加工食品中紅薯植物源性成分鑒別用hda引物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種用于加工食品中紅薯植物源性成分 鑒別的HDA引物及其應用。
【背景技術】
[0002] 紅薯作為富含膳食纖維且營養豐富的食品，其加工食品及飲品增長迅速，受到廣 大消費者的歡迎。隨之而來的問題是，在紅薯制產品的制備過程中存在大量的不規范操作， 使得所得終產品中紅薯源成分的有無及其含量無法確定，導致紅薯食品/飲品的質量無法 保障。
[0003]與此同時，隨著核酸擴增技術的發展和應用，以核酸等溫擴增技術為基礎的檢測 技術近年來得到了迅猛的發展。多種機制的等溫技術不僅誕生，而且有些技術已經相當成 熟，完成了從實驗室到實際應用的過渡，正逐步在分子生物學、醫學、法學等領域得到廣泛 的運用。特別是在現場快速檢測技術方面，核酸等溫擴增技術顯示了其突出的優越性。更 為重要的是，核酸等溫擴增技術由于不需要溫度變化的時間過程且擺脫了對精良儀器設備 的依賴，使病原體的檢測實現了快速、簡便和高通量。在實際操作和儀器要求方面，這些等 溫技術都比PCR技術更為簡單和廉價，從而更容易被開發成現場檢測的應用產品。因此，等 溫擴增技術是核酸擴增技術的發展方向，具有廣闊的應用前景。
[0004]依賴解旋酶DNA等溫擴增技術（Helicase-DependentisothermalDNA Amplification，簡稱HDA)是由美國NEB公司研宄人員Vincent等于2004年發明一種新型 核酸等溫擴增技術。該技術模擬體內DAN在恒溫下復制的自然過程，在恒溫條件下利用生 物復制系統的關鍵組分實現DNA的體外擴增。主要是利用解旋酶在恒溫下解開DNA雙鏈， 同時DNA單鏈結合蛋白（SSB)穩定解開的單鏈為引物提供結合模板，然后由DNA聚合酶催 化合成互補鏈。新合成的雙鏈在解旋酶的作用下又形成單鏈，并作為下一輪合成的模板進 入循環擴增反應，最終實現靶序列的指數增長。
[0005] HDA技術的優點在于：等溫擴增，在一個恒定溫度就能完成擴增反應，不需要像 PCR那樣循環的溫度變化；原理簡單，HDA技術模擬自然界DNA的合成方式，原理清晰易懂； 操作簡便，HDA對引物的設計與PCR相似，不需要復雜的引物設計。對于其他組分也不需要 做任何特殊處理，只需要一個恒溫裝置即可進行反應；設備簡單，HDA不需要復雜的設備， 只需要一個簡單的恒溫器，如果選用室溫可以進行反應的酶，甚至不需要恒溫器就可進行 反應。因此，HDA技術具有廣闊的應用前景。
[0006] 目前尚未見利用HDA法檢測紅薯植物源成分含量的報道。
【發明內容】
[0007] 本發明要解決的技術問題是提供一種加工食品中紅薯植物源性成分鑒別用HDA 引物及其應用，利用該引物進行相關檢測，無論檢測準度、精度或專一度都十分理想。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：
[0009] 加工食品中紅薯植物源性成分鑒別用HDA引物，所述HDA引物為：上游引物：如 SEQIDNO:1所示；下游引物：如SEQIDNO:2所示。
[0010] 利用上述HDA引物鑒別加工食品中紅薯植物源性成分的方法，該方法包括如下步 驟：
[0011] A、食品中DNA的提取：取待測食品樣品，采用試劑盒提取其中的DNA，保存備用；
[0012] B、引物設計：引物對于檢測結果的準度、精度、專一度起決定作用，直接采用上述 兩條引物；
[0013]C、HDA反應體系的建立：HDA反應體系包括：5yL10X緩沖液，0.04ymoldNTPs， 0. 16umol ATP?10U Bst ploymerase? 0. l〇-〇.30ugUvrDhelicase?1.〇-5. 0Ug T4 gp32或1. 0-6. 0 y g RecA蛋白，25yM海藻糖，2yL模板食品DNA，上游引物和下游引物各 20pmol，用ddH20補至50yL;
[0014] D、恒溫擴增：將反應體系放入60-70°C恒溫金屬浴中恒溫擴增l_3h;
[0015]E、結果檢測：瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，利用凝膠成像系統成像分析結果。
[0016] 作為上述檢測方法的一種優選技術方案，步驟A中，食品中DNA提取的具體操 作方法為：如果操作對象為固體樣品，則經液氮研磨成粉末后取0.lg，如果操作對象是液 體樣品，則經冷凍干燥后取粉末0.lg;所得樣品粉末加入1. 5mL離心管中，加入600y1 65 °C預熱的BufferPCB和12y1 0 -巰基乙醇，震蕩混勻，置于65 °C水浴25min，間或混 勾，加入等體積的氯仿，充分混勾，12,OOOrpm離心5min，吸取上層水相至一個干凈的 1. 5ml的離心管中，加入等體積BufferBD，顛倒混勾3-5次，再加等體積的無水乙醇，充 分混勻后用移液器將其全部加入到Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒的吸附柱中， 室溫靜置2min，10,OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管中，加入 500ylPWSolution，10,OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管中，加 入500y1WashSolution，10,OOOrpm，離心lmin，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管 中，12,OOOrpm離心2min，取出吸附柱，放入一個新的1. 5ml離心管中，在吸附膜中央加入 50yITEBuffer，靜置3min，12,OOOrpm離心2min，得到的DNA溶液置于-20°C保存或直接用 于后續步驟。
[0017] 作為上述檢測方法的一種優選技術方案，步驟C中，所述10X緩沖液包括lOOmM 二硫蘇糖醇、350mMTris-HAc、100mMMgS04和lmg/mLBSA。
[0018] 作為上述檢測方法的一種優選技術方案，步驟C中，所述反應體系中還包括9U的 Phi29嗜溫聚合酶。
[0019] 作為上述檢測方法的一種優選技術方案，：步驟C中，所述UvrDhelicase的含量 為 〇? 2yg。
[0020] 作為上述檢測方法的一種優選技術方案，步驟C中，所述T4gp32的含量為 4. 0yg，或者RecA蛋白的含量為3. 0yg。
[0021] 作為上述檢測方法的一種優選技術方案，步驟D中，將反應體系放入65°C恒溫金 屬浴中恒溫擴增2h。
[0022] 作為上述檢測方法的一種優選技術方案，步驟E中，吸取5yL擴增產物進行1-2% 瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為80-120V，80-100mA，電泳時間40-50min，置市售凝膠成像系 統進行結果分析，檢測產物。
[0023] 采用上述技術方案所產生的有益效果在于：本發明是一種簡便、快速的檢測方法， 操作簡單，覆蓋面廣，能應用在檢驗的一線，能夠準確、快速檢測出待測食品是否含有紅薯 植物源成分，具有準度高、精度好、專一性強的特點，具體試驗數據見實施例6-7。本發明的 方法可節約大量的人力物力，具有重大的實際應用價值。
【附圖說明】
[0024] 圖1為實施例6所得電泳圖譜，其中，泳道1 :100bpladdermarker，泳道2 : 0. 00001 %樣品，泳道3 :0. 0001 %樣品，泳道4 :0. 001 %樣品，泳道5 :0. 01 %樣品，泳道 6 :0. 1 %樣品，泳道7 :1 %樣品，泳道8 :10%樣品；可見，本發明所設計引物的檢出精度為 0. 0001 %，即每百克樣品中含有0. 0001g紅薯即可檢出。
[0025] 圖2為實施例7所得電泳圖譜，其中，泳道1 :100bpladdermarker，泳道2 :紅薯， 泳道3 :苜蓿樣品，泳道4 :木薯，泳道5 :核桃，泳道6 :馬鈴薯。可見，紅薯樣品被有效的擴 增出235bp左右長度的目的片段，電泳條帶清晰，無非特異性擴增，而其他4組樣品均未產 生電泳條帶，說明沒有基因擴增；可見本發明所設計引物的檢出專一度優良。
【具體實施方式】
[0026] 下