基于dI修飾引物和內切核酸酶V的等溫PCR核酸擴增方法

專利名稱：基于dI修飾引物和內切核酸酶V的等溫PCR核酸擴增方法
技術領域：
本發明涉及一種新的核酸擴增方法，尤其涉及一種基于dl修飾引物和內 切核酸酶V的等溫PCR核酸擴增方法，可以用于等溫擴增目標核酸，屬于基因 工程技術領域。
背景技術：
聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一種有著眾多應用 的常規分子生物學技術。常規PCR主要由三步反應組成1)目標核酸模板分子 的熱變性，2)自由引物與變性的目標核酸模板分子間的雜交退火，3)熱穩定 性DNA聚合酶催化結合在目標核酸模板分子上的引物的DNA合成反應。常規 PCR的三步反應重復循環進行，實現目標核酸的指數倍數擴增。常規PCR需要 昂貴的熱循環儀。等溫PCR是一種新型核酸擴增技術，不需要熱循環儀。在等 溫PCR中，引物與目標核酸模板分子經變性退火，形成互補配對的引物-模板復 合物，在恒定溫度(一般是DNA聚合酶的最適反應溫度)下由DNA聚合酶催 化DNA合成反應的持續進行。等溫PCR需要在DNA合成過程中持續地自動生 成引物-模板復合物(DNA合成反應的有效底物)，以使DNA合成反應能夠持續 進行。由于等溫PCR不依賴于熱循環儀，可以在水浴鍋中進行反應，操作空間 大，可以方便的擴大反應體積與通量。
目前常用的等溫PCR主要有兩種基于滾環復制的等溫PCR和基于loop 結構引物的等溫PCR [Nucleic Acids Res., 2006， 34:e98; Genome Res., 2001， 11:1095-1099; Nucleic Acids Res., 2000， 28:e63.]。其中基于滾環復制的等溫PCR 根據DNA聚合酶的差異，分為phi 29 DNA聚合酶催化的等溫PCR和T7 DNA 聚合酶催化的等溫PCR。在phi 29 DNA聚合酶催化的等溫PCR中，正向引物結 合于環狀單鏈目標核酸模板分子，在37度下phi 29 DNA聚合酶以滾環復制的形 式置換合成長的單鏈DNA，反向引物結合于滾環復制合成的長的單鏈DNA，合 成長度各異的雙鏈DNA。與phi29DNA聚合酶類似，T7 DNA聚合酶也以環狀 DNA為模板，利用正向引物與反向引物，在37度下合成長度各異的眾多雙鏈 DNA。基于loop結構引物的等溫PCR以線性DNA為模板，利用4條引物，最 終合成各種長度的雙鏈DNA。
現有等溫PCR技術的缺陷主要有1)擴增產物為長度各異的雙鏈DNA混 合物，需要用限制性內切核酸酶消化來形成長度均一的DNA片段;2)phi 29 DNA 聚合酶與T7 DNA聚合酶催化的等溫PCR只能擴增長度比較短的環狀目標核酸 模板分子，且常常產生非特異性擴增條帶；3)雖然基于loop結構引物的等溫 PCR可以擴增高度復雜的線狀DNA分子，但其擴增片段的長度有限， 一般低于 250 bp; 4)基于loop結構引物的等溫PCR需要兩對引物，擴增反應操作復雜， 任何一對引物引發的DNA合成反應的失敗均會造成目標核酸擴增的失敗。

發明內容
本發明的目的在于針對現有等溫PCR技術的不足，提供一種基于dl修飾引 物和內切核酸酶V的等溫PCR核酸擴增方法，該等溫PCR操作簡便，擴增效 率、擴增片段長度和特異性大大提高，可用于等溫擴增長度均一的目標核酸片 段。
為實現這樣的目的，本發明通過內切核酸酶V與dl修飾引物實現引物-模板 復合物的再生。在本發明中，用于擴增目標核酸的正向引物與反向引物具有如 下特征整條引物與目標核酸模板分子完全配對，5'端第10-30位含有1-5個dl 核苷酸，dl核苷酸下游具有10-30個核苷酸。等溫PCR反應組分包括dl修飾的 正向引物與反向引物、目標核酸模板分子、dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP共4禾中 脫氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、內切核酸酶V、單鏈DNA結合蛋白和解 螺旋酶。等溫PCR混合物經過最初的熱變性、雜交退火后，在恒定溫度下進行 PCR。在擴增過程中由內切核酸酶V實現引物-模板復合物的循環再生，引發DNA 合成反應；單鏈DNA結合蛋白與解螺旋酶可以提高等溫PCR的目標核酸擴增 效率。
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本發明方法的具體步驟如下
1、 設計合成用于擴增目標核酸的正向引物與反向引物，正向引物與反向引 物的序列特征是整條引物與目標核酸模板分子完全配對，5'端第10-30位含有 1-5個dl核苷酸，dl核苷酸下游具有10-30個核苷酸；
2、 將用于擴增目標核酸片段的正向引物與反向引物、目標核酸模板分子、 以及dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP共四種脫氧核糖核苷三磷酸加入PCR緩沖液， 配置成無蛋白組分的等溫PCR混合物；將DNA聚合酶(例如phi29 DNA聚合 酶、T7DNA聚合酶、沒有5'外切酶活性的測序級Taq DNA聚合酶或5'外切酶 活性缺失的Bst DNA聚合酶的Klenow大片段等)、內切核酸酶V、單鏈DNA 結合蛋白和解螺旋酶共四種蛋白質，以1-5個單位5-500納克50-10000納克 5-500納克的比例混合，根據四種蛋白質的熱穩定性，配成等溫PCR常溫蛋白混 合物或等溫PCR耐高溫蛋白混合物；
3、 將無蛋白組分的等溫PCR混合物在95度熱變性5-10分鐘，然后降溫至 25-37度范圍內放置5分鐘，進行引物與目標核酸模板分子的雜交退火，形成引 物-模板復合物；然后加入等溫PCR常溫蛋白混合物，于25-37度范圍內進行等 溫PCR，反應時間l-24小時;
或者，將無蛋白組分的等溫PCR混合物與等溫PCR耐高溫蛋白混合物直接 混合在一起，在95度熱變性5-10分鐘，然后降溫至42-72度范圍內進行等溫PCR， 反應時間l-24小時；
4)將等溫PCR后的混合物置于質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠中，200V條 件下電泳20分鐘，檢測目標核酸擴增產物。
本發明與現有的等溫PCR和熱循環PCR技術相比有顯著的進步。主要優點 如下(1)擴增反應在25-37度或42-72度范圍內的某一恒定溫度進行，不需要 熱循環儀。(2)利用內切核酸酶V與dl修飾引物實現了引物-模板復合物的循 環再生，再生的引物-模板復合物的DNA合成反應效率與熱循環PCR相當。(3) 目標核酸以線性與指數擴增形式同時擴增，擴增速度高于常規PCR。 (4)目標 核酸擴增產物特異性高，雖然dl修飾引物可能在目標核酸模板分子的多處區域
發生部分配對，但只有引物與模板分子完全配對時才能夠產生PCR。 (5)目標 核酸擴增片段長度均一，由于在擴增過程中不形成擴增片段的重復串聯體，因 此目標核酸擴增片段長度均一。(6)解螺旋酶與單鏈DNA結合蛋白使得DNA 合成速度與效率大大提高。(7)操作簡便、結果穩定，由于不需要熱循環儀來 生成引物-模板復合物，也就不需要優化多個目標核酸同時擴增所需要的通用退 火溫度，極大的方便了多個目標核酸的同時擴增。(8)操作通量大，在整個操 作過程中不需要熱循環儀，僅需要水浴鍋這一恒溫加熱裝置，因此可以方便的 增加目標核酸的擴增反應數目和反應體積，進行目標核酸的大規模高產量擴增。 本發明可用于擴增雙鏈目標核酸和RNA反轉錄的cDNA等單鏈目標核酸。 擴增反應不需要昂貴的熱循環儀來再生引物-模板復合物，操作簡便、所需儀器 設備簡單，大大擴大了目標核酸擴增的應用場所。主要應用于微生物檢測、基 因克隆、法醫鑒定等領域。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明的技術方案作進一步詳細描述。以下實施例不構 成對本發明的限定。
以下實施例利用5'端第19位為dl修飾核苷酸的正向引物與反向引物，在 DNA聚合酶、內切核酸酶V、單鏈DNA結合蛋白和解螺旋酶的共同作用下， 完成目標核酸的擴增。
實施例1 pUC18質粒中的氨芐青霉素抗性基因的等溫PCR擴增
本實施例中的目標核酸模板分子是質粒pUC18，待擴增的目標核酸是質粒 pUC18的氨芐青霉素抗性基因，使用的四種常溫蛋白質為phi 29 DNA聚合酶、 大腸桿菌內切核酸酶V、 T7噬菌體的單鏈DNA結合蛋白和解螺旋酶。具體實 施步驟如下
第一步，設計合成用于擴增質粒pUC18的氨芐青霉素抗性基因的引物序列。 2條引物分別為pUC18-amp-F、 pUC18-amp-R。 2條引物堿基序列如下 pUC18-amp-F: 5, aatattgaaa aaggaagaxt atgagtattc aacatttccg t
pUC18-amp-R: 5' gagtaaactt ggtctgacxg ttaccaatgc ttaatcagtg a
其中，符號X表示dI修飾核苷酸，整條引物與pUC18質粒載體的氨芐青 霉素抗性基因的兩端互補配對。引物可以自己利用DNA合成儀合成或由各DNA 合成公司合成。
第二步，等溫PCR混合物的制備。等溫PCR混合物由兩部分構成無蛋 白組分的等溫PCR混合物和由四種蛋白組成的等溫PCR常溫蛋白混合物。無蛋 白成分的等溫PCR混合物組成(40微升)正向引物與反向引物，1.0 ^M;目 標核酸模板分子，5納克pUC18質粒；dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP， 200 ^M; 10xphi29DNA聚合酶反應緩沖液，4微升；補加去離子水至總體積為40微升。 四種蛋白構成的等溫PCR常溫蛋白混合物組成phi 29DNA聚合酶，2.5個單
位；大腸桿菌內切核酸酶V， 50納克；T7噬菌體單鏈DNA結合蛋白，500納 克；T7噬菌體解螺旋酶，50納克；10xphi29DNA聚合酶反應緩沖液，1微升； 補加去離子水至總體積為IO微升。
第三步，等溫PCR混合物的熱變性、退火和等溫PCR反應。將40微升的 無蛋白組分的等溫PCR混合物在95度熱變性5-10分鐘，然后降溫至37度保溫 5分鐘，使dl修飾引物與pUC18質粒雜交配對，形成最初的引物-模板復合物； 然后加入10微升等溫PCR常溫蛋白混合物，最終的等溫PCR混合物(50微升) 在37度溫浴2小時，進行等溫PCR的DNA持續合成。
第四步，氨卞青霉素抗性基因擴增結果檢測。將等溫PCR后的混合物置于 質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠，凝膠中添加了終濃度為0.5微克/毫升的溴化乙啶。 利用水平電泳儀，在200V電壓下電泳20分鐘，在紫外光下或凝膠成像系統中 觀測氨卞青霉素抗性基因擴增結果，氨卞青霉素抗性基因擴增產物為861 bp的 DNA片斷。
等溫PCR擴增目標核酸的原理第一步，熱變性-退火形成引物-模板復合 物、DNA聚合酶(催化DNA合成反應)與內切核酸酶V (催化引物-模板復合 物的循環再生)的共同作用生成大量單鏈目標核酸分子；第二步，第一步生成 的單鏈目標核酸分子與自由引物配對形成新的弓1物-模板復合物，弓I發指數形式 的DNA合成反應，生成大量的單鏈目標核酸分子；第三步，隨著自由引物的
大量減少，以及合成的單鏈目標核酸分子的大量增加，單鏈目標核酸分子彼此 雜交配對形成雙鏈DNA擴增產物。單鏈DNA結合蛋白可以結合反應過程中生 成的大量單鏈目標核酸分子，使其處于單鏈狀態；解螺旋酶促進引物-模板復合 物起始的DNA合成過程中雙鏈DNA的解鏈；單鏈DNA結合蛋白和解螺旋酶 的共同作用可以提高等溫PCR的目標核酸擴增效率。
實施例2衣原體基因組中內切核酸酶IV基因的等溫PCR擴增
本實施例中的目標核酸模板分子是衣原體基因組DNA，待擴增的目標核酸 是衣原體的內切核酸酶IV基因，使用的四種耐高溫蛋白質為TaqDNA聚合酶， 耐高溫微生物T. thermophilus的內切核酸酶V、單鏈DNA結合蛋白和解螺旋酶。 具體實施步驟如下
第一步，設計合成用于擴增衣原體內切核酸酶IV基因的引物序列。2條引 物分別為CpendoIV-F、 CpendoIV-R。 2條引物堿基序列如下
CpendoIV-F: 5， agaaaagacc ttgaaattxt atgaaagtac ttcctcctcc c CpendoIV-R: 5， aaaagcactt aaaaaactxc ctaactatct ctgttttttg a
其中，符號X表示dI修飾核苷酸，整條引物與衣原體的內切核酸酶IV基 因兩端互補配對。引物可以自己利用DNA合成儀合成或由各DNA合成公司合 成。
第二步，等溫PCR混合物的制備。等溫PCR混合物由無蛋白組分的等溫 PCR混合物和等溫PCR耐高溫蛋白混合物二者混合而成。最終的等溫PCR混合 物組成(50微升)正向引物與反向引物，l.OpM;目標核酸模板分子，50納克 衣原體基因組DNA; dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP， 200 ^M; TaqDNA聚合酶， 2.5個單位；T. thermophilus的內切核酸酶V, 50納克；T. thermophilus的單鏈 DNA結合蛋白，500納克；T. thermophilus的解螺旋酶，50納克；10xTaqDNA 聚合酶反應緩沖液，5微升；補加去離子水至總體積為50微升。
第三步，等溫PCR混合物的熱變性、退火和等溫PCR反應。將50微升的 等溫PCR混合物在95度熱變性5-10分鐘，然后降溫至60度左右，并在水浴鍋 中繼續溫浴2個小時，進行等溫PCR的DNA持續合成。
第四步，衣原體內切核酸酶IV基因擴增結果檢測。將等溫PCR后的混合 物置于質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠，凝膠中添加了終濃度為0.5微克/毫升的溴 化乙啶。利用水平電泳儀，在200V電壓下電泳20分鐘，在紫外光下或凝膠成 像系統中觀測衣原體內切核酸酶IV基因擴增結果，衣原體內切核酸酶IV基因 擴增產物為882 bp的DNA片斷。
實施例3人防御素a3mRNA的等溫PCR擴增
本實施例中的模板是人總RNA反轉錄的總cDNA，待擴增的目標核酸是人 防御素a3cDNA基因，使用的四種常溫蛋白質為噬菌體T7 DNA聚合酶(結合 了大腸桿菌硫氧還蛋白)、T7單鏈DNA結合蛋白、T7解螺旋酶和大腸桿菌內切 核酸酶V。
在利用本發明的等溫PCR擴增人防御素a3 cDNA基因之前，需要預先通過 反轉錄反應制備人總cDNA。反轉錄反應組成100ul反轉錄反應混合物中含有 人總RNA3微克，lx反轉錄緩沖液，0.5mM的dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP， 2 pM的oligo—dT寡核苷酸引物，10個單位的RNase A抑制劑，10個單位M-MLV 反轉錄酶。于37度反應60分鐘。柱層析除去沒有摻入的脫氧核糖核苷三磷酸， 回收總cDNA，并溶于100 ul水，測定總cDNA濃度。
本發明方法具體實施步驟如下
第一步，設計合成用于擴增人防御素ct3編碼基因的引物序列。2條引物分 別為DEFA3-F、 DEFA3-R。 2條引物堿基序列如下
DEFA3-F: 5' gaggatctgt gaccccagxc atgaggaccc tcgccatcctt DEFA3-R: 5， atttttcttt ttctgcaaxc tcagcagcag aatgcccaga g
其中，符號X表示dl修飾核苷酸，整條引物與人防御素a3編碼基因的cDNA 兩端互補配對。引物可以自己利用DNA合成儀合成或由各DNA合成公司合成。
第二步，等溫PCR反應混合物的制備。等溫PCR反應混合物由兩部分構 成無蛋白組分的等溫PCR混合物和等溫PCR常溫蛋白混合物。無蛋白組分的 等溫PCR混合物組成(40微升)正向引物與反向引物，1.0 ^M;目標核酸模 板分子，50納克人總cDNA; dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP， 200 nM; 10xT7DNA
聚合酶反應緩沖液，4微升；補加去離子水至總體積為40微升。等溫PCR常溫 蛋白混合物組成T7DNA聚合酶，2.5個單位；大腸桿菌內切核酸酶V， 50納 克；T7單鏈DNA結合蛋白，500納克；T7解螺旋酶，50納克；10xT7DNA聚 合酶反應緩沖液，l微升；補加去離子水至總體積為10微升。
第三步，等溫PCR反應混合物的熱變性、退火和等溫PCR反應。將40微 升的無蛋白組分的等溫PCR混合物在95度熱變性5-10分鐘，然后降溫至37度 繼續保溫5分鐘，使dl修飾引物與人防御素a3的cDNA目標核酸模板分子雜交 配對，形成最初的引物-模板復合物；然后加入IO微升的等溫PCR常溫蛋白混 合物，在37度溫浴2個小時，進行等溫PCR的DNA持續合成。
第四步，人防御素a3 cDNA基因擴增結果檢測。將等溫PCR后的混合物 置于質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠，凝膠中添加了終濃度為0.5微克/毫升的溴化 乙啶。利用水平電泳儀，在200V電壓下電泳20分鐘，在紫外光下或凝膠成像 系統中觀測人防御素a3 cDNA基因擴增結果，人防御素a3 cDNA基因擴增產物 為285bp的DNA片斷。
權利要求
1、一種基于dI修飾引物和內切核酸酶V的等溫PCR核酸擴增方法，其特征在于包括以下步驟1)設計合成用于擴增目標核酸的正向與反向引物序列，正向引物與反向引物的序列特征是整條引物與目標核酸模板分子完全配對，5’端第10-30位含有1-5個dI核苷酸，dI核苷酸下游具有10-30個核苷酸；2)將用于擴增目標核酸片段的正向引物與反向引物、目標核酸模板分子、以及dATP、dTTP、dCTP、dGTP共四種脫氧核糖核苷三磷酸加入聚合酶鏈式反應緩沖液，配置成無蛋白組分的等溫聚合酶鏈式反應混合物；將DNA聚合酶、內切核酸酶V、單鏈DNA結合蛋白和解螺旋酶共四種蛋白質，以1-5個單位5-500納克50-10000納克5-500納克的比例混合，根據四種蛋白質的熱穩定性，配成等溫聚合酶鏈式反應常溫蛋白混合物或等溫聚合酶鏈式反應耐高溫蛋白混合物；3)將無蛋白組分的等溫聚合酶鏈式反應混合物在95度熱變性5-10分鐘，然后降溫至25-37度范圍內放置5分鐘，進行引物與目標核酸模板分子的雜交退火，形成引物-模板復合物；然后加入等溫聚合酶鏈式反應常溫蛋白混合物，于25-37度范圍內進行等溫聚合酶鏈式反應，反應時間1-24小時；或者，將無蛋白組分的等溫聚合酶鏈式反應混合物與等溫聚合酶鏈式反應耐高溫蛋白混合物直接混合在一起，在95度熱變性5-10分鐘，然后降溫至42-72度范圍內進行等溫聚合酶鏈式反應，反應時間1-24小時；4)將等溫聚合酶鏈式反應后的混合物置于質量濃度為1％的瓊脂糖凝膠中，200V條件下電泳20分鐘，檢測目標核酸擴增產物。
全文摘要
本發明涉及一種基于dI修飾引物和內切核酸酶V的等溫PCR核酸擴增方法，擴增目標核酸的引物與模板完全配對，5＇端第10-30位含有1-5個dI核苷酸，dI核苷酸下游具有10-30個核苷酸。等溫PCR反應組分包括dI修飾的正向引物與反向引物、目標核酸模板分子、dATP、dTTP、dCTP、dGTP共4種脫氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、內切核酸酶V、單鏈DNA結合蛋白和解螺旋酶。等溫PCR混合物經過最初的熱變性、雜交退火后，在恒定溫度下進行PCR。擴增過程中由內切核酸酶V實現引物-模板復合物的循環再生，引發DNA合成反應；單鏈DNA結合蛋白與解螺旋酶可提高等溫PCR效率。本發明目標核酸的擴增不依賴于熱循環儀，操作簡便，可用于目標核酸的大規模高產量擴增。
文檔編號C12N15/09GK101182514SQ20071004795
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月8日 優先權日2007年11月8日
發明者劉喜朋, 劉建華 申請人:上海交通大學