p18小分子抑制劑及在人造血干細胞體外擴增中的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥領域，特別涉及P18小分子抑制劑及其在人臍帶血來源造血干細 胞的體外擴增中的用途。
【背景技術】
[0002] 干細胞因其具有自我更新及多向分化的能力而成為臨床上治療多種疾病的有效 途徑之一，這也代表了再生醫學新時代的到來。其中造血干細胞研宄開始最早、研宄最為深 入且應用最為廣泛。應用骨髓移植治療白血病等惡性血液疾病已有50多年的歷史。但骨 髓中造血干細胞數量較低，移植后難以在病人體內有效進行造血重建，這也成為干細胞臨 床應用的一個瓶頸。
[0003] 造血干細胞在體內有多種選擇，例如自我更新、分化、迀移（歸巢）、靜息、凋亡等， 在這些不同的選擇背后，有一個非常復雜的信號通路網絡調節造血干細胞的不同命運。例 如Wnt、Notch、Shh/BMP、TGF-0、IGF等發育相關的調節蛋白，Bmi等染色質相關因子，HoxB、 NFk等轉錄因子，INK4、KIP、PTEN等細胞周期調節蛋白等均參與了該信號調節網絡。對于 造血干細胞而言，其最為重要的特性即為自我更新。目前已有多項研宄指出，造血干細胞的 自我更新調節與細胞周期的調節息息相關。進入細胞周期是造血干細胞進行自我更新的最 后一步，因此細胞周期，尤其是G1期的調節可能會對造血干細胞的自我更新產生至關重要 的作用。
[0004] 細胞周期主要通過連續的細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs)的活性變化來調控， 而⑶K的活性又必須取決于Cyclin的含量水平。在體內，除了Cyclin和催化亞基的磷酸 化/去磷酸化的調控，CDK很大程度上還受CKIs(細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑）的調控。 目前已知CKI中兩類低分子量家族蛋白，Cip/Kip和INK4可以與⑶K反應，并可抑制細胞 通過G1期。其中，Cip/Kip家族，主要包括p21，p27和p57,可以與很多Cyclin-CDK復合物 反應；INK家族，主要包括pl6，pl5,pl8和pl9,可以特異性的抑制CDK4、6。
[0005] 越來越多的研宄表明，相對于其他的CKI而言，pl8對造血干細胞的自我更新調控 作用更為強大。例如，P18的缺失會導致小鼠造血移植率的顯著升高，并且該種作用是通過 提高造血干細胞對稱性自我更新分裂的比率來實現的，相較于以往單純提高造血干細胞的 增殖效率，提高其對稱性分裂可免于導致造血干細胞的分化和耗竭。因此，P18是一個特異 影響造血干細胞自我更新的獨特的INK蛋白。
[0006] 目前體外擴增造血干細胞主要依靠向培養基中添加血清以及SCF、TPO、Flt3L等 細胞因子，但擴增效果仍不理想，造血干細胞在體外很快便發生分化、衰竭。之前的研宄中 曾采用加入多種細胞因子液體培養基、與基質細胞共同培養或在生物反應器中培養等方法 以體外擴增造血干/祖細胞，但上述方法仍不能獲得充足的具有移植能力的造血干細胞來 進行臨床治療。
[0007] 而小分子化合物則在體外培養中顯示了其獨特的優勢。首先，化合物的作用效果 可通過調節化合物的結構、濃度來改變，其過程簡單可控；其次，小分子化合物相較于細胞 因子或轉錄因子等其性質更為穩定，化合物的前期處理以及給藥非常方便。因此，在傳統擴 增造血干細胞的方法中加入小分子化合物，甚至完全采用小分子化合物替代現有的血清、 細胞因子等物質，可能對體外培養造血干細胞發揮重要作用。
[0008] 本發明旨在研宄制得一種新的pl8小分子抑制劑，并通過該pl8小分子抑制劑體 外培養人造血干細胞，以達到造血干細胞的體外擴增的目的。
【發明內容】
[0009] 本發明目的在于克服現有技術的不足，提供一種P18小分子抑制劑及其在人造血 干細胞體外擴增中的用途。
[0010] 本發明采用的技術方案為：
[0011] -種pl8小分子抑制劑，其結構為：
【主權項】
1. 一種pl8小分子抑制劑，其特征在于：其結構為：
2. 權利要求1所述pl8小分子抑制劑的制備方法，其特征在于：包括如下步驟： 在冰浴條件下，將環己胺和對羧基苯磺酰氯溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，攪拌1小 時，升至室溫后，繼續攪拌，TLC監控反應完成后，旋轉蒸發除去反應溶液，殘余物純化，得中 間體； 在冰浴條件下，將所得中間體溶解在水中，加入氫氧化鈉，升至室溫后，攪拌30分鐘， 所得反應液真空凍干，得終產品。
3. 權利要求1所述pl8小分子抑制劑在人造血干細胞體外擴增中的用途。
4. 根據權利要求3所述的用途，其特征在于：所述用途中，pl8小分子抑制劑在擴增培 養基中的濃度為10_50nM。
5. -種人造血干細胞體外擴增方法，其特征在于：包括如下步驟：將新鮮分離的人臍 帶血CD34+細胞使用擴增培養基（StemSpanSFEM培養基 +[100ng/mL]SCF/TP0/Flt3L/ IL-6)重懸至細胞濃度為5X104細胞/mL，然后鋪于96孔板中，每孔為190yL細胞懸液， 隨后向其中添加10UL使用同種擴增培養基稀釋過的pl8小分子抑制劑，pl8小分子抑制 劑的終濃度為20nM，在37°C，5%C02恒溫培養箱中培養7天。
【專利摘要】本發明涉及p18小分子抑制劑及在人造血干細胞體外擴增中的用途，其結構為：本發明還提供了該p18小分子抑制劑的制備方法及用途，本發明p18小分子抑制劑對于人造血干細胞自我更新具有較好的促進作用，可為日后臨床治療提供新的方法。
【IPC分類】C07C303-38, C12N5-0789, C07C311-20
【公開號】CN104693075
【申請號】CN201510081641
【發明人】程濤, 解向群, 高瀛岱, 楊鵬
【申請人】程濤, 解向群, 高瀛岱
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月13日