mol/L的NaCl溶液鹽析，4°C沉淀10小時，去除上清液，絮狀溶液用高速冷凍離心機4°C、8000r/min、離心30分鐘，收集沉淀；
[0051](7)、用0.06mol/L的檸檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4標定pH = 6.5 ;溶液用透析袋動態透析72小時，用硝酸銀檢測無沉淀析出，透析完成。
[0052](8)、將脫鹽后的膠原蛋白溶液，-20°C預凍4小時，進而在真空冷凍干燥機中冷凍干燥，凍干產品經進一步處理可得到膠原蛋白微粉(含水率在3%以下)，鈷60輻照滅菌、包裝，得到成品膠原蛋白粉末，純度達到98%以上。
[0053]實施例3
[0054]一種生物醫用鼠尾膠原蛋白的提取方法，步驟如下:
[0055](I)、取新鮮鼠尾lkg，置于1: 1000新潔爾滅液內浸泡1min?15min，取出后用生理鹽水反復沖洗5次以上；分離鼠尾腱，去除鼠尾腱殘留的組織纖維等。NH4C1_生理鹽水溶液浸泡24h，4°C保持低速攪拌24h，中間換兩次液去除殘留的脂肪和多糖。去離子水沖洗5次，_40°C預凍2h，真空冷凍干燥備用；
[0056](2)、凍干鼠尾經低溫凍干粉碎至400目；
[0057](3)在冰水浴中將粉碎的鼠尾腱在醋酸溶液中溶脹，鼠尾腱與醋酸的固液比為I克:120mL，醋酸溶液濃度為0.lmol/L，溶脹I小時，期間不斷攪拌，防止凍結成塊，得到膠原溶脹液；
[0058](4)稱取胃蛋白酶加入到膠原溶脹液中，鼠尾腱與蛋白酶質量比為100: 1，胃蛋白酶的酶活力1: 10000，在4°C，74小時酶解，期間間歇性攪拌；
[0059](5)、將黏稠的膠體溶液用高速冷凍離心機4°C、15000r/min、離心15分鐘，收集上清液。在冰水浴中，用的6mol/L的NaCl溶液鹽析，4°C沉淀10小時，去除上清液，絮狀溶液用高速冷凍離心機4°C、15000r/min、離心15分鐘，收集沉淀；
[0060](6)、用0.03mol/L的檸檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4標定pH = 6.5，用3mol/L的NaCl溶液鹽析，4°C沉淀10小時，去除上清液，絮狀溶液用高速冷凍離心機4°C、8000r/min、離心30分鐘，收集沉淀；
[0061](7)、用0.03mol/L的檸檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4標定pH = 6.5 ;溶液用透析袋動態透析72小時，用硝酸銀檢測無沉淀析出，透析完成。
[0062](8)、將脫鹽后的膠原蛋白溶液，-20°C預凍4小時，進而在真空冷凍干燥機中冷凍干燥，凍干產品經進一步處理可得到膠原蛋白微粉(含水率在3%以下)，鈷60輻照滅菌、包裝，得到成品膠原蛋白粉末，純度達到98%以上。
[0063]實施例4
[0064]對獲得的鼠尾膠原蛋白進行蛋白特性的分析
[0065]選擇實施例1獲得的膠原蛋白進行蛋白特性的分析。
[0066](I)、傅里葉紅外光譜分析
[0067]對實施例1獲得的膠原蛋白進行傅里葉紅外光譜分析，結果如圖1所示。從圖中可以看出，膠原蛋白在3409cm—1有一個強而寬的吸收峰，該峰對應于膠原蛋白中N-H和O-H的振動。膠原蛋白在1700?1200CHT1之間，分別出現了三個吸收峰，它們是蛋白質的酰胺I (1655cm-1)，酰胺II (ΙδδΟαιΓ1)，酰胺III (1234cm^)的吸收帶，這是蛋白質在紅外光譜中的特征吸收峰。在1450?1200cm—1范圍內的吸收峰與膠原蛋白的三股螺旋結構密切相關，其中1240CHT1與1450cm ―1附近的峰值比可反映膠原蛋白的結構特征。有文獻指出，具備完整三螺旋結構的膠原蛋白的比值約為1.013，本研宄中所用膠原蛋白在室溫時的比值為1.015，說明膠原蛋白的三股螺旋結構保持完整。
[0068](2)、紫外光光譜分析
[0069]蛋白質分子通常具有3個明顯不同的紫外吸收區域:①在250?280nm處有一峰，來源于芳香族殘基；②在210?250nm有吸收，是由于多種因素，如芳香族和其他殘基的吸收，某些氫鍵的吸收或與其他構象和螺旋有關的相互作用；?210nm以下有吸收是由于肽鍵及許多構象因素引起的。對實施例1獲得的膠原蛋白進行紫外光光譜分析，結果如圖2所示。膠原蛋白在280nm處沒有吸收峰，表明膠原蛋白幾乎不含Trp和Tyr等具有共軛雙鍵的氨基酸，這符合膠原氨基酸組成的基本特征。膠原蛋白的最大紫外吸收波長在232nm附近，形成一個較陡峭的峰，與文獻報道的I型膠原特征相符。
[0070](3)、圓二色譜分析
[0071]膠原蛋白是一類光學活性蛋白，具有類似聚脯氨酸-1I型的螺旋構象，從而圓二色譜特征是在190?200nm左右有一個負吸收峰，在210?230nm范圍內有一個弱的正吸收峰。對實施例1獲得的膠原蛋白進行圓二色譜分析，結果如圖3所示。圖中負吸收峰的位置為196nm，正吸收峰為220nm，說明其屬于典型的三股螺旋構象特征。圖中將膠原蛋白與明膠進行了表征區別。
[0072](4)、SDS-PAGE凝膠電泳分析
[0073]采用5 %的濃縮膠濃度和10 %的分離膠濃度的SDS-PAGE凝膠電泳鑒定實施例1獲得的膠原蛋白，結果如圖4所示。由圖可知，將膠原蛋白與標樣蛋白Maker比較，可以看出制備的生物醫用鼠尾膠原純度高，質量好。一條譜帶位于200KDa處，兩條分布在10KDa附近，可估算提取的生物醫用鼠尾膠原蛋白分子量為300KDa，符合文獻報道。
[0074]依照本發明專利的提取工藝，結合多種酸溶法、酶解法，成品的提取率大幅度提高。低溫真空冷凍干燥有效的降低了產品的抗原性，使得產品能更好的應用于醫用產品行業。
【主權項】
1.一種生物醫用鼠尾膠原蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將無組織纖維、脂肪和多糖殘留的鼠尾腱，真空冷凍干燥備用； (2)凍干鼠尾腱經低溫凍干粉碎至200?400目； (3)在冰水浴中將粉碎的鼠尾腱在醋酸溶液中溶脹，鼠尾腱與醋酸的固液比為I克:10mL?I克:120mL，期間不斷攪拌，防止凍結成塊，得到膠原溶脹液； (4)稱取胃蛋白酶加入到膠原溶脹液中，鼠尾腱與蛋白酶質量比為50: I?100: 1，在4°C，48?74小時酶解，期間間歇性攪拌； (5)將黏稠的膠體溶液進行高速冷凍離心處理，收集上清液；在冰水浴中，用的3?6mol/L的NaCl溶液緩慢加入上清液中，不斷攪拌至溶液中白色的絮狀物不再析出，4°C沉淀10小時，去除上清液，絮狀溶液高速冷凍離心處理，收集沉淀； (6)用0.03?0.06mol/L的檸檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；在冰水浴中，調節pH = 6.5，用的3?6mol/L的NaCl溶液緩慢加入上清液中，不斷攪拌至溶液中白色的絮狀物不再析出，4°C沉淀10小時，去除上清液，去除上清液，絮狀溶液高速冷凍離心處理，收集沉淀； (7)用0.03?0.06mol/L的檸檬酸再次溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，調節PH = 6.5 ;溶液依次通過陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂進行脫鹽處理； (8)將脫鹽后的膠原蛋白溶液，-40至-20°C預凍2?4小時，然后真空冷凍干燥，凍干產品經進一步處理得到含水率在3%以下的膠原蛋白微粉，滅菌、包裝，得到成品膠原蛋白粉末。
2.根據權利要求1所述的一種生物醫用鼠尾膠原蛋白的提取方法，其特征在于，步驟(3)中醋酸溶液濃度為0.04?0.lmol/L，溶脹1-2小時。
3.根據權利要求1所述的一種生物醫用鼠尾膠原蛋白的提取方法，其特征在于，步驟(4)中胃蛋白酶的酶活力1: 10000。
4.根據權利要求1所述的一種生物醫用鼠尾膠原蛋白的提取方法，其特征在于，步驟(4) (5)和(6)中高速冷凍離心處理，溫度為4°C，轉速為8000?15000r/min，離心時間為15?30分鐘。
5.根據權利要求1所述的一種生物醫用鼠尾膠原蛋白的提取方法，其特征在于，步驟(7)中依次通過732強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，D311大孔丙烯酸系弱堿陰離子交換樹脂進行脫鹽處理。
6.根據權利要求1所述的一種生物醫用鼠尾膠原蛋白的提取方法，其特征在于，步驟(7)進行脫鹽處理或用透析袋動態透析72小時，用硝酸銀檢測無沉淀析出，透析完成。
【專利摘要】本發明公開了一種生物醫用鼠尾膠原蛋白的提取方法，采用酸法與酶法相結合的工藝，保持恒低溫無菌的環境，利用同樣濃度的鹽溶液進行兩次鹽析與離心，簡化了提純步驟。所用酸為低濃度酸溶液，并采用檸檬酸替代醋酸進行提純。從提取原料到樣品生成過程中，進行多次真空冷凍干燥，并經進一步處理獲得含水率在3％以下的膠原蛋白微粉；最后由滅菌、無菌包裝，成品膠原蛋白粉末的純度在98％以上。本發明獲得的膠原蛋白降低了蛋白的免疫原性，提高了產率和生物相容性，降低了成本，適用于生物醫用材料，所得到的膠原蛋白能完整地保留其特有的三股螺旋結構。
【IPC分類】C07K1-14, C07K14-78, C07K1-18
【公開號】CN104788559
【申請號】CN201510204837
【發明人】張志平, 楊寧
【申請人】黑龍江力海鑫生物科技股份有限公司
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月28日