水稻基因OsVHA1在延緩植物葉片衰老和提高植物耐鹽性中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物基因工程和水稻分子育種技術領域，尤其涉及一種水稻基因 OsVHAI在延緩植物葉片衰老和提高植物耐鹽性中的應用。
【背景技術】
[0002] 水稻是最重要的糧食作物之一，世界上超過一半的人口以稻米為主食。在我國，隨 著人口的不斷增加和土地面積的減少，對于水稻產量增加的要求越來越迫切，國家糧食安 全戰略也就顯得尤為重要。因此，培育高產優質水稻品種，不斷提高水稻單產，是確保我國 糧食安全的第一重任。葉片是水稻最重要的光合器官，據理論推算，水稻籽粒灌漿的60%~ 80%營養物質來自葉片的光合作用。所以，水稻抽穗到灌漿期間，功能葉的過早衰老，將影 響水稻灌衆速度，進而導致產量和品質下降（ThomasHandSmartCM.Cropsthatstay green.AnnApplBiol，1993,123 :193-219)。研宄表明，若在水稻籽粒灌漿后期設法延長水 稻功能葉片的壽命1天，稻谷產量可以增加1%~2%左右（劉道宏.植物葉片的衰老.植 物生理學通訊，1993, 2 :14-19 ;馬躍芳和陸定志.灌水方式對雜交水稻衰老及生育后期一 些生理活性的影響，中國水稻科學，1990, 2 :56-6)。
[0003] 葉片衰老是一個細胞程序性死亡的過程，是水稻在長期進化和適應環境的基礎上 形成的，是其生長發育的一個必經階段。水稻葉片衰老常常伴隨著水解化合物的大量重組 并向植物生長部分運輸，例如幼嫩的葉片和發育的種子等，因此，葉片的衰老對水稻營養物 質分配再利用與生殖發育有重要意義（LimP0，KimHJ，NamHG.Leafsenescence.Annu RevPlantBiol，2007, 58:115-136)。葉片自然衰老，依賴年齡的方式進行，并由諸多環境 因素誘導，受生長發育時期復雜的內外因素之間的相互作用影響（YoshidaS.Molecular regulationofleafsenescence.CurrOpinPlantBiol，2003,6 :79_84;LimP0,KimH J，NamHG.Leafsenescence.AnnuRevPlantBiol，2007,58:115_136)D 外界因素包括 持續黑暗、澇害、干旱、鹽害、極端溫度和紫外線等，內部因素包括內源激素和大量衰老相關 基因等（LimP0，KimHJ，NamHG.Leafsenescence.AnnuRevPlantBiol，2007,58 : 115-136;WuXY，KuaiBK，JiaJZ，JingHC.Regulationofleafsenescenceandcrop geneticimprovement.JIntegrPlantBiol，2012,54 :936_952)〇Liu等（LiuL，ZhouY， ZhouG，YeR，ZhaoL，LiX，LinY.Identificationofearlysenescence-associated genesinriceflagleaves.PlantMolBiol，2008,67:37-55)利用抑制差減雜交法鑒定 獲得533個葉片衰老相關的差異表達基因，其功能涉及大分子物質代謝、調控蛋白質合成、 能量代謝、調芐基因、解毒、病原性和逆境、細胞骨架構成和花發育等。
[0004] 質子泵是依賴于ATP水解釋放的能量驅動逆濃度梯度轉運氫離子通過膜的膜整 合糖蛋白，從而造成膜兩側的pH梯度和電位梯度，進而調控植物生長發育。在植物細胞中 存在三類質子泵，分別是位于質膜上的質膜質子泵（PlasmaMembraneH+-ATPase)、位于液 泡膜上的H+_PPase(VacuolarH+-pyrophosphatse)以及囊泡型H+_ATPase(Vacuolar-type H+-ATPase)(GaxiolaRA，PalmgrenMG，SchumacherKS.Plantprotonpumps.FEBS Letters，2007, 581 :2204-2214)。其中囊泡型H+-ATPase不僅是植物細胞中最古老也是最 復雜的蛋白復合體，在結構上及組成上與F-typeATPase類似，由V0和VI兩個蛋白復合體 組成，前者位于膜內，由a、c、c"、d和e等5種亞基組成，總分子量約260kD，負責質子轉運； 后者是位于膜外的親水性復合體，由A-H等8種亞基組成，總分子量640kD，負責ATP的水解 (SchumacherK?KrebsM.TheV-ATPase：smallcargo，largeeffects.CurrOpinPlant Biol. 2010,13 :724-730)。在雙子葉模式植物擬南芥和單子葉模式植物水稻中，分別由28 個和 24個基因編碼 13個亞基（SchumacherK，KrebsM.TheV_ATPase:smallcargo,large effects.CurrOpinPlantBiol. 2010,13:724-730)。因此，囊泡型H+-ATPase作為質子泵 中的重要成員之一，最重要的功能是驅動H+逆濃度梯度泵入液泡腔中，酸化液泡，為物質運 輸提供能量，從而影響膨壓和細胞擴增；以及維持高爾基體、溶酶體、吞飲小泡和突觸小泡 等細胞器內的低pH值，為溶酶體的消化功能或受體介導的內吞后受體再循環或高爾基體 加工蛋白質等生理活動提供必要條件（RatajczakR.Structure，functionandregulation oftheplantvacuolarH(+)-translocatingATPase.BiochimBiophysActa. 2000?1465 ： 17-36；NishiT，ForgacM.Thevacuolar(H+)-ATPases-nature!smostversatile protonpumps.NatRevMolCellBiol. 2002, 3:94-10)DD 現有的研究顯示，植物囊泡型 H+-ATPase的主要功能為：其一是囊泡型H+-ATPase在轉運H+的基礎上調節液泡和細胞質中 的pH，以及調節細胞質中的Na+、Ca2+和K+等離子濃度，響應鹽脅迫（ApseMP，AharonGS， SneddenWA?BlumwaldESalttoleranceconferredbyoverexpressionofavacuolar Na+/H+antiportinArabidopsis.Science. 1999, 285 :1256-1258;YangMF，SongJ，Wang BS.Organ-specificresponsesofvacuolarH-ATPaseintheshootsandrootsofC halophyteSuaedasalsatoNaCl.JIntegrPlantBiol. 2010,52:308-314);其二是囊泡 型H+-ATPase的活性與眾多激素息息相關，能夠響應GA、ABA和SA(CooleyMB，YangH，Dahal P，MellaRA，DownieAB，HaighAM，BradfordKJ.VacuolarH(+)_ATPaseisexpressed inresponsetogibberellinduringtomatoseedgermination.PlantPhysiol. 1999， 121 :1339-1348);其三是囊泡型H+-ATPase的活性與NO信號傳導緊密相關，響應非生 物脅迫（ChenJ，XiaoQ，WuF，DongX，HeJ，PeiZ，ZhengH.Nitricoxideenhances saltsecretionandNa(+)sequestrationinamangroveplant，Avicenniamarina， throughincreasingtheexpressionofH(+)-ATPaseandNa(+)/H(+)antiporterunder highsalinity.TreePhysiol. 2010, 30 :1570-1585;ZhangY，WangL，LiuY，ZhangQ， WeiQ?ZhangW.Nitricoxideenhancessalttoleranceinmaizeseedlingsthrough increasingactivitiesofproton-pumpandNa+/H+antiportinthetonoplast. Planta. 2006,224 :545-555);其四是囊泡型H+-ATPase在細胞壁形成中扮演重要角色 (Schachtschabel等，2012 ;Chen等，2013);其五是囊泡型H+_ATPase還在植物葉片的保衛 細胞中起到重要作用，可以調節氣孔的開閉（ChenGl，LiuX，ZhangL，CaoH，LuJ，Lin F.InvolvementofMoVMA11，aPutativeVacuolarATPasecfSubunit，inVacuolar AcidificationandInfection-RelatedMorphogenesisofMagnaportheoryzae.PLoS One. 2013,8:e67804);以及囊泡型H+-ATPaseala2雙突變將導致葉尖以及花均出現不同 程度的壞死（KrebsM，BeyhlD，（:i6iiichE，Al-RasheidK，MartenI，StierhofY，Hedrich R，SchumacherK.ArabidopsisV-ATPaseactivityatthetonoplastisrequired forefficientnutrientstoragebutnotforsodiumaccumulation.PNAS，2010,107 : 3251-3256)〇
[0005]囊泡型H+_ATPase的A亞基（YacuolarH+_ATPaseA_subunit，簡稱VHA)和B亞 基主要參與ATP水解，A亞基是催化ATP水解的亞基，而B亞基則為非催化亞基，兩者均 有ATP結合位點。在單子葉水稻和玉米中均有2個基因編碼A亞基，而在雙子葉擬南芥 中則僅有 1 個基因編碼A亞基（SchumacherK，KrebsM.TheV-ATPase:smallcargo， largeeffects.CurrOpinPlantBiol. 2010，13 :724_730)，其在蘋果（DongQL，WangCR， LiuDD，HuDG，FangMJ，YouCX，YaoYX，HaoYJ.MdVHA-AencodesanapplesubunitA ofvacuolarH(+)-ATPaseandenhancesdroughttoleranceintransgenictobacco seedlings.JPlantPhysiol. 2013,15 ;170 :601_609)、甜菜（KirschM，AnZ，Viereck R，LowR，RauschT.SaltstressinducesanincreasedexpressionofV-type H(+)_ATPaseinmaturesugarbeetleaves.PlantMolBiol. 1996,32:543_547)、擬 南芥（MagnottaSM，GogartenJP.Multisitepolyadenylationandtranscriptional responsetostressofavacuolartypeH+_ATPasesubunitAgeneinArabidopsis thaliana.BMCPlantBiol. 2002,2:3)和番前（BageshwarUK，Taneja-BageshwarS， MoharramHM?BinzelMLTwoisoformsoftheAsubunitofthevac