作為核酸切割試劑的小肽偶聯肽核酸單體組合物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及小肽偶聯肽核酸單體組合物作為核酸切割試劑及其應用,屬于生物化 學、分子生物學和分子核醫學技術領域。
【背景技術】
[0002] 放射療法從開始至今,經歷了一個從宏觀到微觀,從組織水平到細胞水平,再到分 子基因水平的發展過程。以基因作為靶位是放射療法最前沿的研宄領域,與其它癌癥治療 方法相比,它的最大優點就是目的性強,對正常基因成分的副作用能降至最小。目前,許多 藥物主要以蛋白質作為靶位進行研宄,而將基因作靶位則成為新藥研制的又一個重要領 域,這其中將小片斷DNA作為藥物已被證明是很有前途的研宄方向。要達到此目的,攜帶放 射性核素的藥物應該在分子水平上具有癌基因靶位特異性,以便能夠特異性地結合到癌基 因序列靶位點上,形成穩定的復合物,從而達到治療或診斷癌癥的目的。反義/抗基因放射 性治療是一項新興的腫瘤治療技術,它將反義核酸阻抑癌基因與放射性核素靶向損傷癌基 因有機結合。
[0003] PNA (Peptide Nucleic Acid,肽核酸)作為一種生物多聚物,是一種傳送福 射核到癌細胞靶位對其進行分子切割和損傷,或進行分子圖像檢測的有效工具,在癌 癥診斷和放射基因治療的臨床應用上具有光明前景(Nielsen P E,Egholm M,Berg R H,et al. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science, 1991, 254:1497-1450. He Y J,Igor G Pj Alex K,et al. Sequence-specific DNA strand cleavage by 111In-Iabeled peptide nucleic acids. Eur J Nucl Med Mol Imaging,2004, 31 (6) :837-845.) D PNA 能夠用重復的甘氨 酸骨架取代DNA的核糖和磷酸,與天然DNA(或RNA) -樣,PNA也可合成出各種不同堿基 序列的寡聚肽核酸。與對核酸酶和蛋白酶敏感的天然核酸和天然肽相比,PNA具有很高 的化學和生物學穩定性,它不易被核酸酶和蛋白酶酶解,同時易于傳輸到細胞核中,并且 能與基因靶位通過專一陛的堿基配對以雙鏈或三鏈DNA的形式穩定地結合在一起。因 此,放射核素標記的PNA可在分子水平上指導基因靶位的放射性療法,同時在診斷方面 具有重要應用(Panyutin I G,Winters T A,Feinendegen L Ej et al. Development of DNA-based radiopharmaceuticals carrying Auger-electron emitters for anti-gene radiotherapy. Q J Nucl Med. 2000, 44:256-267. Panyutin I VjLuu A NjPanyutin I G,et al. Strand breaks in whole plasmid DNA produced by the decay of1251 in a triplex-forming oligonucleotide. Radiat Res.2001,156:158-166.)〇
[0004] PNA標記的一個主要問題是難以形成穩定的配位健,通過酰化反應后可在PNA 上偶聯雙功能螯合劑 DTPA(Lewis M R,Jia F,Gallazzi F,et al. Radiometal-Iabeled peptide-PNA conjugates for targeting bcl-2expression:preparation, characterizat ion,and in vitro mRNA binding. Bioconjugate Chem. 2002, 13:1176-1180·),這使標記變 得容易,標記物更穩定。迄今,國際上關于放射性核素標記PNA分子的文獻非常稀少,相關 領域的研宄人員也剛剛開始關注這一方向。
[0005] 中國科學家把PNA應用于放射性核素反義治療當中,進行了一系列的實驗研 宄工作(鄭駿年,孫曉青,陳家存,等. 125I標記Ki67反義多肽核酸對裸鼠人腎癌移 植瘤的抑制作用.中國腫瘤生物治療雜志,2005, 12(1) :18.鄭駿年,孫曉青,陳家 存,等.125I標記Ki67多肽核酸影響腎癌細胞增殖及凋亡的實驗研宄.中華核醫學雜 志,2004, 24 (3) : 139-141.)。研宄表明,在125I-PNAs與癌基因 DNA結合后,125I發出的Auger 電子可以直接破壞癌基因,125I平均衰變一次可產生一個DNA斷裂,達到基因放射治療腫瘤 的作用。研宄發現 125I-PNA能增強PNAs阻抑腎癌細胞Ki67基因表達,抑制增殖,促進凋亡 作用,有望用于腎癌治療。
[0006] 國外科學家嘗試用[99mTc (CO)3(H2O)3]+標記PNA單體,研宄表明形成高產率且穩 定性好的組合物(Xavier C, Pak J K, Santos I,et al. Evaluation of chelators for labeling a PNA monomer with the fac-[99mTc (CO)3]+moiety. Journal of organometallic chemistry, 2007, 692:1332-1339.),有可能成為與之PNA序列互補的靶向mRNA的反義放射 性顯像探針。
[0007] 設計合成連接有小肽的a -PNA綴合物單體,采用99mTc標記制成配合物,研宄標記 配合物對DNA的切割作用,可為研宄DNA特定位點的斷裂和損傷修復、基因靶向診斷等研宄 提供有效的途徑,具有重要的研宄意義。目前,還未見有小肽偶聯肽核酸單體組合物作為核 酸切割試劑的應用專利文獻和非專利文獻報道。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是針對現有技術的不足而提供作為核酸切割試劑的小肽偶聯肽核 酸單體組合物及其應用,其特點是以小肽偶聯肽核酸單體組合物為小肽偶聯肽核酸單體 與金屬離子配位而成,小肽偶聯肽核酸單體為結構式I的2-(Ν_組氨酰基賴氨酰基胺乙 基-2-(胸腺嘧啶-1)-乙酰氨基)乙酸(縮寫為HLT)和結構式II的(2-(Ν-胺乙基-2-(胸 腺嘧啶-1)-乙酰氨基)乙酰氨基)賴氨酰基組氨酸(縮寫為THL),英文系統命名為2-(^ ((6_amin〇-2- (2_amin〇-3- (lH-imidazol-2-yl) propanamido) hexanamido) -ethyl) _2_ (5-methyl-2, 4-diox〇-3, 4-dihydropyrimidin-l(2H)-yl)acetamido)acetic acid和 3-(lH-i midazol-2-yl)-2-(6_amin〇-2-(2-(N-2-aminoethyl_2-(5-methyl_2, 4_diox〇-3, 4-dihyd ropyri midin-1 (2H) -yl) acetamido) acetamido) hexanamido) propanonic acid,化學式為 C23H35N9O7,結構如下:
[0009]
[0010] 所述金屬離子為99niTcO4'
[0011] 根據本發明的第一個實施方案,提供一種作為核酸切割試劑的小肽偶聯肽核酸單 體組合物,該組合物包括作為配位體的小肽偶聯肽核酸單體和金屬離子 99mTcCV或由作為配 位體的小肽偶聯肽核酸單體和金屬離子99mTcCV組成,其中
[0012] 小肽偶聯肽核酸單體選自于2-(N-組氨酰基賴氨酰基胺乙基-2-(胸腺嘧 啶-1)-乙酰氨基)乙酸[縮寫為HLT]或2-(N-胺乙基-2-(胸腺嘧啶-1)-乙酰氨基)乙 酰氨基)賴氨酰基組氨酸[縮寫為THL]中的一種或兩種。
[0013] 一般來說,小肽偶聯肽核酸單體與金屬離子99mTcCV的摩爾比是0. 1~50:1,優選 是0· 3~40:1,更優選0· 4~30:1,更優選是0· 5~20:1,更優選0· 6~10:1,更優選0· 7~ 5:1,更優選0.8~3:1,更優選0.9~2:1,更優選1~1. 5:1。
[0014] 根據本發明的第二個實施方案,提供一種制備以上所述的組合物的方法,該方法 包括將含有金屬離子 99mTcCV的溶液與作為配位體的小肽偶聯肽核酸單體混合。
[0015] 一般,含有金屬離子99mTcCV的溶液的放射性濃度或放射性活度是0. 5X 10 9~ 5 X 109Bq/mL,優選 I. 0 X IO9~3 X 10 9Bq/mL。
[0016] 一般,小肽偶聯肽核酸單體是以3. 0~150 μΜ、優選14. 3~57. 2 μΜ濃度的溶液 形式使用。
[0017] 根據本發明的第三個實施方案,提供本申請所述的組合物作為核酸切割試劑的用 途。
[0018] 本發明還可以采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測核酸切割效果。因此,根據本發明的第 四個實施方案,提供一種采用本申請中所述的組合物切割核酸的方法,該方法包括以下步 驟:
[0019] ⑴將瓊脂糖加入錐形瓶中,再加入IXTBE電泳緩沖液,對于切割質粒PUC 019DNA(基因組序列號L09137)選用的瓊脂糖濃度為I. 5wt% ),將裝有瓊脂糖和IXTBE電 泳緩沖液的錐形瓶放在微波爐中加熱(例如20~50s,如30s使瓊脂糖顆粒完全溶解,呈透 明均一溶液,冷卻(例如冷卻至40~55°C,如50°C ),倒入裝配好帶梳子的制膠槽中,溶液 的厚度為2~7cm(例如4cm),并去除膠層中的氣泡,室溫下放置(例如30min),然后將制 膠槽放入電泳槽中;
[0020] (2)將加入IXTBE電泳緩沖液到上述電泳槽中,加入量以淹沒膠面上部Imm即可, 然后小心取出梳子,令樣品孔自然充滿電泳緩沖液;
[0021] (3)在離心管中加入用PBS緩沖液配置的電泳樣品,然后放入恒溫箱內,在35~ 39°C下孵育20~50min,根據樣品量加入染色劑和顯色劑1~2 μ L ;
[0022] (4)將樣品用微量移液器加入到凝膠樣品孔上,并蓋