一株耐微波枯草芽孢桿菌及其在納豆激酶制備中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株耐微波枯草芽孢桿菌及其在納豆激酶制備中的應用，屬于微生物
技術領域。
【背景技術】
[0002] 隨著人們生活節奏的加快和飲食習慣的調整，血栓性疾病的發病率大大提高，嚴 重威脅著人類的健康與生命安全，每年死于腦梗塞、心肌梗死的病人多達幾百萬，居各種疾 病之首。目前，治療心腦血管疾病的首選方法是溶解血栓，因此，具有高纖溶活性溶栓藥物 (如納豆激酶）的研發成為研究熱點之一。
[0003] 納豆激酶是納豆（natto)在發酵過程中由枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis) 產生的具有高纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，該酶不但具有顯著的溶栓活性，還可以激活體內 的纖溶酶原，增加內源性溶纖酶的含量，具有降血壓、抗氧化、抗腫瘤及溶血栓等多種醫療 功效，而且與傳統的溶栓制劑相比，納豆激酶有不易引起出血、無抗原性、半衰期長、安全無 毒、成本低廉及口服有效等優點，因而具有開發為預防心腦血管疾病保健食品的潛力。自 1987年被Dr.Sumi首次從納豆中分離出來后，納豆激酶便受到世界相關研究人員的廣泛關 注。
[0004] 與此同時，由于飲食習慣、工作壓力以及環境等的影響，腸道疾病的發病率也有逐 年增高之勢，給人們的生活和工作造成了重大影響。腸道微生物又稱人類的第二套基因組， 與多種腸道疾病如代謝性疾病、免疫性疾病甚至腫瘤的發生都有直接關系。因此，改善腸道 微環境、調節腸道菌群是預防和治療腸道疾病的關鍵，而腸道益生菌也是21世紀新型藥物 研發的方向。
[0005] 納豆激酶發酵菌株一一枯草芽孢桿菌是人體益生菌，其活菌劑對人體具有多種生 物功能。首先，枯草芽孢桿菌可以抑制致病菌生長，促進益生菌生長，從而改善腸道微生態 環境，預防痢疾、腸炎、便秘等腸道疾病；其次，枯草芽孢桿菌通過分泌有機酸、細菌素等，可 以增強機體免疫功能；再者，枯草芽孢桿菌在腸道內增殖，可以調節機體腸道代謝；最后， 枯草芽孢桿菌通過分泌各種酶和維生素類物質，能夠促進腸道營養物質的消化吸收。
[0006] 而在現有納豆激酶產品產業化生產的過程中，由于發酵產物的干燥需要用到微波 真空干燥設備，該干燥過程會殺死大部分發酵生產納豆激酶的枯草芽孢桿菌活菌，因此，納 豆激酶產品中枯草芽孢桿菌活菌含量不高。如果能篩選出一株耐微波的納豆激酶高產菌 株，就可以得到富含枯草芽孢桿菌活菌的納豆激酶產品，該產品不但具有納豆激酶產品的 降壓、溶栓等功效，還含有豐富的枯草芽孢桿菌活菌，從而起到改善腸道功能、預防和治療 腸道疾病的作用，其未來的發展前景不言而喻，但目前國內還沒有相關方面的報道。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一株耐微波枯草芽孢桿菌及其在納豆激酶制備中的應用，以 解決納豆激酶生產過程中由于枯草芽孢桿菌不耐微波輻射，而不易得到富含枯草芽孢桿菌 活菌的納豆激酶產品（納豆膠囊）的技術問題。
[0008] 為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是提供一株耐微波枯草芽孢桿菌， 所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)LB-18,保藏單位：中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號： CGMCCNO. 10835,保藏日期：2015 年 5 月 22 日。
[0009] 本發明從豆豉中篩選出耐微波枯草芽孢桿菌菌株LB-18,采用本發明的菌株，可以 獲得具有高纖溶活性且富含枯草芽孢桿菌活菌的納豆激酶產品（納豆膠囊）。實驗結果 表明，本發明菌株生產的納豆激酶產品纖溶活性可達2800FU/g ;枯草芽孢桿菌活菌含量為 1. 26 X IO8個/g，是現有納豆激酶發酵產物的幾倍。
[0010] 本發明所采用的技術方案還在于提供一株枯草芽孢桿菌在生產富含枯草芽孢桿 菌活菌的高纖溶活性納豆激酶產品方面的應用。
[0011] 本發明所采用的技術方案還在于提供一株枯草芽孢桿菌生產富含枯草芽孢桿菌 活菌的高纖溶活性納豆激酶的方法，包括以下步驟：
[0012] (1)從斜面挑取枯草芽孢桿菌LB-18接種于LB液體種子培養基，25-40°C條件下， 120-180r/min搖床恒溫培養12-18h，得到枯草芽孢桿菌種子液；
[0013] (2)將黃豆浸泡過夜，瀝干水分，高壓滅菌，冷卻至室溫后，按照1-8%的接種量接 種枯草芽孢桿菌種子液，25-40°C條件下發酵培養36-72h;
[0014] (3)將步驟⑵的黃豆發酵培養產物微波真空干燥，粉碎，過80-120目篩即得。
[0015] 所述LB液體種子培養基包括以下質量分數的原料：蛋白胨1%，酵母粉0.5%， NaCll%;pH6.8，121°C高壓滅菌 20min。
[0016] 所述微波真空干燥設備的干燥條件為：干燥溫度彡40°C，真空度-0.06MPa，微波 功率8kW，微波頻率2450 ± 50MHz，干燥時間3-8h。
[0017] 采用本發明的枯草芽孢桿菌生產納豆激酶產品，不但可以得到具有高纖溶活性的 納豆激酶，而且還是一種富含枯草芽孢桿菌的活菌制劑，從而既有降壓、溶栓等功效，還有 改善腸道功能、提高機體免疫力的作用，為納豆激酶作為功能性食品和保健食品的研發提 供了新的思路，使其具有更為廣闊的開發前景。同時，本發明采用黃豆為原料，來源豐富易 取，成本低，無環境污染，所用設備、試劑價格便宜，便于規模化生產。
【附圖說明】
[0018] 以下結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0019] 圖1為本發明菌株LB-18及其他納豆激酶生產菌株用不同劑量C〇60輻照后的存 活率；
[0020] 圖2為本發明菌株LB-18及其他納豆激酶生產菌株用不同時間微波照射后的存活 率。
【具體實施方式】
[0021] 以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0022] 實施例1納豆激酶高產菌株的篩選
[0023] I. 1納豆激酶高產菌株的初篩取市售豆豉，稱取樣品10g，加入IOOmL無菌水中， 充分振蕩打散，100°c沸水煮沸5min，靜置片刻，取上層混濁液，梯度稀釋后，分別取100iiL不同稀釋度的溶液，均勻涂布于LB平板上，37°C過夜培養，挑單菌落進行劃線培養，連續兩 次。挑取LB分離平板上的單菌落點種到纖維蛋白平板上，37°C培養18h，測量溶解圈直徑， 溶解圈較大的菌株液體發酵進行復篩。
[0024] 1. 2納豆激酶高產菌株的復篩將初篩溶解圈直徑較大的菌株，用LB種子培養基活 化（37°C、150r/min、過夜），按照5%的接種量分別接入液體發酵培養基（以質量分數計： 6%大豆粉，2%葡萄糖，0.06%CaCl2,0.07%MgS04,pH6.5)中，37°C發酵 72h，發酵產物用 0. 05M、pH7. 4的磷酸緩沖液稀釋，取稀釋液10yL，加樣于纖維蛋白平板上37°C恒溫培養 18h，測定溶解圈直徑，選取溶解圈較大的菌株，進行耐輻射菌株的篩選。
[0025] 實施例2耐輻射納豆激酶高產菌株的篩選
[0026] 2. 1亞硝基胍誘變取復篩后產納豆激酶活性相對較高的菌株，接種于液體LB培 養基中，37°C、150r/min、過夜培養后，重新轉接于LB液體培養基中（接種量1% )，37°C、 150r/min搖床培養至對數生長后期（約5_8h)，鏡檢觀察菌體形態后，8000r/min離心5min 收集菌體，用滅菌的0. 1M、pH7. 0的磷酸鈉鹽緩沖液（PBS)洗滌菌體后，重新懸浮于0.IM PBS緩沖液中（使細菌濃度為IO6-IO8個/mL)，加入2mg/mL亞硝基胍（NTG)溶液（用0? 1M、 pH7. 0的PBS配制），使其終濃度為0? 2mg/mL，35°C、150r/min搖床誘變Ih后，用0?lM、pH7. 0 PBS洗滌3次除去NTG，菌體重新懸浮于PBS中。
[0027] 2. 2耐Co6°輻照納豆激酶高產菌株的篩選將NTG誘變后重懸于PBS中的菌體用 Co6°輻照，第一次輻照劑量為IOOGy;照射后梯度稀釋涂LB平板，計算致死率；隨后離心收 集菌體，加入滅菌LB液體培養基，37°C、150r/min搖床重新培養至對數后期（約5h)，鏡檢 觀察菌體形態后，收集菌體，并將其重懸于PBS緩沖液中，進行第二次Co6°輻照（劑量逐漸 增加），如此反復進行Co6°輻照，所用劑量依次為100、200、400、600、800、1000 Gy。經Co6°反 復輻照后，得到一株耐Co6°照射的菌株LB-18 (結果見附圖1)。
[0028] 2. 3菌株LB-18耐微波性能測定將菌株LB-18接種到滅過菌的LB液體培養基， 37°C、150r/min搖床重新培養至對數生長后期，用質量分數0. 9%NaCl洗滌2次后，用質量 分數0. 9 %NaCl重懸，稀釋至IO8個細胞/mL，取ImL菌液加入9mL質量分數9 %NaCl，混勻 后置于冰塊上，調至中等火力，進行微波輻照，輻照時間分別為3、5、7min，每個樣品設3個 重復，輻照后梯度稀釋涂LB平板，計算細菌存活率，用納豆激酶生產菌株DC-Tx和R作對照 (結果見附圖2)。
[0029] 菌株LB-18的特征如下：
[0030] 形態特征：
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