一種利用植物抗病基因富集簇的分子育種方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物抗病育種領域，具體涉及一種利用植物抗病基因富集簇的分子育 種方法。
【背景技術】
[0002] 由于植物病害每年給農、林生產帶來巨大的損失，合理有效地防治植物病害是保 障農、林可持續發展所必須解決的關鍵問題之一。大量實踐證明，開發和利用已有的植物抗 病種質資源是防治植物病害最為有效的方法之一，其中又以植物抗病基因的開發與利用最 為經濟有效。
[0003] 但到目前為止，國際、國內傳統的抗病育種主要有兩種途徑：途徑一，常規育種方 法，即將優質高產的品種與抗病性強的材料雜交，然后通過不斷的回交選育，最后得到抗病 且優質的新品種。這一過程盡管有效，但極其耗時，因此當新品種培育出來之后，極可能對 病原菌新進化產生的株系或小種表現為感病。途徑二：利用基因定位、克隆、轉基因的途徑， 目前利用最多的克隆方式為經典的圖位克隆方法，即將抗病和感病的品種雜交，然后對大 量的分離后代接種病菌、鑒定抗性、遺傳作圖等，最后在精確遺傳定位的基礎上進行克隆； 這種方法雖然取得了一定的效果，但同樣存在克隆周期長、費時費力、分離和鑒定困難，難 于找到用于農業生產的有效基因。以水稻抗稻瘟病基因為例，到目前為止，全世界共克隆了 20多個抗稻瘟病基因，且尚無用于生產實際的報道。追溯其主要原因，我們認為，缺乏對植 物抗病基因抗病機制及田間持久抗性機制的認知所致。
[0004] 植物抗病基因是植物與病原菌長期相互作用的結果，在植物的進化過程中扮演著 十分重要的角色。近年來，植物抗病分子機制的研究取得了突破性進展，但從生產實踐的 角度看，目前植物抗病基因的研究存在三個根本問題：一是能否發現抗病基因的高效克隆 方法；二是究竟能否找到廣譜高抗的基因；三是多少抗病基因才能使一個品種具有田間抗 性，從而使這些基因用于育種實踐。由于克隆的抗病基因數量太少，因而尚不知道一個基因 組有多少抗病基因？在高抗品系中是否存在廣譜高抗的基因？決定品種抗性的究竟是幾 個主效抗病基因，還是許多個抗不同病菌小種基因的組合？這些基本問題不清楚，就不知 道抗病基因抗性變化及其在基因組中分布的規律性，很難實現抗病基因的實用化。
[0005] 我們另辟新徑，提出了以植物與病菌共進化為基礎的抗病基因克隆方法，專利申 請號：201210453400. 9。該方法的基本假設為，為了對付快速進化的病菌，寄主的抗病基因 位點的進化也更快。反之，植物對付進化較慢的病菌（或病菌的基因），其相應抗病基因進 化也較慢。我們以水稻稻瘟病的抗性為例進行了研究，通過各種遺傳參數的計算，從而估計 每一個基因位點的進化速度，在水稻基因組500多個NBS-LRR基因位點中，選出了 130多個 進化快的位點；在10個高抗品系中系統的克隆這些位點的基因，共克隆了約1000個候選抗 病基因；通過遺傳轉化到感病品系，最后用不同小種的稻瘟病菌鑒定其抗性。最終，我們一 共獲得168個功能性抗稻瘟病基因，其中含27個抗譜廣、抗性強的抗稻瘟病基因。
[0006] 通過對抗病基因在各個品種基因組的遺傳定位分析，發現多個高抗廣譜的基因位 于某個高抗品種的同一個基因簇中，即抗稻瘟病基因的富集簇。這些抗病基因的富集簇，不 僅為指導我們利用抗病基因富集簇進行分子抗病育種提供了理論基礎，同時由于我們非常 清楚這些富集簇的染色體位置、序列、來源品系等，為我們進行快速的抗病育種提供了可靠 的原材料。
[0007] 目前克隆的基因，還沒有用于生產的成功例子。一個突出的問題是：從抗性很好的 水稻供體品系中克隆的基因，其抗譜和抗性均欠佳。抗稻瘟病的基因Pi2/9就是突出的例 子，其供體抗譜很廣，但克隆的pi2/9單個基因的抗性則相對有限。這種現象暗示，一個抗 病品種中可能含有多個抗稻瘟病基因。要使抗稻瘟病基因用于實際生產，不僅需要一定數 量的廣譜高抗基因，而且需要把他們組合到一起。因此，定位育成的品種，多了 5-10個廣譜 高抗的基因，抗性強或抗性得到加強，使之可以在生產上繼續使用。
【發明內容】
[0008] 本發明所要解決的技術問題是提供一種稻瘟病性強的利用植物抗病基因富集簇 的分子育種方法及其應用。
[0009] 為了實現上述目的，本發明通過如下技術方案實現：本發明提供了一種利用植物 抗病基因富集簇的分子育種方法，包括如下步驟：
[0010] (1)抗稻瘟病基因富集簇的挖掘與功能驗證：篩選含抗稻瘟病基因的候選基因 簇，選擇15-20個高抗稻瘟病的水稻品系；
[0011] 對候選富集簇的每一個基因進行克隆，通過遺傳轉化這些基因到感病品系，最后 用不同小種的稻瘟病菌鑒定其抗性；篩選2個或多于2個抗病基因的富集簇，其中包括廣譜 尚抗的基因；
[0012] (2)挑選抗病基因位點：挑選可靠的抗病基因富集簇，只需一個標記，即一個單 位，就代表了 2個或更多的抗病基因，選擇1個或多個富集簇作為導入對象；
[0013](3)培育中介品種：每一個富集簇，都來源于一個特定抗源品系，不同的富集簇， 來源于同一抗源或來自不同抗源；
[0014] 這些抗源與數個具備優良農藝性狀的水稻品種雜交獲得"中介品種"，使每一個中 介品種含有1個或多個富集簇，平均5個以上抗稻瘟病基因；
[0015] 中介品種的富集簇區段要保證純合，其余則無需純合，可以自交繁殖；
[0016] 對中介品種和抗源親本均需全基因組測序來獲取高密度標記；
[0017] 優良的中介品種也可直接作為抗病的優良品種；
[0018] (4)篩選目的品種：在廣泛推廣的高產優質但抗稻瘟病欠佳；或開始喪失抗性的 優良品種中；或在區試中表型優異但抗稻瘟病欠佳的品系中，選擇數十個目的品種作為抗 病性改造對象，對每一個目的品種全基因組測序并與中介品種比較，從而在每一個Mb的染 色體上找到3-5個特定遺傳標記；
[0019] (5)定位選育抗病品種：對每一個目的品種都與1-2個中介品種雜交并回交，對回 交子代幼苗提取DNA，用PCR檢測96遺傳標記，大約每3個Mb -個標記；
[0020] 選擇具有富集簇標記，但其余標記均為目的品種的株系；再回交1-2次，用更多標 記進行檢測，保證除了富集簇標記而外，均為目的品種的遺傳標記；
[0021] 同時，觀察育成品種優良農藝性狀是否保持；最后，觀察育成品種的表型是否抗性 變強。
[0022] 進一步地，在步驟（1)中，篩選含抗稻瘟病基因的候選基因簇，根據NBS-LRR基因 簇數量、進化速率、品種間同一基因簇拷貝數量變化及核苷酸差異度遺傳特征來進行挑選。
[0023] 進一步地，在步驟（1)中，水稻品系為Tetep，谷梅2號，Moroberekan、LAC23或PAI KAN TA0〇
[0024] 更進一步地，在步驟（3)中，挑選具備優良性狀的水稻品種，將其與含富集簇的抗 源品系進行雜交，得到富集簇區段純合的中介品種。
[0025] 進一步地，在步驟（4)中，目的品種和中介品種每Mb染色體上為特定遺傳標記。
[0026] 本發明所述的含多個抗病基因的富集簇，其包含的稻瘟病抗性基因的核苷酸序列 分別如SEQIDN0:1-15所示。
[0027] 本發明含有所述的稻瘟病抗性基因的載體。
[0028] 本發明所述的稻瘟病抗性基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0:16-30。
[0029] 本發明所述的稻瘟病抗性基因在制備轉基因抗稻瘟病水稻的應用。
[0030] 本發明所述的載體用于轉化水稻從而制備轉基因抗稻瘟病水稻中的應用。
[0031] 有益效果：本發明的分子育種方法得到的水稻的稻瘟病性強并能保持優良農藝性 狀，選育成的僅含富集簇標記和目的品種遺傳標記的抗病品種，最終育成的高產、優質、抗 病的新水稻品系。利用植物抗病基因富集簇的分子育種，可望與高產優質品種相結合，避開 轉基因技術，實現作物抗病育種方法的突破，形成一套全新、高效的作物育種體系。可以供 其他農藝性狀精準定位育種借鑒與應用；抗病基因在育