用于檢測人類mthfr基因多態性的引物對、探針及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測領域，具體涉及用于檢測人類MTHFR基因多態性的引物對、 探針和試劑盒。
【背景技術】
[0002] MTHFR是胞內葉酸和蛋氨酸代謝的關鍵酶，對葉酸和蛋氨酸代謝以及DNA甲基化 和DNA合成修復有重要關系。MTHFR酶活性降低導致還原型葉酸轉變為5-甲基四氫葉酸 (5-MTHF)減少，從而使5-氟-2脫氧尿嘧啶核苷酸（FdUMP)、胸甘酸合酶（TS)與還原型葉 酸組成的三元復合物減少，從而干擾DNA的合成和修復，削弱5-FU的抗瘤作用。
[0003] 葉酸代謝障礙被認為與多種出生缺陷疾病有關，亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR) 是葉酸代謝的關鍵酶。MTHFR存在多種基因多態性，其中c. 677位點是目前MTHFR最常見 的突變位點，等位基因型別分別是CC，CT和TT，677C>T基因突變會導致MTHFR酶活性降低。 另外，c. 1298位點有AA，AC，CC等位基因，當基因發生突變后，同樣也會引起酶的活性降低。 酶活降低使得人體攝入的葉酸無法轉換成有效形式，葉酸利用率因而下降，引起人體葉酸 利用障礙，增加了發生各種出生缺陷疾病的風險，因此在臨床應用上，相關基因的單核苷酸 多態性檢測可作為妊娠期葉酸補充量的依據。
[0004] 目前，對基因多態性的檢測分析技術方法主要包括:ARMS熒光PCR法，基因測序、 限制性片段長度多態性方法（RFLP)、基因芯片等方法。這些方法都有各自的優點和缺陷，尚 有待改進和標準化。
[0005] 1、ARMS 焚光 PCR 法：擴增阻礙突變系統（Amplification refractory mutation SyStem，ARMS)利用PCR引物的3'端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理， 設計等位基因特異性PCR擴增引物，在嚴格的條件下，只有在引物3'堿基與模板配對時才 能出現PCR擴增帶，從而檢測出基因突變。
[0006] 2、直接測序：Sanger測序法因為可以讀到DNA每個堿基的變化，目前被認為是檢 測基因突變的金標準方法。缺點是測序步驟繁瑣、耗時長，對設備和操作人員的要求較高， 檢測周期長，多限于在科研單位進行，大多數醫院都無法獨立完成檢測，較難形成標準化操 作、適合臨床單位應用的體外診斷產品。
[0007] 3、限制性片段長度多態性方法（RFLP):該方法成本低，對檢測設備要求低，突變 基因的檢出限在5~10%。但是，勞動強度稍大、需專業的技術人員、不適于高通量檢測和 大規模臨床應用。
[0008] 4、基因芯片法：該方法是將探針固定于支持物上，如玻片或膜，通過PCR方法擴增 出靶基因，再通過雜交手段進行芯片雜交，應用儀器進行結果判讀。該方法可以進行高密度 基因檢測，但成本高、操作繁瑣、檢測流程相對較長，在市場推廣上將受到一定限制。
[0009] 目前，還有待于開發一種操作簡單快捷、特異性高、具有抗污染的檢測人類MTHFR 基因多態性的試劑盒。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的之一在于提供一種操作簡單快捷、特異性高、具有抗污染的檢測人 類MTHFR基因多態性的試劑盒，該試劑盒可用于檢測MTHFR基因 c. 677位點、c. 1298位點 的基因型。
[0011] 實現上述目的技術方案如下。
[0012] -種用于檢測人類MTHFR基因多態性的試劑盒，包括有：針對MTHFR-c. 677位點的 擴增引物和堿基組成如SEQ ID NO: 3所示的熒光檢測探針、和/或針對MTHFR-c. 1298位點 的擴增引物和堿基組成如SEQ ID N0:6所示的熒光檢測探針。
[0013] 在其中一個實施例中，所述針對MTHFR-c. 677位點的擴增引物的堿基組成如SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO:2 所示。
[0014] 在其中一個實施例中，所述針對MTHFR-c. 1298位點的擴增引物的堿基組成如SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO: 5 所示。
[0015] 在其中一個實施例中，所述試劑盒包括有：針對MTHFR-c. 677位點的擴增引物 SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2以及堿基組成如SEQ ID NO:3所示的熒光檢測探針、和針對 MTHFR-c. 1298位點的擴增引物SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5以及堿基組成如SEQ ID N0:6 所示的熒光檢測探針。
[0016] 在其中一個實施例中，所述試劑盒還包括反應液，所述擴增引物在相應反應 液中的濃度分別為：c. 677上游引物的濃度為0. 1-0. 5 μ M，c. 677下游引物的濃度 為0. 05-0. 1 μ M ;c. 1298上游引物的濃度為0. 05-0. 1 μ M，c. 1298下游引物的濃度為 0. 1~0, 5 y- M0
[0017] 在其中一個實施例中，每種所述檢測探針在反應液中的濃度為：0. 1-0. 5 μM。
[0018] 在其中一個實施例中，所述試劑盒還包括有UNG酶。
[0019] 本發明的另一目的是提供用于檢測人類MTHFR基因多態性的檢測探針。
[0020] 實現上述目的的技術方案如下。
[0021] 用于檢測人類MTHFR基因多態性的檢測探針，包括有：針對MTHFR基因 MTHFR-c. 677位點的堿基組成如SEQ ID NO: 3所示的熒光檢測探針、和/或針對MTHFR基因 MTHFR-c. 1298位點的堿基組成如SEQ ID N0:6所示的熒光檢測探針。
[0022] 本發明的另一目的是提供用于檢測人類MTHFR基因多態性的檢測引物。
[0023] 實現上述目的的技術方案如下。
[0024] 用于檢測人類MTHFR基因多態性的引物，包括有：針對MTHFR-c. 677位點的堿基組 成如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示的引物、和/或針對MTHFR-C. 1298位點的堿基組成 如 SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5 所示引物。
[0025] 本發明具有以下有益效果：
[0026] (1)本發明采用經過大量實驗從眾多的引物中，挑出了具有高特異性的引物、焚光 探針，再進一步優化檢測體系，可實現高特異性地檢測MTHFR基因 c. 677位點、c. 1298位點 的基因型；其次，還具有檢測線性廣的優點，以25 μ L檢測體系可檢測2ng-600ng人基因組 DNA ;而且，還具有準確性高，檢測結果與金標準測序方法100%-致。
[0027] (2)閉管操作，檢測速度快，檢測過程只需90分鐘即可完成。
[0028] (3)抗污染，試劑盒中含有UNG酶，可以消除由于PCR產物導致的污染。
【附圖說明】
[0029] 圖Ia為實施例2中MTHFR-c. 677野生型樣本結果示意圖；
[0030] 圖Ib為實施例2MTHFR-C. 677突變純合型樣本結果圖；
[0031] 圖Ic為實施例2MTHFR-C. 677雜合型樣本結果圖；
[0032] 圖Id為實施例2MTHFR-C. 677雜合型測序結果圖；
[0033] 圖Ie為實施例2MTHFR-C. 677引物為SEQ ID NO:7-8的檢測結果圖；
[0034] 圖2a為實施例3MTHFR-C. 1298野生型樣本結果圖；
[0035] 圖2b為實施例3MTHFR-C. 1298突變純合型樣本結果圖；
[0036] 圖2c為實施例3MTHFR-C. 1298雜合型樣本結果圖；
[0037] 圖2d為實施例3MTHFR-C. 1298雜合型測序結果圖；
[0038] 圖2e為實施例3MTHFR-C. 1298引物為SEQ ID NO:9-10的檢測結果圖；
[0039] 圖2f為實施例3MTHFR-C. 1298引物為SEQ ID NO: 11-12的檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0040] 本發明采用的具體技術原理是在每個檢測靶點的PCR體系中，加入一對非等量的 特異性引物和一條覆蓋SNP位點的熒光探針。首先通過不對稱PCR擴增出含檢測位點的單 鏈寡核苷酸靶序列，其后運行熔解曲線熒光采集程序。從低溫到高溫的熔解過程中，熒光探 針與單鏈靶序列形成的雜交產物從互補配對到解鏈變性，期間的熒光值變化記錄為熔解曲 線。將熔解曲線對溫度作一階負導數可獲得雜交產物的熔解峰圖，并計算出相應的熔點（Tm 值）。由于SNP位點的堿基變化不同，導致靶序列與探針的匹配程度不一，因此雜交產物的 溫度穩定性及熔解行為各有差異。若單鏈靶序列中只有1種等位基因，并與探針完全匹配， 則只有1個熔解峰，其Tm值較高；反之，單一熔解峰的Tm值較低；若靶序列含有2種等位基 因，則會出現2個熔解峰，Tm值分別與兩種純合等位基因的熔解峰的Tm值一致。通過對熔 解峰圖的分析可對檢測位點基因型進行判讀。
[0041] 為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例詳細說明。應理解，這 些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的 實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。 實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產品。
[0042] 除非另有定義，本發明所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發明的技術領域 的技術人員通常理解的含義相同。本發明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實 施例的目的，不用于限制本發明。本發明所使用的術語"和/或"包括一個或多個相關的所 列項目的任