一種強啟動子及其在提高納豆激酶表達的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種強啟動子及其在提高納豆激酶表達的應用，屬于微生物基因工程 領域。
【背景技術】
[0002] 屯、腦血管疾病嚴重的威脅著人類的身體健康，而目前臨床注射的抗血栓藥物普遍 存在穩定性差、藥效短、副作用大和成本高等缺點。自1987年，日本學者Sumi等首次從納豆 中分離純化得到具有高效溶血栓功效的納豆激酶，它便成為了近年溶血栓藥物研究新方向 之一。納豆激酶(Nattokinase，NK)是一種由納豆菌或納豆枯草桿菌產生的堿性絲氨酸蛋白 酶，因具有特殊的溶血栓活性，既能預防也能治療血栓疾病。與其它溶栓藥物相比，它具有 安全性能好、無免疫原性、易被人體消化吸收、可靜脈注射也可W 口服、半衰期長、生產價格 低廉等優點。但因納豆激酶野生菌的產酶量低，嚴重限制了其發展，因此提高納豆激酶的產 酶量具有很好的研究價值。
[0003] 枯草芽抱桿菌作為傳統的工業生產菌，因其遺傳和生理生化背景清晰，培養簡單 快速，蛋白質分泌能力高、非致病性及良好的發酵生產基礎，被廣泛應用于工、農、醫藥等多 領域。本發明中選擇使用的宿主菌是胞外蛋白酶活性較低的枯草芽抱桿菌WB800。
[0004] 外源蛋白在枯草芽抱桿菌中的高效表達是實現其在工業應用上的重要途徑。目 前，國內外研究學者大多通過菌株篩選、生產工藝條件優化，W及利用基因工程手段構建高 效表達載體等方法來提高納豆激酶產量。2014年，Suwanmanon等通過單因素和正交實驗確 定了枯草芽抱桿菌的最佳發酵培養基和發酵工藝條件，納豆激酶表達量達到130.96即/mL; 黃磊等通過構建基因工程菌的方法成功實現了納豆激酶在枯草芽抱桿菌中的表達(60U/ mU;本課題組也已通過信號膚篩選構建了重組納豆激酶的高效分泌表達質粒，表達量達到 190mg/L。然而目前納豆激酶的產量仍不足W滿足生產需求。
[0005] 基因表達體系是一個復雜的過程，啟動子是基因表達調控的重要順式調控元件， 也是基因工程表達載體的重要元件，選用強啟動子可W使克隆基因高水平表達。
[0006] 如何設計得到強啟動子是目前亟需解決的問題，無論是在理論研究還是實際生產 中都有十分重要的意義。
【發明內容】
[0007] 為了解決上述問題，本發明通過對強啟動子時43和/或啟動子PHpall進行η次重復串 聯(η >l)，w期提高啟動子活力，實現外源蛋白的高效表達。本發明的目的是提供一種強啟 動子W及利用該強啟動子在枯草芽抱桿菌WB800中高效表達重組納豆激酶的方法。鑒于啟 動子是基因工程表達載體的重要元件，對外源基因表達水平有較大的影響，本發明W強啟 動子PP43和PHpan基因序列為基礎，采用對啟動子PP43和/或扣pall進行串聯η次串聯的方式得 到一類新的啟動子，提高RNA聚合酶與啟動子結合的頻率，進而提高啟動子活力。本發明的 新的啟動子有效地提高了異源蛋白在枯草芽抱桿菌中的表達量。
[0008] 本發明的第一個目的是提供一種新的強啟動子，是將啟動子時43和/或啟動子扣pall 進行η次串聯(η > 1)。
[0009] 本發明中，如無特殊說明，啟動子的串聯是從左到右依次串聯，比如時43-Ρ也all-時43 是指在將扣pall串聯到兩個PP43的中間。
[0010] 所述啟動子的核巧酸序列是SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、沈Q ID N0.7、沈Q ID N0.8、SEQ ID N0.9、SEQ ID NO.IO 中的任意一種。
[0011] 在本發明的一種實施方式中，所述啟動子是W下任意一種：
[0012] (1)將啟動子時43和/或啟動子扣pall進行一次串聯，形成序列如沈Q ID NO. 1的啟動 子時43-P也all、序列如沈Q ID NO. 2的啟動子扣pan-時43、序列如沈Q ID NO. 3的啟動子P也an-扣pall，或者序列如SEQ ID ^.4所示的啟動子時43斗口43;
[OOK] (2)將啟動子時43和/或啟動子扣pall進行兩次串聯，形成序列如沈Q ID NO.5的啟動 子扣。31廣扣。311-時43;序列如56〇10^.6的啟動子?。43斗。43斗。43;序列如沈〇10^.7的啟動 子扣。311斗也311斗也311;序列如沈〇10側.8的啟動子?。43斗也311斗。43;序列如沈〇10側.9的啟 動子PHpaII-Pp43-PHpaII;序列如SEQ ID側.10的啟動子時43斗。43斗化311;
[0014] (3)將啟動子時43和/或啟動子扣pall進行Ξ次或者Ξ次W上的串聯。
[0015] 本發明的第二個目的是提供含有所述強啟動子的質粒載體。
[0016] 在本發明的一種實施方式中，所述質粒載體可W是W下任意一種:pM0911-wapA， pMA0911-yncM(短線后為信號膚）。
[0017] 在本發明的一種實施方式中，所述質粒載體為大腸桿菌-枯草芽抱桿菌穿梭載體 pMA0911 -wapA。所述載體 pMA0911 -wapA的信號膚為wapA。
[0018] 本發明的第Ξ個目的是提供含有所述質粒載體的基因工程菌。
[0019] 在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌是枯草芽抱桿菌重組得到的重組枯 草芽抱桿菌。
[0020] 在本發明的一種實施方式中，所述枯草芽抱桿菌可W是W下任意一種:枯草芽抱 桿菌 168，WB800，WB800，PWB980。
[0021] 在本發明的一種實施方式中，所述枯草芽抱桿菌為枯草芽抱桿菌蛋白酶缺陷型菌 株WB800。
[0022] 本發明的第四個目的是提供一種所述基因工程菌的構建方法。
[0023] 在本發明的一種實施方式中，所述構建方法是:首先將外源基因克隆到PMA0911質 粒上，然后用本發明的強啟動子代替PMA0911質粒上原有的啟動子，得到含有強啟動子和外 源基因的重組表達質粒PMA0911巧MiM，然后將質粒PMA0911巧轉化到枯草芽抱桿菌， 篩選即得到基因工程菌。
[0024] 在本發明的一種實施方式中，所述構建方法具體是：（1)目的基因的獲取：根據 Genbank所提供的納豆激酶基因序列（Genbank登錄號：S51909.1)設計引物pro-NK-F/pro-NK-R，W納豆芽抱桿菌（B.natto)的基因組DNA為模板擴增pro-nk基因；（2)穿梭質粒的構 建:將PCR產物pro-nk，經EcoR巧日BamH I雙酶切后，連接到用同樣限制性內切酶雙酶切的 大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質粒pMA0911-wapA，連接獲得穿梭質粒pMAOgilPHpaii-pro-NK; (3) 根據啟動子P43和扣pall基因序列設計引物，分別W質粒PMA091 IPHpaii-pro-NK W及枯草芽抱 桿菌168基因組為模板進行PCR，得到含有目的啟動子的基因片段，再W質粒pMA0911PHpaii-pro-NK為模板，PCR產物為引物進行全質粒PCR，得到重組表達質粒；（4)將重組表達質粒轉 入枯草芽抱桿菌WB800中，即得到基因工程菌。
[0025] 本發明的第五個目的是提供一種利用所述強啟動子提高外源蛋白表達的方法。
[0026] 所述外源蛋白，在本發明的一種實施方式中，可W是W下任意一種:納豆激酶、氨 膚酶。
[0027] 所述納豆激酶，在本發明的一種實施方式中，其基因序列為Genbank登錄號： S51909.1所示的序列。
[0028] 所述方法是:首先將外源基因克隆到表達質粒上，然后對啟動子時43和/或PHpall進 行串聯η次(η含1)串聯，形成一新的強啟動子，既而得到含有強啟動子的重組質粒，將重組 質粒轉化到宿主菌中得到重組菌，然后利用重組菌表達外源蛋白。
[0029] 所述宿主菌，在本發明的一種實施方式中，可W是枯草芽抱桿菌168，WB800，WB800 或PWB980。
[0030] 所述表達質粒，可W是PMA0911，但不僅僅限于PMA0911，經多次實驗驗證，本發明 的強啟動子對于其他枯草穿梭載體同樣適用。
[0031] 所述表達，在本發明的一種實施方式中，是:將重組菌于37°C震蕩培養8-12h。再將 菌液按1-5%的接種量接種至30mL/250mL的搖瓶表達培養基中發酵表達。
[0032] 所述發酵表達使用的表達培養基，在本發明的一種實施方式中，含有：1-5%膜蛋 白腺、1-5 %酵母提取物、0.1-5%甘油、17mM KH2PO4、72mM K2HPO4，并添加了0.02-0.08 %氯 化巧。
[0033] 本發明的有益效果:采用對啟動子時43和/或PHpall串聯的方式，得到了一系列可提 高外源蛋白產量的強啟動子。本發明的強啟動子扣pall可W在枯草芽抱桿菌中高效表達外源 基因。強啟動子PHpan-扣pan-時43相對于PHpall啟動子，使納豆激酶酶活提高了 138.4%，相對 于PP43啟動子，使納豆激酶酶活提高了 88 % ; Pp43-Pp43-Pp43相較于PP43，使納豆激酶酶活提高 了75.9%;?也311斗也311斗也311相較于？怔311，使納豆激酶酶活提高了92.5%，？化311斗。43爪43-PHpall相對于P43啟動子，也使納豆激酶的酶活分別提高了 49.9 %、64.9 %。本發明的強啟動 子，用于提高其他外源蛋白在枯草芽抱桿菌中的表達，比如氨膚酶，也具有較好的效果。
【附圖說明】
[0034] 圖1:枯草芽抱桿菌WB800中含不同啟動子的表達質粒的構建;其中，Promoter X中 的X分別代表扣pall、Pp43等不同啟動子。
[0035] 圖2:串聯啟動子的結構示意圖；其中，灰色方框表示信號膚(SP)，黑色方框表示納 豆激酶基因（pro-NK)，白色箭頭表示啟動子扣pall或PP43。
[0036] 圖3 :重組納豆激酶表達產物的SDS-PAGE電泳圖；其中，a)M:蛋白分子量標準；1， WB800/pMA0911P也 an-町 0-NK 的發酵上清；2，WB800/pMA091 lPp43-pr〇-NK 的發酵上清；b)M:蛋 白分子量標準；1，WB800/PMA091 lPP43-PHpan-pr〇-NK的發酵上清；2，WB800/PMA091 IPHpan-Pp43-pr〇-NK的發酵上清；3，WB800/pMA091 IPHpan-PHpan-pro-NK的發酵上清；4，WB800/ PMA091 lPP43-Pp43-pr〇-NK 的發酵上清；c)M:蛋白分子量標準山WB800/PMA091 IPHpan-PHpan-Pp43-pr〇-NK 的發酵上清；2，WB800/pMA091 IPHpan-時 43-PHpan-pro-NK 的發酵上清；3，WB800/ pMA0911 PHpall-PHpall-PHpall-町0-NK的發酵上清；4，WB800/pMA091 lPp43-PHpaII-Pp43-p：r〇-NK的 發酵上清；5，WB800/pMA091 lPP43-Pp43-PHpan-pr〇-NK 的發酵上清；6，WB800/pMA0911 時43-時43-Pp43-pr〇-NK的發酵上清。
[0037] 圖4:重組納豆激酶纖溶活性的比較；其中1~12分別為WB800/PMA0911P也31廣口'〇-NK; WB800/pMA091 lPp43-pr〇-NK; WB800/pMA0911PP43-P 也 an-pro-NK; WB800/pMA091 IPHpan-Pp43-pr〇-NK; WB800/pMA091 IPHpan-PHpan-pro-NK; WB800/pMA0911 Pp