一種功能化氧化石墨烯載體的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明屬于蛋白質的固定化領域，涉及一種功能化氧化石墨稀載體的制備以及在蛋白質的快速固定化中的應用。
【背景技術】
[0002]自從固定化技術問世以來，固定化技術正在以空前的速度向前發展，并不斷完善。其中，固定化酶是近十余年發展起來的酶應用技術，在工業生產、化學分析和醫藥等方面有誘人的應用前景(參見:郭立泉，王紅宇，酶的固定化技術的研宄進展，吉林工商學院報，2008)ο酶，作為一種具有生物催化功能的高分子物質，絕大多數為蛋白質。將酶作為催化劑用于催化反應，具有高度專一性，高效性，反應條件溫和。然而，游離酶難以與反應產物分離，且不能重復使用，造成生產成本高，經濟效益低，嚴重阻礙了酶的廣泛使用。因此，需要使用一些技術來提高酶的使用率。酶的固定化技術是用固體材料將酶束縛或限制于一定區域內，酶仍能進行其特有的催化反應，并可回收及重復利用的一類技術。該技術所得到的固定化酶具有易分離，反復多次使用等特點，為提高酶的使用效率，降低生產成本提供了可能性。
[0003]近年來，石墨烯作為一種具有層狀結構的新型材料，在電子和半導體行業中應用廣泛(參見:Jung YU, Oh S，Choa S-H, Kim H-K, Kang SJ, Electromechanicalproperties of graphene transparent conducting films for flexible electronics.Current Applied Physics, 2013)o值得注意的是，氧化石墨稀(G0)，因其強大的機械性能與很好的生物兼容性而具有廣泛的應用。特別是在生物應用上，氧化石墨烯表面因具有豐富的羧基和較大的比表面積，且含有大量的官能團，如環氧基，羥基和羧酸(參見:Lee H，Jeong HKj Han Jj Chung H-Sj Jang S-Hj Lee C， Increased thermal stability ofcold-adapted esterase at ambient temperatures by immobilizat1n on grapheneoxide.B1resource Technology, 2013)，無需進一步進行結構修飾，從而作為一種理想的載體被用于酶的固定化，如N.Singh將半乳糖苷酶固定在功能化的石墨稀片層結構上，得到了 84%的固定化效率，且制備的固定化酶的穩定性明顯提高(參見:N.Singh, G.Srivastavaj et al.Cicer a -galactosidase immobilizat1n onto funct1nalizedgraphene nanosheets using response surface method and its applicat1ns.FoodChemj 2014) ；Bao等將胰蛋白酶固定在二氧化娃修飾的氧化石墨稀上，制備出一種有效的微芯片，用于蛋白質的水解(參見:HuiminBao，Luyan Zhang, Gang Chen.1mmobilizat1nof trypsin via graphene oxide-siIica composite for efficient microchipproteolysis, Journal of Chromatography A，2013)。然而，這些方法都有值得改進之處。本發明利用Ρ-β -硫酸醋乙基諷苯胺(SESA)對氧化石墨稀進行活化，得到的ABSE基團比較大，疏水性強，具有較大的擺動自由度，減少由于大分子載體造成的空間位阻，同時達到提高固定化酶活力或蛋白質活性的目的。目前尚未有用此方法對氧化石墨烯進行結構修飾的研究報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種快速共價固定化酶等蛋白質的方法，無需加入偶聯劑，且大大縮短了固定化時間。
[0005]本發明的另一目的是提供這種用于快速共價固定化酶等蛋白質的功能化氧化石墨烯載體的制備方法。
[0006]為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下:
功能化氧化石墨稀載體的制備方法，包括如下步驟:
(1)將P-β -硫酸酯乙基砜苯胺(SESA)溶解在蒸餾水中，在30-50 °C下用ImoI/L的Na2CO3溶液將pH調至中性，然后加入氧化石墨烯(G0)，并用0.5mol/L的NaOH溶液調節pH到9.0-14.0，進行醚化反應，反應結束后，用蒸餾水清洗數次，得到對氨基苯磺酰乙基氧化石墨烯(ABSE-GO)；
(2)將蒸餾水、HCl溶液、NaNO2溶液的混合液加入到步驟(I)制備的ABSE-GO中發生重氮化反應，反應結束后，用HCl溶液清洗數次，真空干燥后，得到功能化氧化石墨烯載體。
[0007]步驟(I)中，蒸餾水中SESA的濃度為lmg/ml，P- β -硫酸酯乙基砜苯胺和氧化石墨烯的質量之比為1:1。
[0008]步驟(I)中，所述醚化反應的溫度為100-200°C，時間為20-60min。
[0009]步驟(I)中，所述氧化石墨稀是利用Hummers方法制備的，具體步驟為:稱取Ig石墨粉溶解在25ml濃硫酸中(冰浴)，依次加入I g NaNO3,3 g KMnO4，之后將混合物加熱到350C，持續攪拌反應30min，加入50 ml的蒸餾水后，將反應物的溫度上升到90°C，繼續持續攪拌反應I h后，加入40 ml的蒸餾水和3 ml的30%過氧化氫終止反應，將反應物過濾，蒸餾水清洗后，將產物懸浮在蒸餾水中超聲5min，離心后收集，40°C真空干燥，得到氧化石墨烯。
[0010]步驟(2)中，所述HCl溶液的濃度為:0.5-2M;NaN02S液的質量百分濃度為:5-10% ;蒸飽水、HCl溶液、NaNO2溶液的體積比為2:1:1。
[0011]步驟(2)中，所述重氮化反應的條件為:冰浴，反應時間為20-60min ;所述真空干燥的溫度為25-50°C，時間為10-20 ho
[0012]所述SESA與NaNO2的質量比為4:1。
[0013]所述功能化氧化石墨烯用于酶等蛋白質的固定化的應用，具體應用方法為:
稱取25-50mg的上述功能化氧化石墨稀置于離心管中，加入0.2-lml的蛋白質溶液，再加入pH 3.0-12.0的緩沖液，使其總反應體積為I ml，反應l_60min后，離心取出部分上清液，再加入Iml上述緩沖液，混勻后離心，取出部分上清液，繼續加入Iml上述緩沖液，混勻后離心，除去全部上清液，采用Brandford法測定兩次上清液中的蛋白含量，并計算固定化收率，采用DNS顯色法或PDAB法測定固定化酶的酶活，并計算固定化效率。
[0014]所述蛋白質可以為形狀各異的蛋白質，包括纖維素酶，青霉素G酰化酶或牛血清蛋白O
[0015]所述緩沖液為檸檬酸緩沖液，磷酸鹽緩沖液或Tris，HEPES緩沖液。
[0016]本發明的有益效果:
(I)本發明可用于形狀各異的蛋白質的固定化，適用范圍廣； (2)本發明載體可直接與蛋白質進行共價結合，快速的完成的蛋白質的固定化；
(3)本發明可采用不同的活化劑對氧化石墨烯進行活化，適用性強；
(4)本發明增加了載體上蛋白質分子的擺動自由度，減少由于大分子載體造成的空間位阻，以提高固定化蛋白質的活力；
(5)本發明提高了蛋白質固定化的收率與效率，且操作簡單。
[0017]【附圖說明】:
圖1為制備的氧化石墨烯的SEM與TEM圖；
圖2為制備的氧化石墨烯與功能化氧化石墨烯的紅外分析圖；
圖3為實施例1的固定化的時間圖；
圖4為實施例2的固定化的時間圖；
圖5為實施例3的固定化的時間圖。
[0018]附圖標記說明:■ Yield為蛋白質固定化收率；.Efficiency為酶活力回收收率。
【具體實施方式】
[0019]下面結合附圖以及具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍并不限于此。
[0020]以下實施例所用主要儀器和材料。
[0021]實驗材料:石墨粉、SESA、纖維素酶、青霉素G酰化酶、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G250、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酒石酸鉀鈉、3，5- 二硝基水楊酸。
[0022]實驗儀器:數顯恒溫水浴鍋(HH-S，江蘇省金壇市醫療儀器廠)、紫外可見分光光度計(UV-1800，上海美普達儀器有限公司)、快速混勻器(SK-1，江蘇金壇中大儀器廠)、四維旋轉混勻器(BE-1100，海門市其林貝爾儀器有限公司)、真空干燥器(DZF-6020，上海一恒科技儀器有限公司)。
[0023]實施例1固定化纖維素酶
稱取Ig石墨粉溶解在25ml濃硫酸中(冰浴)，依次加入I g NaNO3,3 g KMnO4，之后將混合物加熱到35°C，持續攪拌反應30min，加入50 ml的蒸餾水后，將反應物的溫度上升到90°C，繼續持續攪拌反應I h后，加入40 ml的蒸餾水和3 ml的30%過氧化氫終止反應，將反應物過濾，蒸餾水清洗后，將