一種擴增臍帶血造血干細胞的細胞因子及其培養基的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種細胞因子，該細胞因子是由以下制備方法得到的，其包括如下步驟：（1）處理代基質細胞；（2）得到永生化細胞；(3)將（2）步篩選出的胎肝細胞連續傳代，得到細胞系；（4）得到總RNA；(5)反轉錄成cDNA；（6）做基因芯片分析；(7)選取能刺激臍帶血造血干細胞體外增殖的小鼠胎肝細胞中高表達的基因序列；（8）將（7）檢索核苷酸序列；（9）得到293T細胞；(10)得到293T細胞相對應的蛋白；(11)將(10)純化的蛋白添加到含有SCF,TPO,FLT3L,PTN的StemSpan培養基中，驗證能促進臍帶血造血干細胞的體外增殖。其優點為，顯著提高臍帶血造血干細胞的擴增倍數，維持干細胞特性的目的。
【專利說明】—種擴增臍帶血造血干細胞的細胞因子及其培養基
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體為一種擴增臍帶血造血干細胞的蛋白及其培養基。
【背景技術】
[0002]造血干細胞在治療白血病、惡性腫瘤、重癥非惡性血液系統疾病以及某些遺傳性疾病中有廣泛的應用，是因為這類細胞具有自我更新、高度繁殖、向多個方向分化等能力，這也意味著造血干細胞在臨床治療惡性血液疾病上具有巨大應用價值。
[0003]目前，用以移植的造血干細胞主要有三種來源:骨髓，外周血和臍帶血。骨髓和外周血是目前廣泛應用的造血干細胞移植來源，但是存在配型困難，采集過程會給供者帶來痛苦等問題。臍血移植在一定程度上避免了這些問題。但是對于成人而言，單份臍血的造血干細胞不夠患者使用并且臍血造血干細胞相對于成體骨髓和外周血造血干細胞處于更加幼稚階段，移植后病人造血功能恢復緩慢，增加了移植后病人的痛苦。因此體外擴增臍帶血造血干細胞則是最有希望解決上述瓶頸的途徑之一。
[0004]當前，進行體外擴增臍帶血造血干細胞的主要方法是通過加入不同細胞因子組合(如干細胞生長因子-SCF、多效生長因子-PTN、Fms樣酪氨酸激酶_3配體-FLT3L和血小板生成素-ΤΡ0)刺激臍帶血造血干細胞的增殖。但是擴增得到的造血干細胞卻在很大程度上失去了干細胞的特性或是自我更新的能力減弱或是向下游血液細胞分化的潛能丟失。
【發明內容】
[0005]為解決現有技術中臍血造血干細胞體外擴增倍數不高、不能維持干細胞特性的缺陷，本發明發現公開了一種擴增臍`帶血造血干細胞的細胞因子及其培養基，實現顯著提高臍帶血造血干細胞的擴增倍數，維持干細胞特性的目的。
[0006]實現上述目的采用的技術方案為，本發明開發出了一種擴增臍帶血造血干細胞的細胞因子，該細胞因子是由以下制備方法得到的，其包括如下步驟，(I)從胎齡為11天的小鼠胎肝中分離出胎肝基質細胞；胎肝是哺乳動物個體發育過程中活力最強的造血器官，胎肝里面含有支持造血干細胞增殖的基質細胞；胎肝基質細胞在體外培養會貼壁生長；
[0007](2)經步驟(1)分離出來的胎肝基質細胞，用SV40大T抗原轉化這些原代基質細胞后連續傳代30次以上得到永生化基質細胞；
[0008](3)將(2)步建立的永生化基質細胞，分別挑取單個的基質細胞100個并分別擴大培養，得到20株永生細胞；篩選出的細胞株在培養液中很好的傳代，得到細胞系，進一步將這些細胞系分別與臍帶血造血干細胞共培養，發現其中一株細胞對造血干細胞有增殖的作用且可維持干細胞特性；
[0009](4)將(3)步篩選出的細胞做基因芯片分析，發現5’ -TAACCCTGAGGTCACTTAACCCATTTTCCCTAACTGAGGCTTAGATGACACGAGGGAAAA-3’的序列在該細胞內高表達；在美國國立生物信息中心數據庫中搜索出該片段只位于ANGPTL7基因內；我們可以構建出該基因序列，精確的保證了應用其序列形成的細胞因子對臍帶血造血干細胞的增殖作用；
[0010](5)將(4)篩選到基因的CDNA連同一段編碼六個組氨酸的核苷酸序列5’ -CACCATCATCATCATCAT-3’克隆到能夠把目的基因導入到基因組中的PB載體中，然后通過脂質體轉染的方法將該載體與另一個含有編碼PB酶的輔助載體一起轉染293T細胞得到能夠過表達目的基因的293T細胞；
[0011](6)將(5)構建好的能表達目的蛋白ANGPTL7的293T細胞擴大培養，利用鎳離子親和純化的方法純化出目的蛋白；
[0012](7)將(6)純化的蛋白添加到含有SCF, ΤΡ0, FLT3L, PTN的StemSpan培養基中培養臍帶血造血干細胞最終驗證ANGPTL7促進臍帶血造血干細胞的體外增殖同時維持造血干細胞特性的功能。
[0013]所述步驟(3)中將(2)步篩選出的胎肝細胞培養增殖所使用的培養基為含有質量濃度分別為10%血清、1%雙抗的a-MEM培養基。利用此培養基可以很好進行細胞傳代、擴增并建立細胞系。
[0014]本發明還公開了包括上述細胞因子的培養基，該培養基為StemSpan培養基，培養基包括 50-100ng/ml 的 SCF, 20_50ng/ml TPO, 50_100ng/ml FLT3L, 50_100ng/ml PTN,
[0015]上述的培養基還包括200ng/ml-2ug/ml ANGPTL7蛋白。利用該培養基可以有效促進臍帶血造血干細胞增殖，同時保持造血干細胞的特性。
[0016]綜上，本發明的 效果，能夠顯著提高臍帶血造血干細胞的擴增倍數，并且能夠使造血干細胞維持干細胞的特性，把利用本發明培養基培養出的臍帶血造血干細胞移植到免疫缺陷鼠的體內，發現不僅提高了免疫缺陷鼠體內人體造血干細胞來源的細胞比率還縮短了臍帶血造血干細胞重構免疫缺陷小鼠造血系統的時間。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為利用本發明培養基和傳統培養基培養造血干細胞的結果曲線圖，曲線I為傳統培養基的造血干細胞曲線，曲線2為本發明培養基的造血干細胞曲線；
[0018]圖2為利用本發明培養基和傳統培養基培養造血干細胞第12天的流式細胞分析儀的結果對比圖譜，左側為本發明的培養圖譜，右側為傳統方法的培養圖譜；
[0019]圖3為利用本發明培養基和傳統培養基培養造血干細胞的絕對數變化圖，曲線3為本發明培養基的絕對數變化曲線，曲線4為傳統培養基的絕對數變化曲線；
[0020]圖4為利用本發明培養基和傳統培養基培養后的臍血造血干細胞進入到小鼠體內，一個月后檢測小鼠外周血中人源細胞的比例的對比圖；左側為利用本發明培養基后的臍血進入到小鼠體內，小鼠外周血中人源細胞比例的圖譜，右側為傳統方法的圖譜；
【具體實施方式】
[0021]以下結合具體實施例進一步說明本發明的內容。
[0022]實施例一:本發明開發出的一種擴增臍帶血造血干細胞的細胞因子，該細胞因子是由以下制備方法得到的，其包括如下步驟，(I)從胎齡為11天的小鼠胎肝中分離出胎肝基質細胞；胎肝是哺乳動物個體發育過程中活力最強的造血器官，胎肝里面含有支持造血干細胞增殖的基質細胞；胎肝基質細胞在體外培養會貼壁生長；[0023](2)經步驟(1)分離出來的胎肝基質細胞，用SV40大T抗原轉化這些原代基質細胞后連續傳代30次以上得到永生化基質細胞；
[0024](3)將(2)步建立的永生化基質細胞，分別挑取單個的基質細胞100個并分別擴大培養，得到20株永生細胞；篩選出的細胞株在培養液中很好的傳代，得到細胞系，進一步將這些細胞系分別與臍帶血造血干細胞共培養，發現其中一株細胞對造血干細胞有增殖的作用且可維持干細胞特性；
[0025](4)將(3)步篩選出的細胞做基因芯片分析，發現5’ -TAACCCTGAGGTCACTTAACCCATTTTCCCTAACTGAGGCTTAGATGACACGAGGGAAAA-3’的序列在該細胞內高表達；在美國國立生物信息中心數據庫中搜索出該片段只位于ANGPTL7基因內；我們可以構建出該基因序列，精確的保證了應用其序列形成的細胞因子對臍帶血造血干細胞的增殖作用；
[0026](5)將(4)篩選到基因的cDNA連同一段編碼六個組氨酸的核苷酸序列5’ -CACCATCATCATCATCAT-3’克隆到能夠把目的基因導入到基因組中的PB載體中，然后通過脂質體轉染的方法將該載體與另一個含有編碼PB酶的輔助載體一起轉染293T細胞得到能夠過表達目的基因的293T細胞；
[0027](6)將(5)構建好的能表達目的蛋白ANGPTL7的293T細胞擴大培養，利用鎳離子親和純化的方法純化出目的蛋白；
[0028](7)將(6)純化的蛋白添加到含有SCF, TPO, FLT3L, PTN的StemSpan培養基中培養臍帶血造血干細胞最終驗證ANGPTL7促進臍帶血造血干細胞的體外增殖同時維持造血干細胞特性的功能。
[0029]所述步驟(3)中將(2)步篩選出的胎肝細胞培養增殖所使用的培養基為含有質量濃度分別為10%血清、1%雙抗的a-MEM培養基。利用此培養基可以很好進行細胞傳代、擴增并建立細胞系。
[0030]本發明還公開了包括上述細胞`因子的培養基，該培養基為StemSpan培養基，培養基包括 50ng/ml 的 SCF, 20ng/ml TPO, 50ng/mlFLT3L, 50ng/ml PTN,
[0031]上述的培養基還包括200ng/ml ANGPTL7蛋白。
[0032]本發明公開的擴增造血干細胞的培養基，包括營養液和血清替代物StemSpan，血清替代物由Stem Cell試劑公司提供，產品編號為09655。所述培養基中的1%雙抗，由life試劑公司提供，產品編號為1266328。
[0033]上述每毫升營養液中包括的SCF、TP0，FLT3L、PTN均是由P^roTech公司提供，產品編號依次為=300-07, 300-18, 300-19,405-15 的產品。
[0034]利用本發明的培養基與傳統的培養基相比，造血干細胞的擴增倍數增加到9-15倍，同時維持了造血干細胞的特性，以下試驗證明本發明的培養基使造血干細胞的擴增倍數增加:
[0035](I)從臍帶血中分離外周血白細胞:將臍帶血與生理鹽水等比例混合，在離心管中加入待加入稀釋血液二分之一體積的Ficoll-Hypaque，將稀釋后的血液沿離心管壁緩緩疊加于分層液面上，注意保持液面的清楚，2500r/min離心20min，小心吸取中間云霧層細胞，再用無血清1640培養基或PBS清洗兩次，分離出的細胞待用；
[0036](2)細胞培養:將預先配制好的培養基培養臍帶血外周白細胞放入C02培養箱。每天半量換液，補充細胞因子和ANGPTL7并記錄最初的細胞個數。取步驟(1)分離出的另一部分造臍帶血白細胞，利用現有培養基培養，記錄細胞個數；
[0037](3)每三天對培養的細胞進行細胞計數流式檢測，觀察培養體系中細胞數量和CD34+CD38-的比例變化。發現第九天后利用本發明培養基中明顯比傳統培養方法快，并且培養到第十二天時CD34+CD38-的比例是傳統培養基的2_3倍。到第十八天時傳統培養基中CD34+CD38-細胞的絕對數增加了 26倍，本發明培養基增加了 90倍。結果如圖1所示，曲線I為利用傳統方法培養的結果，曲線2為本發明方法培養的，最開始分別種2x106個細胞，每三天對細胞進行計數，得到結果。如圖2所示，左圖中額外加了 ANGPTL7，右圖只含有SCF, TPO, FLT3L, PTNS的temSpan中培養第12天時的流式圖，如圖3所示，曲線3代表⑶34+⑶38-加了 ANGPTL7培養基條件下的絕對數變化圖，曲線，4代表⑶34+⑶38-未加本發明細胞因子的絕對數變化。
[0038]利用顯微鏡觀察細胞集落形成能力:分別取等數量培養9天時的本發明和傳統培養基培養的臍帶血外周白細胞，發現本發明培養基中形成的克隆數和CFU-GEMM的克隆數是傳統法的1.5倍和2倍。
【權利要求】
1.一種擴增臍帶血造血干細胞的細胞因子，其特征在于，該細胞因子是由以下制備方法得到的，其包括如下步驟: (1)從胎齡為11天的胚胎小鼠中分離出胎肝基質細胞，然后用SV40大T抗原轉化這些原代基質細胞； (2)經步驟(1)轉染后的細胞篩選出對臍帶血造血干細胞有擴增作用的永生化細胞； (3)將(2)步篩選出的胎肝細胞連續傳代，得到細胞系，進一步檢測該細胞系對臍帶血造血干細胞的擴增作用及對維持干細胞特性的作用； (4)經(3)步驗證后，提取(3)步中篩選出來能刺激臍帶血造血干細胞體外增殖的小鼠胎肝細胞與不能支持臍帶血造血干細胞體外增殖的細胞3T3的總RNA ； (5)將(4)中提取的能刺激臍帶血造血干細胞體外增殖的小鼠胎肝細胞與不能支持臍帶血造血干細胞體外增殖的細胞3T3的總RNA反轉錄成cDNA ； (6)將(5)得到的cDNA做基因芯片分析； (7)將(6)步得到的結果分析比較能刺激臍帶血造血干細胞體外增殖的小鼠胎肝細胞與不能支持臍帶血造血干細胞體外增殖細胞3T3的表達圖譜，發現5’-TAACCCTGAGGTCACTTMCCCATTTTCCCTAACTGAGGCTTAGATGACACGAGGGAAAA-3 ’的序列在能刺激臍帶血造血干細胞體外增殖的小鼠胎肝細胞中高表達； (8)將(7)的核苷酸序列在美國國立生物信息中心數據庫中搜索出該片段位于ANGPTL7基因內； (9)將(8)篩選到基因的cDNA連同一段編碼六個組氨酸的核苷酸序列5’ -CACCATCATCATCATCAT-3’克隆到能夠把目的基因導入到基因組中的PB載體中，然后通過脂質體轉染的方法將該載體與另一個含有編碼PB酶的輔助載體一起轉染293T細胞得到能夠過表達目的基因的293T細胞； (10)將(9)構建好的能表達目的蛋白的293T細胞擴大培養，利用鎳離子親和純化的方法純化出目的蛋白； (11)將(10)純化的蛋白添加到含有SCF，TPO,FLT3L, PTN的StemSpan培養基中，再利用這個含有目的蛋白的培養基培養臍帶血造血干細胞驗證ANGPTL7能促進臍帶血造血干細胞的體外增殖。
2.根據權利要求1所述的擴增臍帶血造血干細胞的細胞因子，其特征在于，所述步驟(3)中將(2)步篩選出的胎肝細胞培養增殖所使用的培養基為含有質量濃度分別為10%血清、1%雙抗的a -MEM培養基。
3.一種含有權利要求1所述細胞因子的培養基，其特征在于，該培養基為StemSpan培養基，該培養基包括 50-100ng/ml 的 SCF, 20-50ng/mlTP0, 50-100ng/ml FLT3L, 50-100ng/mlPTN。
4.根據權利要求3所述細胞因子的培養基，其特征在于，在StemSpan培養基中還包括200ng/ml-2ug/ml 的 ANGPTL7 蛋白。
【文檔編號】C07K14/52GK103509101SQ201310349485
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月12日 優先權日:2013年8月12日
【發明者】李鵬, 肖毅仁, 蔣志武, 賴允鑫, 姚瑤 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院