免疫抑制劑雷帕霉素在提高出芽短梗霉普魯蘭多糖產量中的應用及方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于發酵領域，具體涉及免疫抑制劑雷帕霉素在提高出芽短梗霉普魯蘭多糖產量中的應用，還涉及利用免疫抑制劑雷帕霉素提高出芽短梗霉普魯蘭多糖產量的方法。
【背景技術】
[0002]出芽短梗霉(Aureobasidum pulIulan)是一類酵母真菌，具有菌絲體和酵母樣兩種形態。該菌種在自然界中存在較為廣泛。通常出芽短梗霉發酵過程會同時產生聚蘋果酸和普魯蘭多糖兩個大分子代謝產物。聚蘋果酸和普魯蘭多糖的合成共同的前體有葡萄糖-1-磷酸，如碳代謝流進入TCA循環或者乙酸循環積累蘋果酸，將最終聚合生成聚蘋果酸；而碳代謝流經葡萄糖-1-磷酸轉化UDPG-葡萄糖，將最終合成普魯蘭多糖。
[0003]現有的專利報道希望能同時生產兩種高分子聚合物，如喬長晟等一種出芽短梗霉聯產聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法(專利授權號ZL201110430053.3)，但是由于兩種聚合物的具有不同的物理性質和產品附加值，同時生產兩種高分子聚合物，會對下游提取純化造成困難。因此，從生產實踐上，更希望獲得單一目標的聚合物產品。現有技術報道了0.1%,0.5%和I %的吐溫-80能夠提高出芽短梗霉產普魯蘭多糖的能力；但是未見其他物質提高普魯蘭多糖的報道。
【發明內容】
[0004]有鑒于此，本發明的目的在于針對現有聚蘋果酸和普魯蘭多糖發酵生產工藝技術的不足，經過大量研宄發現出芽短梗霉生長受氮源調節，且在氮限制條件下有利于聚蘋果酸和普魯蘭多糖合成。通常微生物適應外界營養環境完成的復雜轉錄、翻譯和后翻譯修飾等過程，主要依賴于營養感應和信號傳導，其中雷帕霉素革El蛋白(Target of rapamycin,TOR)信號途徑被認為是感應氮信號的重要途徑，TOR信號通路在真核生物感受外界營養物質和逆境脅迫、調控細胞生長中起重要作用，通過響應外界氮及氨基酸、滲透壓、熱、氧化應激、以及碳饑餓等信號，調節翻譯、轉錄、核糖體生物合成、營養物質的運轉以及自噬作用調控細胞生長。雷帕霉素是雷帕霉素靶蛋白(TOR)的特異性抑制劑，本發明采用雷帕霉素靶蛋白(TOR)特異性抑制劑雷帕霉素，通過抑制TOR途徑靶蛋白的活性，調節代謝流向普魯蘭多糖合成方向進行，實現對出芽短梗霉合成的聚蘋果酸和普魯蘭多糖合成的代謝流轉換，實現高效合成普魯蘭多糖。本發明使用的產聚蘋果酸菌種為Aureobasidiumpullulans CCTCC M 2012223，或者來源于美國農業部菌種保藏中心(NRRL)，美國典型培養物保藏中心(ATCC)，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)等機構保藏或自然分離的Aureobasidium 屬菌種。
[0005]優選的，所述雷帕霉素的濃度為5?80mg/L ;更優選的，所述雷帕霉素的濃度為10 ?70mg/Lo
[0006]本發明還公開了利用免疫抑制劑雷帕霉素提高出芽短梗霉普魯蘭多糖產量的方法，將出芽短梗霉活化后在含5?80mg/L雷帕霉素的條件下發酵。
[0007]優選的，所述發酵是在溫度為23-30°C、轉速為180-300rpm條件下培養96-150小時；
[0008]或在溫度為23-30 °C、轉速為300-1000rpm、通氣比1:0.8-1:1.6條件下培養72-200 小時。
[0009]更優選的，所述發酵是在溫度為25°C、轉速為220rpm條件下培養96小時；
[0010]或在溫度為25°C、轉速為600rpm、通氣比1: 1.2條件下培養96小時。
[0011]優選的，所述發酵使用的培養基各組分如下:糖50-200g/L，硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀或硝酸鈉 l_5g/L，KH2PO40.005-0.3g/L，ZnSO40.005-0.3g/L，MgSO40.005-0.3g/L，玉米漿0.05-3g/L 和 CaC0310-50g/L，溶劑為水。
[0012]更優選的，所述出芽短梗霉活化的方法是將出芽短梗霉接種于種子培養基中，然后在溫度為23-30°C、轉速180-300rpm條件下培養36-96小時；所述種子培養基各組分如下:葡萄糖 40-100g/L、硝酸銨 l_5g/L、KH2PO40.005-0.3g/L、ZnSO40.005-0.3g/L、MgSO40.005-0.3g/L、玉米漿 0.05_3g/L 和 CaC0310_50g/L，溶劑為水。
[0013]更優選的，所述出芽短梗霉活化的方法是將出芽短梗霉接種于種子培養基中，然后在溫度為25°C、轉速為220rpm條件下培養96小時；所述種子培養基為葡萄糖90g/L、硝酸鉀 3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.15g/L、MgSO40.2g/L、玉米漿 2g/L 和 CaC0320g/L，溶劑為水。
[0014]本發明的有益效果在于:本發明根據出芽短梗霉合成聚蘋果酸和普魯蘭多糖的合成特點，采用雷帕霉素靶蛋白特異性抑制劑雷帕霉素，建立操作簡單的定向調控策略，可以實現對聚蘋果酸和普魯蘭多糖合成的碳代謝流流向調節，抑制聚蘋果酸的合成，轉向大幅度合成普魯蘭多糖。同時添加此范圍濃度的雷帕霉素對出芽短梗霉細胞生長不會造成抑制。本發明具有發酵成本低、產量高、技術經濟性強等優點，可應用于普魯蘭多糖的工業實際放大生產。
【具體實施方式】
[0015]下面將結合具體實施例，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0016]本發明使用的種子培養基為:葡萄糖40_100g/L、硝酸銨l_5g/L、KH2PO40.005-0.3g/L、ZnSO40.005-0.3g/L ；MgS040.005-0.3g/L、玉米漿 0.05-0.3g/L 和CaC0310-50g/L ;種子培養條件是采用500mL搖瓶裝液量30_120mL，在溫度為23_30°C，搖床轉速為180-300rpm條件下培養時間為36-96小時。
[0017]本發明使用的發酵培養基為葡萄糖、木糖或其他可利用糖50_200g/L、氮源為硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀或硝酸鈉 l_5g/L、KH2PO40.005-0.3g/L、ZnSO40.005-0.3g/L ；MgSO40.005-0.3g/L、玉米漿 0.05-3g/L、CaC0310_50g/L。發酵培養條件是采用 500mL 搖瓶裝液量30-120mL，培養溫度為23_30°C，搖床轉速為180_300rpm，培養時間為96-150小時；5L發酵罐發酵工藝為裝液量3L，培養溫度23-30°C，轉速300-1000rpm，通氣比1: 0.8-1:1.6,培養時間為60-200小時。
[0018]實施例1
[0019]取保藏號為CCTCC NO:M 2012223 的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接種于含50mL種子培養基的搖瓶中(搖瓶體積為500mL)，在溫度為25°C，轉速為220rpm條件下培養48小時；然后取培養液按接種量為10%接種于500mL搖瓶中，搖瓶含有50mL含10mg/L的雷帕霉素的發酵培養基，然后在溫度為25°C、轉速為220rpm條件下培養120小時；然后檢測培養液中聚蘋果酸和普魯蘭多糖的含量。結果顯示，本實施例聚蘋果酸的產量為48.0lg/L，普魯蘭多糖產量為38.6g/L，出芽短梗霉細胞量為19.5g/L。
[0020]同時按照與上述相同的方法進行對比試驗，區別在于發酵培養基中未加入雷帕霉素，發酵結束檢測培養液中聚蘋果酸和普魯蘭多糖的含量。結果顯示，實驗組與對比實施實驗相比，聚蘋果酸產量比對照組降低了 28.7%;普魯蘭多糖產量比對照組提高了 69%，出芽短梗霉細胞量比對照組提高了 21.87%。
[0021]本實施例中種子培養基為:葡萄糖60g/L、硝酸銨3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.lg/L、MgSO40.15g/L、玉米漿 2g/L 和 CaC0320g/L，溶劑為水。
[0022]發酵培養基為:葡萄糖90g/L、硫酸銨 3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.15g/L、MgSO40.2g/L、3 玉米漿 lg/L 和 CaC030g/L，溶劑為水。
[0023]實施例2
[0024]取保藏號為CCTCC NO:M 2012223 的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接種于含50mL種子培養基的搖瓶中(搖瓶體積為500mL)，在溫度為23°C，轉速為300rpm條件下培養96小時；然后取培養液按接種量為10%接種于500mL搖瓶中，搖瓶含有50mL含20mg/L的雷帕霉素的發酵培養基，然后在溫度為23°C、轉速為300rpm條件下培養150小時；然后檢測培養液中聚蘋果酸和普魯蘭多糖的含量。結果顯示，本實施例聚蘋果酸的產量為47.9g/L，普魯蘭多糖產量為39.8g/L，出芽短梗霉細胞量為21g/L。
[0025]同時按照與上述相同的方法進行對比試驗，區別在于發酵培養基中未加入雷帕霉素，發酵結束檢測培養液中聚蘋果酸和普魯蘭多糖的含量。結果顯示，實驗組與對比實施實驗相比，聚蘋果酸產量比對照組降低了 28.9%;普魯蘭多糖產量比對照組提高了 74.2%，出芽短梗霉細胞量比對照組提高了 31.3%。
[0026]本實施例中種子培養基為:葡萄糖40g/L、硝酸銨lg/L、KH2PO40.3g/L、ZnSO40.3g/L、MgSO40.3g/L、玉米漿 3g/L 和 CaC0350g/L，溶劑為水。
[0027]發酵培養基為:葡萄糖50g/L、硫酸銨 lg/L, KH2PO40.3g/L、ZnSO40.3g/L、MgSO40.3g/L、玉米漿 3g/L 和 CaC