一種產特定分子量透明質酸的重組枯草芽孢桿菌構建的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種產特定分子量透明質酸的重組枯草芽孢桿菌的構建方法，屬于生 物工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 透明質酸（HyaluronicAcid，HA)，最早是從牛眼玻璃體中分離出的一種高粘性多 糖，由于具有良好的保濕性、粘彈性、滲透性和延展性，同時無任何免疫原性和毒性，是目前 發現的自然界中保濕性最好的物質，被廣泛應用于化妝品、食品和醫藥等行業領域。近年來 研究發現，低分子量的HA(低于IXIO4道爾頓）和透明質酸寡糖具有獨特的生物學功能， 例如低于10000道爾頓的小分子寡糖具有促進創傷的愈合，抑制腫瘤細胞等。此外，HA寡 糖容易被人體吸收而用于人體自身HA等多糖合成的前體，因此，HA寡糖在食品保健以及醫 藥領域具有重要的應用前景。
[0003] HA廣泛地存在于各種動物組織內，如雞冠、關節滑液、軟骨、眼玻璃體等，同時發現 HA也存在于產氣桿菌、綠膿桿菌和A、B、C溶血性鏈球菌等部分細菌中。由于動物提取工藝 復雜、效率低以及存在病毒種間交叉感染和其它風險性的感染，近些年以來，透明質酸的獲 取已經普遍由傳統的動物組織提法轉變為微生物發酵法，而應用最廣的是致病性弱的溶血 性鏈球菌C族菌，如Streptococcusequi和S.zooepidemicus，而且微生物發酵法獲得的 HA多為大分子量的HA。面對越來越高的衛生安全要求，尋找安全可靠的微生物宿主生產透 明質酸顯得越來越迫切。
[0004] 目前，雖然已有報道采用從頭合成的方法來制備HA寡糖，但由于化學合成存在底 物昂貴、步驟繁瑣以及合成效率低等多問題，難以實現HA寡糖制備應用。目前，HA降解的 方法主要有物理降解和化學降解，但產生的分子量范圍分布較大，產品穩定性較差，且分離 純化成本高，高能耗和高污染等，相比較，酶法催化合成HA寡糖是一種很有潛力的方法，但 需要制備大量的透明質酸酶液和控制反應條件。因此，將微生物發酵生產HA和透明質酸酶 (Hyaluronidase,HAase)相偶聯，實現一菌發酵直接生產獲取HA寡糖和透明質酸酶兩種產 物，具有一定的研究意義和工業化潛力。
[0005] 透明質酸酶（Hyaluronidase,HAase)，是廣泛分布于自然界中的一類可降解 透明質酸的酶的總稱。根據HAase的來源、結構和作用機制，HAase可以分為三類：內 切-P-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（EC3. 2. 1. 35,主要存在于哺乳動物以及蜜蜂、蛇、蜘蛛等 毒液）、內切-(6-葡萄糖醛酸苷酶（EC3.2. 1.36,主要存在于水蛭）以及透明質酸裂解酶 (EC4.2.2. 1，主要存在于細菌、噬菌體以及真菌）。透明質酸酶作為"擴散因子"在臨床上 被廣泛應用于藥物擴散助劑，而目前商品化的透明質酸酶主要以牛睪丸組織提取制備，產 品質量差，價格昂貴和具有動物疫源感染風險。
[0006] 本發明在食品級微生物Bacillussubtilis中構建HA的合成途徑，通過對合成HA 的途徑中的關鍵基因進行調控表達（UDP-GlcNAc和UDP-GlcA兩個前體物的合成途徑關鍵 基因），實現HA在食品級微生物Bacillussubtilis中的高產。同時，在構建的合成HA工 程菌中進行分泌表達水蛭HAase，實現一菌同步發酵生產HA和HAase。特別是，采用基因工 程手段，在翻譯水平上精確調控HAase的表達分泌水平，實現了特定分子量HA的發酵生產， 這一偶聯模式不僅解決了當前微生物生產HA過程中由于粘度過高導致發酵停滯，產量難 以獲得大幅度突破的瓶頸問題，尤其是本項目首次實現微生物高效合成特定分子量的HA， 這具有巨大的應用價值和經濟效益。
【發明內容】
[0007] 本發明提供一種產特定分子量透明質酸的重組枯草芽孢桿菌，是在枯草芽孢桿菌 內構建了產透明質酸的途徑，偶聯分泌表達透明質酸酶，并通過不同強度的RBS來調控透 明質酸酶的表達量。
[0008] 所述透明質酸酶表達量越高，重組枯草芽孢桿菌生產所得HA的分子量越小，產量 相應提尚。
[0009] 在本發明的一種實施方式中，所述分泌表達透明質酸酶是將組成型啟動子P^A、 RBS和信號肽的融合片段，以及透明質酸酶基因，整合到構建了產透明質酸途徑的枯草芽孢 桿菌中；所述PlepA、RBS和信號肽的融合片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 8或SEQIDNO. 12 或SEQIDNO. 13所示。所述整合可通過質粒pBlueScriptSK(+)介導。
[0010] 在本發明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌宿主為Bacillussubtilisl68。
[0011] 在本發明的一種實施方式中，編碼所述透明質酸酶的核苷酸序列如SEQIDNO. 7 所示。
[0012] 在本發明的一種實施方式中，編碼所述透明質酸合酶的基因hasA可以來源于獸 疫鏈球菌（Streptococcuszooepidemicus)、馬鏈球菌（Streptococcusequi)或類馬鏈球 菌（Streptococcusequissp)。在本發明的一種實施方式中，編碼所述透明質酸合酶的基因 hasA來源于獸疫鏈球菌，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0013] 在本發明的一種實施方式中，所述產透明質酸的途徑，是在重組表達透明質酸合 酶的基礎上，進一步構建了透明質酸前體物質UPD-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc)以及UDP-D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA)的合成途徑。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，所述UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的合成途徑基因來 源于鏈球菌屬（Streptococcusspecies)、大腸桿菌（Escherichiacoli)或芽抱桿菌 (Bacillus)。在本發明的一種實施方式中，編碼所述途徑的基因來源于枯草芽孢桿菌，包括 核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示的編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD，核苷酸序列如SEQ IDNO. 3所示的編碼UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，核苷酸序列如SEQID NO. 4所示的編碼UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB，核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示的 編碼變位酶的基因glmM，核苷酸序列如SEQIDNO. 6所示的編碼氨基轉移酶的基因glmS。
[0015] 在本發明的一種實施方式中，所述透明質酸酶來源于水蛭，融合信號肽和啟動子 后重組整合到產HA的枯草芽孢桿菌基因組上進行表達。
[0016] 本發明提供一種構建所述重組枯草芽孢桿菌的方法，主要包括以下步驟：
[0017] (1)構建透明質酸的合成途徑：將編碼透明質酸合酶的基因hasA連接到質粒 pAXOl，使hasA置于木糖誘導型啟動子Pxyl控制下整合于枯草芽孢桿菌基因組上表達；將 編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD與P43RBS序列融合，UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化 酶的基因glmU與P43RBS序列融合，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB與啟動子Pveg和 P43RBS融合，變位酶的基因glmM與P43RBS融合，氨基轉移酶的基因glmS與P43RBS序列融 合，將5個片段串聯重組至表達載體pP43NMK，轉化枯草芽孢桿菌得到含透明質酸合成途徑 的重組菌株；
[0018] (2)偶聯表達透明質酸酶：將透明質酸酶基因融合啟動子P_A、RBS和信號肽后整 合到步驟（1)所得重組枯草芽孢桿菌的基因組中，獲得偶聯表達透明質酸酶的重組枯草芽 孢桿菌。
[0019] 所述步驟（2)中的透明質酸酶的表達量，可采用不同翻譯強度RBS突變體來精細 控制，RBS啟動翻譯的強度越大，重組枯草芽孢桿菌產的HA的分子量就越小。
[0020] 在本發明的一種實施方式中，步驟（1)選定枯草芽孢桿菌基因