利用sd-as序列偶聯(r)-羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶制備(r)-苯乙二醇的方法
【技術領域】
[0001]利用SD-AS序列連接U)-羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶，不對稱轉化制備U)-苯乙二醇的方法，本發明涉及基因工程技術使兩種酶共表達，構建重組大腸桿菌，用于高效制備U)-苯乙二醇的方法及其應用，屬于生物催化不對稱轉化技術領域。
【背景技術】
[0002]手性化合物在醫藥和農藥等精細化工品的制備中應用廣泛，如光學純苯乙二醇是制備具有光學活性的醫藥、農藥和功能材料的重要中間體，也是液晶材料中不可缺少的重要手性添加劑。
[0003]氧化還原酶能催化不對稱還原反應，制備手性化合物。這類反應需要輔酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，NADH)或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+，NADPH)參與。但由于輔酶價格昂貴，且化學性質不太穩定，不能用一般的合成物質替代。在手性化合物制備過程中，輔酶不能再生是限制氧化還原酶催化反應的主要“瓶頸”因素。
[0004]葡萄糖脫氫酶(⑶H)是一種“輔酶再生”功能酶，常用于NAD(H)和NADP(H)的循環再生，它使葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，同時使氧化態輔酶NAD (P) +還原為NAD (P) H。倪燕等將來源于的羰基還原酶基因與葡萄糖脫氫酶基因置于同一個啟動子下進行共表達，用于制備U)-氯-羥基丁酸乙酯，產物的光學純度和得率分別為99.6%和91.7% ;Ema 等將來自于 SaccAaro焊Ce1S cereFisiae的幾基還原酶和 Bacillus megaterium的葡萄糖脫氫酶置于同一質粒中的兩個啟動子下表達，合成S-2-羥基-4-辛酮的光學純度為 100%。
[0005]本實驗室已經利用U)-羰基還原酶的重組菌株催化不對稱轉化制備U)-苯乙二醇，但是產物的光學純度和得率為81%和61%。在此基礎上，利用SD-AS序列作為連接子，偶聯近平滑假絲酵母{Candida parapsilosis) CCTCC NO:M203011 (對-羰基還原酶和芽孢桿菌心sp.YX-1)葡萄糖脫氫酶，構建重組疋co7i RIL菌。該重組菌進行生物轉化U)-苯乙二醇時，不僅很好地提高了產物的轉化效率，反應時間由48 h縮短為24 h，且轉化過程不需要添加輔酶。采用SD-AS連接子，偶聯U)-羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶，加強輔酶代謝循環解決輔酶限制性的問題，實現了重組菌高效制備U)-苯乙二醇。
【發明內容】
[0006]( I)要解決的技術問題
本發明目的在于利用SD-AS序列為連接子，偶聯⑶-羰基還原酶基因(RCR)與Bacillus sp.YX_1的葡萄糖脫氫酶基因(⑶H)，實現兩個酶的并表達，利用雙酶偶聯重組大腸桿菌(疋coli RIL/pET-R-SD-AS-G)催化2-羥基苯乙酮，高效制備(對-苯乙二醇，解決手性催化反應中輔酶限制性的問題，顯著提升了酶的催化功能和催化效率。
[0007](2)技術方案一株不對稱轉化制備U)-苯乙二醇的雙酶共表達重組菌，其分類命名為大腸桿菌Escherichia coli RIL/pET-R-SD-AS-G，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號:CCTCC NO:M 2015170。
[0008]一、質粒 pET-RCR 及 pET-GDH 的獲得
重組疋coli JM109/pET-RCR和重組疋coli JM109/pET_GDH的培養基組成以g/L計:蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0，以去離子水配制；
將兩種重組菌分別接種于培養基裝液量為5 mL試管中于37°C、200 rpm振蕩培養8 h。培養結束后，將菌體于12，000 rpm離心Imin收集細胞，利用質粒提取試劑盒Min1-PlasmidRapid Isolat1n Kit (北京博大泰克生物基因技術有限公司)提取質粒pET-RCR及pET-GDHο
[0009]二、RCR和⑶H共表達重組大腸桿菌的構建合成兩端引物:
R-SD-AS-G-f:5’ -ATCCTGCTAG CATGTCAATT CCATCAAGCC AGTAC-3’ (Nhe I)，
RCR-r:5’ -CGGATACATG GTATATCTCC TTCCTATGGA TTAAAAACAACTCTACCTT-3’，(劃線部分為反向互SD-AS序列)；
GDH-f:5^ -AATCCATAGG AAGGAGATAT ACCATGTATC CGGATTTAAA AGGAAAAGTC-3’，(劃線部分為SD-AS序列)；
R-SD-AS-G-r:5’ -TGACTCTCGA GACCGCGGCC TGCCTG-3’ {Xho I)。
[0010]采用SOE-PCR的方法，將SD-AS序列引入，具體方法如下:
上游及下游cDNA片段的獲得:
PCR 反應體系:ddH20 22 μ L，Premix PrimeSTAR 25 μ L，上游引物 R-SD-AS-G-f (20μ Μ) I μ L，下游引物 RCR-r (20 μ Μ) I μ L，質粒 pET-RCR I μ L0
[0011]另一PCR 反應體系:CldH2O 22 μ L，Premix Prime STAR 25 yL，上游引物⑶ H_f(20 μΜ) I μ L，下游引物 R-SD-AS-G-r (20 μ Μ) I yL，質粒 pET-GDH I yL。
[0012]PCR 反應:98°C 預變性 30 s ；98°C 10 s，60°C 15 s，72°C 70 s，進行 30 個循環；72°C延伸10 mine以pET-RCR及pET-GDH為模板，分別以引物R-SD-AS-G-f和RCR-r，引物⑶H-f和R-SD-AS-G-r進行PCR反應，分別獲得上游及下游cDNA片段。利用3S SpinAgarose Gel DNA Purificat1n Kit (上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA片斷。
[0013]R-AS-SD-G全長基因的獲得:
模板的獲得:PCR反應體系中不添加引物，以上、下游cDNA片段為模板，按以下PCR擴增條件:98°C 預變性 30 s ；98°C 10 s，60°C 15 s，72°C 2 min，進行 10 個循環；72°C延伸10 min ;將上、下游cDNA片段經退火重疊連接，兩端單鏈于72°C用Premix PrimeSTAR延伸10 min補成雙鏈，用作下一輪PCR的模板。
[0014]PCR反應:添加引物R-SD-AS-G-f和R-SD-AS-G-r各I yL，按以下PCR擴增條件:980C 預變性 30 s ；98°C 10 s，60°C 15 s，72°C 2 min，進行 20 個循環；72°C延伸 10 min。進行反應，即獲得R-SD-AS-G基因，全長為1808 bp JnSEQ ID N0.1所示。利用3S SpinAgarose Gel DNA Purificat1n Kit (上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA片斷。
[0015]純化后的共表達基因PCR產物與pMD19-T載體通過TA互補連接，連接產物轉化大腸桿菌E.coli JM109感受態細胞，重組質粒T-R-SD-AS-G經雙酶切、PCR及上海生工測序進行驗證。
[0016]重組菌株疋co7i RIL/pET-R-SD-AS-G 的構建:
采用SOE-PCR的方法，引入SD-AS序列，將目的基因(對-羰基還原酶RCR和葡萄糖脫氫酶⑶H通過SD-AS序列連接起來，插入表達載體pET-28a中，構建重組質粒pET-R-SD-AS_G，重組質粒轉化大腸桿菌疋co7i RIL感受態細胞，通過含有50 yg/mL硫酸卡那霉素的LB平板篩選目的重組菌株E.coli RIL/pET-R-SD-AS-G。
[0017]基因R-SD-AS-G 及 pET28a 的酶切:
利用質粒提取試劑盒Min1-Plasmid Rapid Isolat1n Kit (北京博大泰克生物基因技術有限公司)提取質粒T-R-SD-AS-G及pET28a。
[0018]按照水、緩沖液、質粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機內離心2 s使液體集中于管底，37°C、1 h，在管中加入1/10體積的Loading Buffer或將管置于65°C保溫10 min，終止酶切反應。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收并濃縮。
[0019]反應體系組成:10X Buffer H 4 yL，DNA 10 \xL, Nhel 2 \xL,Xhol 2 μ L，ddH20將體系補足40 μ Lo
[0020]基因R-SD-AS-G與質粒pET28a的連接:
反應體系組成如下:質粒pET28a 0.8 μ L，基因R-SD-AS-G4.2 μ L，Ligat1nSolut1n 5 μ L，將混合連接液置于16°C培養箱中連接12-16 h。
[0021]重組質粒轉化大腸桿菌厶coli JM109:
在每管的100