魚腥草多糖及其衍生物及其制備方法和藥物用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬中藥領域，涉及魚腥草多糖，具體涉及魚腥草中天然均一多糖及其衍生 物，及其制備方法和在制備抗補體藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 補體系統的正常激活在消滅外來微生物、清除肌體內損傷或死亡的細胞和組織、 維持機體的平衡中起著重要的作用。然而該系統的非正常激活會引起人體免疫系統的過度 反應，造成人體自身正常組織的損傷，參與多種疾病的病理過程。研究顯示，與補體過度激 活相關的慢性疾病有類風濕性關節炎、老年性癡呆、系統性紅斑狼瘡（SLE)以及器官移植 后的排斥反應等；而在多器官功能衰竭綜合癥，如缺血性再灌注、急性心肌梗死、急性呼吸 窘迫綜合征（ARDS)等急性疾病中，補體的過度激活也起了重要作用。
[0003] 目前臨床上廣泛使用的糖皮質激素、環磷酰胺、甲胺蝶吟等免疫抑制劑雖然對某 些與補體過度激活相關的疾病有一定治療作用，但由于該類藥物并非專一的補體抑制劑， 選擇性差，長期應用會降低機體的防御機能，導致抗感染能力下降，易繼發感染和使潛在病 灶擴散，產生多種并發癥和副作用。因此臨床上急需高效、低毒、專一的新型補體抑制劑。
[0004] 天然藥物中廣泛存在具有抗補體作用的活性成分，國內外已完成部分天然藥物如 麻黃、巴戟天、人參、杜仲等的篩選，發現自然界中廣泛存在的某些多糖、蛋白質、多肽、黃 酮、留類、砲類和生物堿等化合物具有顯著的抗補體活性，已從人參、姜黃、芍藥、柴胡、川考 和甘草等植物中分出一系列有抗補體活性的酸性多糖和中性多糖。
[0005] 魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的帶根全草，是一種常 用的清熱解毒中藥，用于肺炎、上呼吸道感染、流感、肝炎等病的治療。藥理研究表明，魚腥 草具有抗菌、抗病毒、鎮痛、抗腫瘤、免疫調節、抗氧化、抗過敏、利尿、心肌保護等藥理作用。 研究發現，魚腥草粗多糖抗補體活性顯著，且具有防治急性肺損傷和解熱藥效，但迄今，尚 未見對魚腥草中抗補體活性均一多糖的分離制備和活性的報道。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供天然藥物中具有抗補體作用的活性成分，具體涉及魚腥草多 糖及其衍生物及其制備方法和在制備補體抑制藥物中的用途。
[0007] 本發明對常用清熱解毒中藥魚腥草的水提物進行分離得到三個均一多糖，分別命 名為HC-PS1、HC-PS2和HC-PS3,并對三個多糖分別進行了硫酸化、羥乙基化和羧甲基化的 衍生化分析，經體外實驗證實所述的魚腥草多糖及其衍生物具有顯著的補體抑制活性，且 與肝素的活性相當，可作為抗補體藥物進行開發。
[0008] 本發明中，所述的中藥魚腥草是三白草科Saururaceae蕺菜屬植物蕺菜 Houttuynia cordata Thunb.的全草。
[0009] 本發明所述的魚腥草多糖HC-PS1、HC-PS2和HC-PS3的結構特征描述如下：
[0010] (I)HC-PSl是主要由七種單糖組成的雜多糖，糖殘基摩爾比為鼠李糖（Rha):阿拉 伯糖（Ara):甘露糖（Man):葡萄糖（Glc):葡萄糖醛酸（GlcA):半乳糖（Gal):半乳糖醛酸 (GalA) = 1. 0:3. 0:3. 9:2. 5:2. 4:6. 1:3. O ;分子量為 274530Da ;比旋度[a ]D25= -30. 0 (c 0.3, H2O);蛋白含量：1.41 % ;糖醛酸含量：24. 08% ;糖含量94. 60% ;不含硫酸基；其主要 連接方式有：末端、1，5-連接的阿拉伯糖等，1，3, 6-連接和1，4, 6-連接的甘露糖等，末端、 1，4-連接、1，3-連接、1，3, 6-連接、1，4, 6-連接的葡萄糖等，末端、1，4-連接和1，6-連接的 半乳糖等，1，4-連接的半乳糖醛酸等，此外還含有少量末端連接的鼠李糖，其中以末端連接 的阿拉伯糖，1，4, 6-連接的甘露糖和末端、1，4-連接的半乳糖（或半乳糖醛酸）為主；
[0011] (2)HC-PS2是主要由五種單糖組成的雜多糖，糖殘基摩爾比為 Man:Glc:GlcA:Gal:GalA = 1. 0:0· 3:1. 7:0. 7:4. 6 ;分子量為 7928Da ;比旋度[a ]D25 = -12. 8 (cO. 3, H2O);蛋白含量：1. 89% ;糖醛酸含量：65. 64% ;糖含量93. 10% ;不含硫酸 基；其主要連接方式有：末端連接的阿拉伯糖等；末端、1，6-連接和1，4, 6-連接的甘露糖 等，1，4-連接、1，3-連接和1，6-連接的葡萄糖等，1，4-連接的葡萄糖醛酸等，末端、1，4-連 接、1，3, 4-連接、1，4, 6-連接、1，3, 6-連接的半乳糖等，末端、1，4-連接、1，3, 4-連接的半 乳糖醛酸等，此外還含有少量末端連接的鼠李糖，其中以1，4-連接的葡萄糖（或葡萄糖醛 酸）和末端、1，4-連接、1，3, 4-連接的半乳糖（或半乳糖醛酸）為主；
[0012] (3)HC_PS3是主要由五種單糖組成的雜多糖，糖殘基摩爾比為 Man:Glc:GlcA:Gal:GalA = 1. 0:0· 5:0. 4:1. 2:0. 4 ;分子量為 216384Da ;比旋度[a ]D25 =-62.8(c 0.3, H2O);蛋白含量：1.53% ;糖醛酸含量：20. 19% ;糖含量93.73 % ;不含 硫酸基；其主要連接方式有：末端、1，5-連接的阿拉伯糖等；1，3, 4-連接、1，4, 6-連接和 1，3, 6-連接的甘露糖等；末端、1，4-連接、1，3-連接和1，4, 6-連接的葡萄糖等；末端、 1，4-連接、1，6-連接的半乳糖等；此外還含有少量末端連接的鼠李糖。其中以1，3, 4-連接 的甘露糖，1，4-連接的葡萄糖和1，4-連接的半乳糖為主。
[0013] 本發明所述的魚腥草多糖（HC-PS1、HC-PS2和HC-PS3)通過下述方法制備：
[0014] 魚腥草以95 %乙醇冷浸提取，濾過，用熱水提取，濾過，濃縮，離心，上清液加入4 倍體積的95%乙醇，靜置，離心去上清，沉淀以水復溶，減壓回收，除去乙醇；復溶液再以三 氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液調至中性，濃縮，透析，冷凍干燥即得粗多糖。粗多糖加蒸 餾水溶解，離心，上清液分次用DEAE-cellulose柱（Cl 1型）層析進行初步分離。以蒸餾水、 0. 4、0. 8、1. 2和2. Omol/L的NaCl溶液洗脫，收集各流份，根據糖顯色反應和紫外檢測的結 果合并相同流分，濃縮，透析及冷凍干燥得5個次級組分：Hl，H2, H3, H4和H5。取具有顯著 抗補體活性的H3和H4進一步分離；
[0015] 將H3加蒸餾水溶解，離心，上清液分次用Sephacryl S-400柱（100X2. 5cm)層析 分離。蒸餾水洗脫，收集各流分；根據吸光度和抗補體活性檢測結果合并相同流分，濃縮及 冷凍干燥得多糖H3-PS1和H3-PS2 ;將H3-PS1和H3-PS2分別加蒸餾水溶解，離心，上清液 分別分次用Sephacryl S-300柱（100X1. 6cm)層析分離。蒸餾水洗脫，根據吸光度和抗補 體活性檢測結果合并相同流分，濃縮及冷凍干燥得多糖HC-PSl和HC-PS2 ;
[0016] 將H4加0. 15mol/L的NaCl溶液溶解，離心，上清液分次用Superdex-200柱 (100 X I. 6cm)層析分離，0· 15mol/L·的NaCl溶液洗脫，根據吸光度和抗補體活性檢測結果 合并相同流分，濃縮及冷凍干燥得多糖HC-PS1、HC-PS2和HC-PS3。
[0017] 本發明分別制備了魚腥草多糖（HC-PSUHC-PS2和HC-PS3)的硫酸化、羥乙基化和 羧甲基化衍生物，并通過IR光譜比較驗證了各衍生化產物的結構；經體外試驗證實，魚腥 草多糖HC-PSl、HC-PS2和HC-PS3及其衍生物對補體經典和旁路途徑激活所引發的細胞溶 血均有明顯的抑制，即有明顯的抗補體作用。
[0018] 本發明中，HC-PSl及其硫酸化、羥乙基化和羧甲基化衍生物的CH5。值（經典 途徑50 %抑制溶血所需供試品的濃度）分別為0. 295±0. 032mg/mL、0. 128±0. 024mg/ !1^、0.243±0.04411^/1^和0.241±0.03811^/1^4?5。值（旁路途徑50%抑制溶血所需供 試品的濃度）分別為 〇· 318±0· 023mg/mL、0. 084±0· 012mg/mL、0. 186±0· 013mg/mL 和 0. 085±0. 006mg/mL ;
[0019] 本發明中，HC-PS2及其硫酸化、羥乙基化和羧甲基化衍生物的CH5。值分別 為 0.183±0.017mg/mL、0.091±0.020mg/mL、0.248±0.034mg/mL 和 0.202±0.022mg/ mL;AP5。值分別為 0.219±0.018mg/mL、(X 068±(X 008mg/mL、(X118±(X011mg/mL 和 0. 075±0. 008mg/mL ;
[0020] 本發明中，HC-PS3及其硫酸化、羥乙基化和羧甲基化衍生物的CH5。值分別 為 0.271±0.026mg/mL、0.137±0.029mg/mL、0.299±0.040mg/mL 和 0.260±0.014mg/ mL;AP5。值分別為 0.314±0.025mg/mL、0.080±0.007mg/mL、0.213±0.010mg/mL 和 0. 073±0. 002mg/mL ;
【附圖說明】