線蟲。內生真菌能定殖于 植物體內，在與其他土壤微生物競爭中具有優勢，能夠以"守株待兔"的方式防治線蟲，具有 靶向性，極具開發潛力。
【發明內容】
[0004] 針對現有根結線蟲生物防治技術未有良好生防菌的現狀，本發明旨在提供一種番 茄內生真菌交織枝頂孢及其作為番茄根結線蟲生防菌的應用。通過試驗驗證，采用本發明 提供的交織枝頂孢對防治番茄根結線蟲具有良好效果。這對于進一步減少農藥用量，提高 番茄品質，促進我國的番茄產業向著綠色無公害方向發展具有重要意義。
[0005] 本發明的技術方案：通過從多年種植番茄大棚內感染根結線蟲的番茄根結中分離 內生真菌，獲得較強抑制根結線蟲活性的菌株，經過進一步篩選，獲得一株編號為TEF。通過 對菌株進行形態特征和18SrDNA序列測定及系統發育分析，初步確定了其分離地位；同時 對該菌株的發酵液對根結線蟲二齡幼蟲致死率，菌株孢子懸浮液對番茄根結數量、土壤中 根結線蟲蟲口數量以及田間防效等進行了全面系統研究，為番茄根結線蟲的生物防治提 供了新選擇，其拮抗作用對于番茄根結線蟲的解決具有突出的技術效果。
[0006] 本發明提供的一種作為番爺根結線蟲生防菌的交織枝頂孢（Acremonium implicatum)。通過在北京順義地區種植番茄的大棚內番茄根結中分離、篩選和培養，獲得 一批作為番爺根結線蟲拮抗菌的微生物菌株。從中篩選出一株編號為TEF的菌株，對于番 茄根結線蟲具有穩定而顯著的拮抗效果，經微生物學分類與鑒定，屬于交織枝頂孢菌。
[0007] 具體的，本發明提供的一種作為番茄根結線蟲生防菌交織枝頂孢，命名為TEF。該 菌株已于申請日前保藏于約布達佩斯條微生物國際保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心。地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究 所，郵編：100101。保藏日期2013. 10. 9,保藏號是CGMCCN0. 8300。經微生物學鑒定為交織 枝頂孢。該菌株最適生長條件為：溫度25°C，培養基（PDA)為馬鈴薯粉0.6% (w/v)，葡萄 糖1.5-2%(?八)，瓊脂1.5-2%(￥八)，口117.0-7.2，1211：滅菌20分鐘。在？0六培養基平板 上，25°C，培養7天后，菌株TEF菌落直徑為18-25mm，菌絲白色，菌落中央產生氣生菌絲，瓶 梗長度5-10ym，基部寬1. 5?2. 0ym，頂部寬0? 5?1ym。分生孢子串生于瓶梗上，形成 長鏈。分生孢子單胞，橢圓，平滑，大小4. 4?5. 2X1. 4?2.Oilm。未見厚垣孢子。依照 《真菌鑒定手冊》對菌株TEF形態進行測定，確定該菌株為枝頂孢屬（Acremonium)成員。通 過BLAST同源比對，TEF菌株的 18SrDNA序列與Acremoniumimplicatum的 18SrDNA序 列相似性最高，因此將TEF菌株確定為交織枝頂孢（Acremoniumimplicatum)。
[0008] 進一步，本發明一種交織枝頂孢（Acremoniumimplicatum)作為番爺根結線蟲生 防菌的應用。
[0009] 本發明進一步提供了菌種的保存條件，采用培養基（PDA)成分：馬鈴薯粉0.6% (w/v)，葡萄糖 1.5-2% (w/v)，瓊脂 1.5-2% ^八），口117.0-7.2，1211：滅菌20分鐘。在？0八 培養基斜面上25°C條件下，培養3天，采用10%滅菌甘油作為保護劑，真空冷凍干燥后低溫 保存；平時使用保存在PDA培養基斜面上，4°C冰箱保存備用。
[0010] 通過實施本發明具體的
【發明內容】
，可以達到以下有益效果：本發明提供的交織枝 頂孢（Acremoniumimplicatum)是一種根結線蟲生防菌，在番爺根結線蟲防治方面有較高 的應用價值，尤其是該菌是番茄內生菌，能夠持續對根結線蟲起作用，克服了一般生防菌不 能在土壤中定殖而造成防效低的缺陷，所以防治效果較好。
【附圖說明】
[0011] 圖1所示為交織枝頂孢（Acremoniumimplicatum)Tef的菌落形態圖。圖中，A:菌 落形態，B:瓶梗C:分生孢子，D:分生孢子串生。
[0012] 圖2所不為交織枝頂抱（Acremoniumimplicatum)Tef的18SrDNA片段PCR擴增 結果圖，圖中，M指標準DNA序列片段大小。
[0013] 圖3所不為交織枝頂抱（Acremoniumimplicatum)Tef的18SrDNA系統發育樹圖。 圖中，Tef指交織枝頂抱（Acremoniumimplicatum)Tef菌株。
[0014] 圖4所示為交織枝頂孢（Acremoniumimplicatum)Tef對根結線蟲抑制的盆栽效 果圖。圖中，A為對照，B為交織枝頂孢菌液處理。
【具體實施方式】
[0015] 下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不局限于下述的實施例。
[0016]本發明中涉及到的主要原輔材料、試劑盒儀器設備：供試南方根結線蟲 (Meloidogyneincongnita)由中國農業科學院蔬菜花舟研究所病害組提供；番爺樣品采自 北京市順義區楊鎮蔬菜基地，取番茄根結后，在實驗室進行表面消毒，然后分離根結內生真 菌。分離采用馬鈴薯葡糖培養基（PDA) ;MSSPx-250生化培養箱，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋， 單人雙面凈化工作臺，PCR儀Eppendorf，AllegraX-15R臺式冷凍離心機，電泳儀Bio-Rad Mode，凝膠成像儀United-BioGK-330C，真菌基因組DNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公 司），Sigma-Aldrich公司的ReadyMix?TaqPCRReactionMix(含有MgCl2)，其余試劑為 分析純。
[0017] 本發明中選用的所有原輔材料、試劑盒儀器都為本領域熟知的，其他本領域熟知 的一些試劑盒設備都可適用于本發明以下實施方式的實施。
[0018]實施例一：交織枝頂孢（Acremoniumimplicatum)的分離、篩選及鑒定 [0019] (1)拮抗菌的分離和篩選
[0020] 根結內生真菌分離：取番茄根結組織，用自來水沖洗掉根結表面泥土，然后用無菌 水沖洗3次，75%酒精浸泡1分鐘，無菌水沖洗3次。用無菌剪刀將根結剪成0.5X0. 5cm小塊，置于PDA培養基上培養。PDA培養基中含有75yg/mL氨芐青霉素，抑制細菌生長。將 培養基置于25°C培養，待根結小塊長出菌落后，分別挑取菌落邊緣菌絲到另一PDA平板上， 純化。最后將純化的菌株保存備用。
[0021] 菌株發酵液對根結線蟲致死活性測定：將菌株接種于含有馬鈴薯葡糖培養液的三 角瓶中，25°C，震蕩培養7天。將發酵液800rmp/min離心2分鐘，去除菌絲和孢子，再經細 菌過濾器過濾，得到無菌的發酵液。取根結線蟲2齡幼蟲蟲懸液lml(約含有500頭線蟲） 加入到4ml發酵液中，25°C靜置48小時后，將線蟲轉移至無菌水中復蘇2小時，身體僵直不 活動的線蟲為死亡線蟲。統計線蟲總數量和死亡線蟲數量。馬鈴薯葡萄糖液體培養基作為 對照。計算測試菌株對根結線蟲的致死率，篩選致死率高的菌株進行后續試驗。
[0022] 根結線蟲致死率公式：
【主權項】
1. 一種從番茄根結中分離的，可作為番茄根結線蟲生防菌菌株TEF，為交織枝頂孢 (Acremonium implicatum)，2013年10月9日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院，中國科學院微生物研究所，菌種保藏編號 為 CGMCC NO. 8300。 2?如權利要求1所述的交織枝頂抱（Acremonium implicatum)CGMCC NO. 8300在作為 番茄根結線蟲生防菌的應用。
3.如權利要求2所述的交織枝頂孢在防治番茄根結線蟲的使用方法，其特征在于： 1) 將交織枝頂孢接種于含有馬鈴薯葡糖培養液的三角瓶中，25°C，震蕩培養7天。 2) 用無菌紗布過濾掉菌絲，留下孢子，用無菌水將孢子配置成孢子懸浮液，濃度為 lX106CFU/ml。 3) 將孢子懸浮液用滅菌草炭進行吸附，制備成菌劑，比例為1000g草炭吸附500ml孢子 懸浮液。 4) 田間施用菌劑采用溝施或穴施，使用量為每壟1000g，壟長10m，壟寬0.6m，種植20 棵番爺植株。
【專利摘要】本發明涉及一種番茄內生真菌交織枝頂孢(Acremonium implicatum)CGMCC NO.8300及其作為番茄根結線蟲生防菌的應用，屬于生物防治領域。該菌株的發酵液對根結線蟲二齡幼蟲具有良好的致死活性。菌株孢子懸浮液(濃度為1×106CFU/ml)用滅菌草炭吸附后作為菌劑，比例為1000g草炭吸附500ml孢子懸浮液。移栽番茄前，菌劑溝施或穴施于種植穴。菌劑對番茄根結線蟲具有較高的田間防效，達到72.8％。該菌株對于解決番茄根結線蟲生物防治具有突出的技術效果，具有廣泛的應用領域。CGMCC NO830020131009
【IPC分類】A01N63-04, C12N1-14, A01P5-00, C12R1-645
【公開號】CN104593266
【申請號】CN201310533051
【發明人】謝丙炎, 田雪亮, 姚玉榮, 陳國華, 茆振川
【申請人】中國農業科學院蔬菜花卉研究所, 河南科技學院
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2013年11月4日