黃曲霉毒素b1核酸適配體及其在樣品磁分離中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種黃曲霉毒素B1核酸適配體及其在樣品 磁分離中的應用。
【背景技術】
[0002] 影響農產品質量安全的危害因子中真菌毒素的污染是最主要的因素之一。黃曲霉 毒素（Aflatoxins，AF)作為一種天然污染源主要存在于花生、玉米、大米、小麥、牛奶、棉籽 和各種堅果以及飼料中，是一類化學結構相似的真菌毒素的總稱，屬二呋喃氧雜萘鄰酮的 衍生物，目前已發現20多種，主要包括81、82、61、6211和112等。4?81是迄今發現毒性最 強的真菌毒素，其毒性較氰化鉀強10倍，較砒霜強68倍，主要損傷肝臟等器官誘發肝癌，已 經成為人類肝癌發病的重要因素并被世界衛生組織認定為一類致癌物。AFB1理化性質比較 穩定，具有脂溶性，耐高溫，難去除，對人畜健康是一種潛在的嚴重威脅。國際上食品衛生和 農產品貿易中AFB1含量是必檢指標，目前世界各國都制定了食品中AF允許量的國家標準， 因此開展針對AFB1的識別及檢測研究具有重要的科學意義及應用價值。
[0003] 目前，世界上通用的AF檢測方法主要分兩大類：化學分析法和免疫分析法。薄層 色譜法（TLC)、微柱法、高效液相色譜法（HPLC)等屬于化學分析法，這些檢測方法靈敏度 高、準確度好，但是樣品前處理復雜、檢測較為耗時、儀器設備比較貴重，且對檢測人員具有 較高的技術要求。酶聯免疫吸附法（ELISA)靈敏、安全、快捷、抗干擾，是目前普遍實用的 AF免疫檢測方法，然而AF這類小分子毒性較高，抗體制備周期長、技術難度大、批間差異 大，且制備好的抗體不易保存、易失活，這些缺點大大限制了免疫學分析方法的推廣和快速 發展。核酸適配體作為一類單鏈寡核苷酸，被稱作"化學抗體"，與抗體相比具有靶標范圍 廣（甚至是毒性靶標）、可體外制備、開發周期短、生產成本低、特異性高、穩定性好、品質均 一、批間差異小且易于化學合成和修飾等優點。
[0004] 目前，基于核酸適配體的快速檢測技術研發越來越熱，在醫學檢測領域已經非 常廣泛，而在真菌毒素檢測方面的應用報道還僅限于赭曲霉毒素A(OTA)和伏馬毒素 B1 (FBI)。因此，針對AF的分子識別元件核酸適配體的開發具有重要的研究意義和廣闊的 應用前景，特別是其高度的靶分子識別特異性（能夠區分單個修飾基團的差別，如茶堿的 核酸適配體能夠區分可卡因與茶堿分子，二者只有一個甲基的差別），非常適合AF這類結 構極其相似的小分子分析。
【發明內容】
[0005] 本發明的首要目的在于克服現有技術中存在的缺點與不足，提供一種黃曲霉毒素 B1核酸適配體，該核酸適配體能夠特異性識別黃曲霉毒素B1，其篩選過程采用自由態靶標 篩選策略即篩選過程保持黃曲霉毒素B1為游離狀態，不對其進行任何修飾。
[0006] 本發明的另一目的在于提供所述的黃曲霉毒素B1核酸適配體在樣品磁分離中的 應用。
[0007] 本發明的目的通過下述技術方案實現：一種黃曲霉毒素B1核酸適配體，其核苷酸 序列如下所示：
[0008] CCTGCCACGCTCCGCAAGCTTATAGGGCACGTGTTGTCTTCCTGTGTCTCGTGCCCATCGCTAGGTTTA CATAAGCTTGGCACCCGCATCGT。
[0009] 所述的黃曲霉毒素B1核酸適配體具有如圖6所示的二級結構。
[0010] 所述的黃曲霉毒素B1核酸適配體可以應用于樣品磁分離。
[0011] 優選的，所述的黃曲霉毒素B1核酸適配體可以應用于樣品中黃曲霉毒素B1磁分 離。
[0012] 所述的黃曲霉毒素B1核酸適配體包括氨基修飾上述核苷酸序列的衍生序列，所 述的氨基修飾核酸序列的衍生序列具有與黃曲霉毒素B1核酸適配體原序列相同的從樣品 中進行黃曲霉毒素B1磁分離功能。
[0013] 所述的黃曲霉毒素B1核酸適配體應用于樣品中黃曲霉毒素B1磁分離，包括如下 步驟：
[0014] (1)將氨基修飾的黃曲霉毒素B1核酸適配體交聯到羧基修飾的磁珠上；
[0015] (2)將修飾有黃曲霉毒素B1核酸適配體的磁珠與含有黃曲霉毒素B1的樣品提取 液混合，利用磁分離架富集磁珠，然后洗滌，最后洗脫得到純度濃度高的黃曲霉毒素B1。 [0016] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
[0017] 1)本發明的黃曲霉毒素B1核酸適配體是通過自由態靶標篩選策略獲得，篩選過 程不涉及靶標分子的修飾，因此獲得的黃曲霉毒素B1核酸適配體具有更好的特異性。
[0018] 2)與抗體相比，黃曲霉毒素B1核酸適配體作為一種單鏈DNA，穩定性好，便于保 存，易于修飾與標記，同時可以大量化學合成，批次間差異小，成本低廉。
【附圖說明】
[0019] 圖1是文庫在磁珠上的固定效果圖：A為裸磁珠突光顯微鏡成像圖；B為固定有突 光標記文庫復合物的磁珠熒光顯微鏡成像圖；
[0020] 圖2是篩選文庫親和力隨篩選輪次增加的變化情況結果圖；
[0021] 圖3是篩選文庫結合特異性考察結果圖；
[0022] 圖4是氨基修飾黃曲霉毒素B1核酸適配體在磁珠上的交聯結果圖：A為交聯后磁 分離之后的上清；B為黃曲霉毒素B1核酸適配體交聯之前的原液；
[0023] 圖5是黃曲霉毒素B1核酸適配體修飾磁珠的磁分離效果圖：A)為黃曲霉毒素B1 的500nM的乙腈水溶液（1:1) ;B)同濃度的黃曲霉毒素B1篩選緩沖液經過黃曲霉毒素B1 核酸適配體修飾的磁珠捕獲-磁分離-洗脫后的乙腈水溶液（1 :1) ;C)為同濃度的黃曲霉 毒素B1篩選緩沖液經過裸磁珠捕獲-磁分離-洗脫后的乙腈水溶液（1 :1);
[0024] 圖6是黃曲霉毒素B1核酸適配體的二級結構圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0026] 實施例1
[0027] 黃曲霉毒素B1核酸適配體的自由態靶標篩選
[0028] 本實施例中所使用的SELEX單鏈DNA隨機文庫的設計為：兩端為引物固定序 列，中間為用于往磁珠上固定文庫的固定序列，兩端固定序列與中間固定序列之間各有 一段隨機文庫序列：5' -CCTGCCACGCTCCGCAAGCTT-N10-CTGCAGCGATTCTTGATCG-N20-TAAG CTTGGCACCCGCATCGT-3 '，庫容1014以上。該文庫設計與傳統的固定序列在兩端的設計 不同，一方面兩端的引物固定序列在篩選過程中采用短序列進行雜交封閉，避免了文庫 在與靶標結合過程中引物序列參與結合，同時具有更大的下游開發便利性，中間文庫固 定序列可以引入熒光標記短鏈序列，便于設計"結構開關型"核酸適配體傳感器。所用 引物P1 :5' -Cy3-GCGGAGCGTGGCAGG-3,引物 2 :5' -ACGATGCGGGTGCCAAGCTTA-3'，引物 3 : 5, -C